周方方， 付路平， 李永紅,2

(1.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 鄭州 450001;2.鄭州大學(xué) 新藥研究開發(fā)中心 鄭州 450001)

利斯的明中間體立體拆分菌株的篩選與鑒定

周方方1， 付路平1， 李永紅1,2

(1.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 鄭州 450001;2.鄭州大學(xué) 新藥研究開發(fā)中心 鄭州 450001)

自土壤中篩選出44株能夠拆分利斯的明的菌株.通過薄層色譜、高效液相及核磁分析發(fā)現(xiàn)一株菌種編號為Rnn02的菌株對利斯的明外消旋物的拆分效率最高.通過菌株形態(tài)學(xué)及18S rRNA基因序列分析確證該菌株為季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii).

利斯的明； 拆分； 鑒定

0 引言

利斯的明(Rivastigmine)，又稱卡巴拉汀，化學(xué)名(S)-N-乙基-[3-(1-二甲基氨基)乙基]-N-甲基-氨基甲酸苯酯，結(jié)構(gòu)式如圖1，是氨基甲酸酯類腦選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑，能夠選擇性地作用于大腦區(qū)域內(nèi)并且有長持續(xù)時間的活性[1-2].

利斯的明的酒石酸鹽的商標(biāo)名稱為艾斯能(Exelon).它對輕中度阿爾茨海默癥(AD)有溫和節(jié)制效果，對震顫麻痹[3]和路易小體[4]引起的癡呆癥以及血管性癡呆[5]也同樣具有良好的治療效果.臨床研究證明其耐受性和安全性較好，無肝臟毒性，是唯一不經(jīng)過P450代謝的藥物，其療效較其他膽堿酯酶抑制劑更好.

近幾年隨著酶固定化、生物反應(yīng)器等多種生物技術(shù)的飛速發(fā)展，生物拆分中的酶法具有副反應(yīng)少、立體選擇性強、拆分效率高、成本低、周期短、不受季節(jié)影響、能重復(fù)利用、可大規(guī)模生產(chǎn)并且環(huán)保等優(yōu)點，因此在手性化合物制備中逐漸引起大家的極大興趣.在今后，化學(xué)法與酶法的結(jié)合將是制備手性化合物的新切入點.文獻(xiàn)[6]在2009年報道了化學(xué)-酶法制備S型利斯的明的方法，反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率(77%)及光學(xué)活性較高(ee值97%)，但動態(tài)動力學(xué)拆分(DKR)所用金屬釕配合物及脂肪Novozym-435價格昂貴.因此，篩選立體選擇性強、催化效率高且穩(wěn)定性好的微生物酶，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的制備S型利斯的明的新工藝，具有重大意義.本文篩選出一株可以高效拆分利斯的明中間體的菌株，意義重大，有應(yīng)用于工業(yè)化的潛質(zhì).生物拆分所用的酶大部分由微生物產(chǎn)生，因此本研究旨在篩選合適的微生物，為利用化學(xué)-酶法制備利斯的明的研究做準(zhǔn)備.

1 材料與方法

1.1 儀器

核磁共振(瑞典Bruker DPX-400型超導(dǎo)核磁共振儀)，高效液相色譜(Waters 1525).HYG-Ⅱa 型自動搖瓶柜(上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司)，R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，Waters 1525高效液相色譜儀，色譜柱為Lux 3u Cellulose-1柱(4.6 mm×250 mm×3 μm，美國Phenomenex公司)， DP-88型SensoQuest LabCycler系列PCR儀.

1.2 材料與試劑

底物(化學(xué)物2)自制，利用HPLC圖譜通過歸一化法計算純度為98.3%，瓊脂粉、蛋白胨、酵母膏、丙酮、葡萄糖、乙酸乙酯及其他試劑均為分析純.

1.3 菌株的篩選和鑒定

1.3.1 樣品來源 從鄭州、南陽、南寧、柳州、濟南、北京6個地區(qū)采集到富含油脂的6份土樣.

1.3.2 培養(yǎng)基 斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸膏2，蛋白胨5，瓊脂23，葡萄糖10， pH自然.

富集培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸膏2，蛋白胨5，葡萄糖10，pH自然.

平板分離培養(yǎng)基(g/L)：以底物為唯一碳源，NH4NO31.0，底物10，NaCl 10.0，K2HPO41.5， KH2PO40.5，MgSO40.2，瓊脂23， pH自然.

羅丹明B選擇培養(yǎng)基(g/L)：橄欖油15，酵母膏20，蛋白胨50，瓊脂粉23，羅丹明B 2， pH自然.

斜面保藏LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏 5，蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂20，pH 7.5.

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L)配方：玉米漿5，蛋白胨10，蔗糖20， pH 8.0(Tris-HCl緩沖體系).

配制方法見文獻(xiàn)[7-13].

1.3.3 菌株的篩選 1) 稱取1.5 g土樣，溶于無菌水中，振蕩器震蕩10 min后，將上層清液倒入富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h.

