李春陽 馬 旭 綜述，楊大平 審校

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院整形美容科黑龍江哈爾濱150086）

·綜述·

干細(xì)胞在骨質(zhì)疏松治療中的應(yīng)用進展

Application of stem cells in the treatment of osteoporosis

李春陽 馬 旭 綜述，楊大平 審校

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院整形美容科黑龍江哈爾濱150086）

骨質(zhì)疏松癥是常見的骨代謝疾病之一，是骨組織的數(shù)量和質(zhì)量的異常，以骨密度的減少及骨微結(jié)構(gòu)的退變?yōu)橹饕卣鳎瑢?dǎo)致骨骼脆性增加及易發(fā)生骨折的全身性疾?。?］。雖然詳細(xì)的病理機制仍不清楚，但是由于激素分泌急劇減少而造成的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的不均衡在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生中起著重要的作用［2］。應(yīng)用雌激素治療骨質(zhì)疏松，會產(chǎn)生許多副作用。由于在骨質(zhì)疏松性人群中，骨密度降低和骨折愈合能力的減弱可能是與間充質(zhì)干細(xì)胞的缺失導(dǎo)致的成骨細(xì)胞分化和增殖能力減弱有關(guān)［3］。因此，干細(xì)胞移植可以作為骨質(zhì)疏松癥的一種治療手段，干細(xì)胞是一類具有多潛能特性的細(xì)胞，而且其在特定的誘導(dǎo)條件下能向多種細(xì)胞系分化，來源豐富，獲取途徑并不十分困難。干細(xì)胞移植能從根本上改善病情，直接或間接增加成骨細(xì)胞的數(shù)量，目前常用于治療骨質(zhì)疏松的干細(xì)胞有脂源性干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等，現(xiàn)將最新進展綜述如下。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種分布于骨髓中數(shù)量較少的多能干細(xì)胞，具有極強的自我更新能力，在特定的誘導(dǎo)條件下能向多種細(xì)胞系分化，如：成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于分離、增殖，具有多向分化潛能，使其成為免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和細(xì)胞治療的首選應(yīng)用材料［4］。Wang等［2］分離培養(yǎng)切除卵巢骨質(zhì)疏松模型（OVX）新西蘭白兔的BMSCs，并在體外將其與藻酸鈣凝膠混合，并注入OVX新西蘭白兔股骨的遠(yuǎn)端，移植8周后進行大體形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和骨組織力學(xué)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單純注射藻酸鈣凝膠相比，MSCs-藻酸鈣凝膠實驗組在注射處理的局部組織處具有更多的骨組織，骨小梁密度增加，骨的最大負(fù)荷和拉力強度提高，這就證實BMSC對局部骨質(zhì)疏松骨具有強化作用。Ocarino等［5］將健康大鼠體內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注入卵巢切除引導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的大鼠的股骨，2個月后通過組織形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)大鼠股骨的骨量明顯得到改善，結(jié)果表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對于骨質(zhì)疏松癥的治愈非常重要。

單純BMSC移植盡管在短時間內(nèi)能夠有效改善骨質(zhì)疏松狀況，但是由于移植BMSCs數(shù)量、隨傳代衰老和自身免疫反應(yīng)等諸多問題，實際治療效果仍有爭議。因此，提高BMSCs體外增殖能力，增加移植數(shù)量，減緩自然衰老，增強成骨分化能力，有效提高BMSCs移植后效果已成為近年研究熱點。現(xiàn)在，學(xué)者們多將與成骨相關(guān)的生長因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）通過基因轉(zhuǎn)染方式轉(zhuǎn)入BMSC內(nèi)，然后再進行移植，取得了不錯的效果。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β），能有效刺激誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，促進成骨細(xì)胞成熟，提高成骨細(xì)胞活性，促進骨形成和骨生長，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于骨缺損和骨不連的治療［6］。Zhang等［7］將經(jīng)BMP4轉(zhuǎn)染的BMSCs注入小鼠髓內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植MSCs在實驗小鼠體內(nèi)存在超過14d。通過外周定量CT（pQCT）檢測顯示，BMP4-MSCs移植14d后，小鼠松質(zhì)骨密度增加20.5%，全骨密度增加6.5%；移植56d后，全骨密度增加10.4%。國內(nèi)學(xué)者唐尤超［8］等將hBMP2基因修飾的BMSCs復(fù)合多孔的珊瑚羥基磷灰石支架植入OVX SD大鼠下頜支圓形骨缺損部位，4周、8周后進行組織學(xué)、放射學(xué)、骨礦物質(zhì)密度檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組4周后在支架邊緣有新骨形成，8周后可見相互連接的成熟骨形成，新生骨量明顯提高。對照組中，8周后在骨缺損的邊緣只能看到很少的新骨形成和一些脂肪組織。這可能是骨質(zhì)疏松性大鼠雌激素減少的結(jié)果。BMSC具有多向分化的潛力，可以分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。因此，在骨質(zhì)疏松性的骨髓腔中快速骨質(zhì)流失和脂肪形成增加有關(guān)。