2) 將1)中培養(yǎng)液用無菌水稀釋后，涂布至以底物為唯一碳源的選擇性平板上，于28 ℃培養(yǎng).

3) 將2)中長出的菌落挑出，分離純化至單菌落.

4) 將3)中純化后的菌種用羅丹明B指示平板，28 ℃培養(yǎng)48 h后，進行復(fù)篩.在365 nm紫外燈下觀察，產(chǎn)脂肪酶的菌株周圍有紅色的熒光環(huán).

5) 將4)中篩選出的菌種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，加入0.1% 底物進行拆分試驗，用TLC法檢測有無產(chǎn)物生成，保留有產(chǎn)物點的菌株.

6) 將5)中篩選出的菌種經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，加入0.1%底物進行拆分試驗，用乙酸乙酯萃取3次后，蒸干溶劑，用HPLC法檢測產(chǎn)物的ee值，選出ee值最高的菌種保留.

7) 將拆分產(chǎn)物經(jīng)柱色譜提純后用核磁共振儀(NMR)測定其結(jié)構(gòu).

根據(jù)TLC、HPLC和NMR結(jié)果確定目的菌株.

1.3.4 轉(zhuǎn)化條件 以10% 的接種量將培養(yǎng)48 h后的種子液轉(zhuǎn)接入含110 mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)16 h.發(fā)酵液以5 000 r/min 離心10 min，得到的濕菌體用緩沖溶液洗滌后懸浮于相同的緩沖液中，加入底物后在相同條件下進行轉(zhuǎn)化16 h.

利斯的明和中間體的拆分是由微生物菌體中的脂肪酶催化的，酶催化受各種因素調(diào)控.因此脂肪酶活性并不能更好地表示優(yōu)化效果，故用轉(zhuǎn)化率來表示轉(zhuǎn)化效果.用轉(zhuǎn)化16 h后目的產(chǎn)物量占加入底物量的百分比來表示轉(zhuǎn)化率.

1.3.5 菌株的鑒定 菌落形態(tài)特征按常規(guī)方法進行[14].在初步判斷菌種類型的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)鑒定方法以其18S rRNA進行基因序列分析，PCR擴增并測序，引物設(shè)計及反應(yīng)參數(shù)參照文獻(xiàn)[15].在NCBI數(shù)據(jù)庫中將測序結(jié)果Blast比對分析，進行最后鑒定.

1.4 菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析和計算方法

1.4.1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取 用相同體積乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液3次，得到乙酸乙酯相，用飽和的NaHCO3洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，最后再用蒸餾水洗1次.將得到的飽和NaHCO3相和飽和NaCl相用乙酸乙酯反萃取一次.合并所有有機相，無水Na2SO4干燥后用TLC和HPLC法測定.

1.4.2 TLC分析方法 將樣品點于硅膠GF254薄層板上，氯仿∶甲醇(10∶1，V/V)為展開劑進行檢測.

1.4.3 HPLC分析方法及ee值計算方法 固定相為手性Lux 3u cellulose-1柱，正己烷-異丙醇(92.5∶7.5)為流動相，檢測波長217 nm，柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min進行HPLC分析.據(jù)樣品在HPLC圖譜中的峰面積計算ee值.公式為：

eeR(%)=(R異構(gòu)體峰面積-S異構(gòu)體峰面積)/(S異構(gòu)體峰面積+R異構(gòu)體峰面積)×100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

經(jīng)過初篩得到能夠在以底物為唯一碳源的平板上生長的44株菌株，用LB斜面培養(yǎng)基保藏菌種，用于后續(xù)研究.

采用羅丹明B平板篩選法[16-17]對初篩出的44種菌株進行復(fù)篩，由于脂肪酶或酯酶可將平板上的油脂降解產(chǎn)生脂肪酸，脂肪酸可以與羅丹明B陽離子發(fā)生反應(yīng)，形成的物質(zhì)在紫外燈下顯現(xiàn)橙黃色熒光現(xiàn)象(如圖2).因此若菌株產(chǎn)生脂肪酶或酯酶，其周圍會出現(xiàn)熒光圈，羅丹明B平板篩選法篩選出19株有熒光的菌株.

分別將羅丹明B平板篩選法篩選出有熒光的19種菌株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化底物，用乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液，然后用薄層色譜法進行產(chǎn)物監(jiān)測，從中得到14株有產(chǎn)物點出現(xiàn)的菌株.分別將薄層色譜法篩選出的14種菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化底物，用HPLC法進一步測定，結(jié)果如表1所示.

由表1所示，編號Rnn02的菌株ee值和轉(zhuǎn)化率均較好，菌株Gxnno2B、Gxnno1A和zz03雖然轉(zhuǎn)化率較高，但是ee值過低，菌株zz01C的ee值雖然較高，但是轉(zhuǎn)化率較低.綜合考慮Rnn02菌株對外消旋底物的拆分效果最好，可能是符合要求的菌株.

2.2 高效拆分菌株的確定

2.2.1 HPLC法驗證 利用Rnn02菌株催化拆分的反應(yīng)體系(包括反應(yīng)底物和產(chǎn)物)和利用文獻(xiàn)中所用的Novozym453酶催化拆分的反應(yīng)體系的HPLC色譜保留時間進行比較(見表2，圖3和圖4).

從圖4及表2可以看出新出現(xiàn)化合物(R)-1和化合物(R)-2的峰面積小于(S)-2的峰面積，說明化合物(R)-2部分轉(zhuǎn)變成(R)-1，而(S)-2的峰面積基本不變，且沒有(S)-1的峰出現(xiàn)，說明得到的拆分產(chǎn)物是化合物(R)-1.HPLC譜圖前面基線不太平穩(wěn)，這是由于所用的正己烷和異丙醇均為分析純，保留時間小于8 min的峰是溶劑中含的雜質(zhì).對化合物1、化合物2及消旋化合物1轉(zhuǎn)化12 h后產(chǎn)物的HPLC譜圖結(jié)果分析得出，化合物1的R-異構(gòu)體和S-異構(gòu)體保留時間分別為(17.045±0.3) min和(14.618±0.2) min，化合物2的R-異構(gòu)體和S-異構(gòu)體保留時間分別為(10.334±0.3) min和(12.037±0.3)min.

2.2.2 核磁氫譜對比分析 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的1HNMR譜圖解析顯示：1HNMR(400MHZCDCL3),d7.31(t,1H,Ar-H),d7.17(d,1H,Ar-H),d7.12(s,1H,Ar-H),d7.00(d,1H,Ar-H),d4.86(q,1H,PHCHCH3),d3.42(dq,2H,NCH2CH3),d3.14(d,3H,NCH3),d2.2(s,1H,OH),d1.44(d,3H,PHCHCH3),d1.22(dq,3H,NCH3).

為進一步確定進行拆分的化合物的種類，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的1HNMR譜圖與化合物(R)-2的1HNMR譜圖進行比較分析(見圖5)，發(fā)現(xiàn)兩張譜圖完全一樣，因此進一步確定轉(zhuǎn)化拆分的是(R)-2.

通過對拆分反應(yīng)底物和產(chǎn)物的HPLC保留時間及核磁氫譜的研究，從而確定編號Rnn02的菌株是符合本研究要求的菌株.

2.3 菌株的鑒定分析

菌株在不同培養(yǎng)基上具體形態(tài)不同，通過觀察菌落形態(tài)、菌體形狀和大小、有無孢子和菌絲生成以及繁殖方式對菌種進行初步鑒定.Rnn02菌株在不同培養(yǎng)基上的共同特征如下：呈乳白色，表面褶皺，有光澤，濕潤，無孢子和假菌絲，呈黏稠狀，無特殊氣味，細(xì)胞有橢圓形(4 μm×4.5 μm～5.5 μm×6 μm)和圓形(4.5 μm)兩種類型.生長方式多數(shù)為裂殖，少部分為芽殖.根據(jù)編號Rnn02的菌株的細(xì)胞形態(tài)和菌落形態(tài)的結(jié)果及與相關(guān)資料對比，初步判斷該菌為酵母菌.

最后用分子生物學(xué)手段做最終鑒定.以酵母菌保守序列18S rRNA進行基因序列分析，PCR擴增并測序.在NCBI數(shù)據(jù)庫將測序結(jié)果用Blast比對同源分析.鑒定出該菌為季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii).

3 結(jié)論

經(jīng)過初篩、復(fù)篩，通過TLC、HPLC、NMR分析發(fā)現(xiàn)一株編號為Rnn02的菌株對利斯的明中間體外消旋物的拆分效率最高.經(jīng)菌落形態(tài)分析及分子生物學(xué)手段確定為季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)，并已于2012年12月7日經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No.6783.該菌株可對手性中心含有?；蛄u基的化合物進行對映體拆分，拆分所得產(chǎn)物單一，拆分效率高，價格低廉，工藝簡單，有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的潛力.

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(責(zé)任編輯：王浩毅)

Screening and Identification of Strains for Rivastigmine Intermediates Stereo-resolution

ZHOU Fangfang1, FU Luping1， LI Yonghong1,2

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.NewDrugResearch&DevelopmentCenter，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001,China)

The screening of 44 strains from soil that could resolute Rivastigmine was conducted. By using TLC, HPLC and NMR analysis methods, a strain numbered Rnn02 was identified, which had the highest resolution efficiency for racemic Rvastigmine. It was identified to beMeyerozymaguilliermondiiby morphology and it’s 18S rDNA analysis.

Rivastigmine; resolutiont; identification

2015-07-04

國家自然科學(xué)基金資助項目，編號21402178.

周方方(1990—)，女，河南許昌人，碩士研究生，主要從事微生物藥物研究；通訊作者：李永紅(1970—)，女，河南安陽人，博士，副教授，主要從事微生物藥物研究，E-mail：lyh224@163.com.

周方方，付路平，李永紅.利斯的明中間體立體拆分菌株的篩選與鑒定[J].鄭州大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版，2015,47(4)：71-75.

TQ460.1

A

1671-6841(2015)04-0071-05

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.014