2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞

與骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞相比，脂肪干細(xì)胞有以下優(yōu)點：第一，脂肪干細(xì)胞通過吸脂和過濾的方法容易大量獲??；第二，脂肪干細(xì)胞具有多向分化潛能：可以成骨分化、成脂分化、成肌分化，也可以分化為軟骨細(xì)胞，并且具有與骨髓來源干細(xì)胞相似的功能［9］；第三，應(yīng)用脂肪干細(xì)胞進行研究和臨床應(yīng)用幾乎不存在倫理問題。因此，這些本身的特點和優(yōu)勢使脂肪干細(xì)胞成為組織工程和細(xì)胞療法的理想干細(xì)胞來源。

用脂肪干細(xì)胞來治療骨缺損已進行了大量的研究。皮下植入脂肪干細(xì)胞符合羥基磷灰石/磷酸鹽支架，能夠形成類似骨組織結(jié)構(gòu)［10］。此外，脂肪干細(xì)胞種植于膠原支架可以分化為成骨樣細(xì)胞并能產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)［11］。這些研究證實脂肪干細(xì)胞可以作為修復(fù)骨缺損的細(xì)胞來源。但是，脂肪干細(xì)胞在組織工程的應(yīng)用可能主要取決于脂肪干細(xì)胞的增殖和分化能力。這些因素可能會受到供體年齡的影響。在動物和人的模型中，許多研究證實骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量變化、擴增時間和分化能力受供體年齡的影響［12］。因此，在用脂肪干細(xì)胞來治療骨質(zhì)疏松時，其成骨能力隨年齡的變化也是非常重要的［13］。

Liu等［14］比較年齡對快速老化模型小鼠SAMP8脂肪干細(xì)胞生長動力學(xué)和分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在增殖率和成骨分化方面老年組均顯著降低。然后，分別將幼年和老年的脂肪干細(xì)胞移植到骨質(zhì)疏松鼠的骨髓中來評價其骨形成能力。移植后4個月結(jié)果證實能夠有效提高右側(cè)/左側(cè)膝關(guān)節(jié)、股骨和脊柱的骨礦物質(zhì)密度，其中接受幼年脂肪干細(xì)胞移植的鼠的骨形成能力明顯高于老年脂肪干細(xì)胞移植的鼠。因此，年齡也可以妨礙脂肪干細(xì)胞改善骨質(zhì)疏松，主要是通過減少成骨信號。陶暉等［15］通過尾靜脈給予治療組大鼠植入脂肪源干細(xì)胞來觀察ADSCs移植對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松（GIOP）大鼠骨密度和骨組織微結(jié)構(gòu)的影響，4周后取材發(fā)現(xiàn)治療組大鼠的腰椎和股骨骨密度均有顯著升高（P＜0.05），而骨組織形態(tài)學(xué)顯示，骨小梁的數(shù)目增多，且變厚變粗，骨小梁間出現(xiàn)連接，陷窩減少，這說明脂肪源干細(xì)胞能明顯改善骨質(zhì)疏松。Cho等將人體脂肪源干細(xì)胞移植治療卵巢切除誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失的裸鼠，相比僅僅通過雌激素及磷酸鹽治療的裸鼠，干細(xì)胞移植治療組血清骨鈣素升高（P＜0.05），這表明脂肪源干細(xì)胞能防止骨質(zhì)流失。Li等［16］則通過用Lentivirus載體，將抑制鋅指蛋白467的脂肪干細(xì)胞通過尾靜脈注入OVX的ddY小鼠后，發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白467被抑制組別相對于僅僅脂肪源干細(xì)胞直接移植的組，在μCT影像上顯示出其骨量丟失明顯受到限制（P＜0.01）。這一結(jié)果表明脂肪干細(xì)胞中鋅指蛋白467相關(guān)的RNA抑制脂肪的形成，而會促進其向成骨細(xì)胞分化。鋅指蛋白467是涉及脂肪干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞分化的蛋白質(zhì)。脂肪干細(xì)胞中的鋅指蛋467RNA能夠修復(fù)人工卵巢切除后導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥小鼠模型的骨的功能和結(jié)構(gòu)。因此，鋅指蛋白467在脂肪干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化上起著重要的作用。Lee等［17］將人脂肪干細(xì)胞通過尾靜脈注射移植到去勢化ddY小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)ADSC能夠使骨組織內(nèi)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量增加從而預(yù)防骨質(zhì)丟失。研究還發(fā)現(xiàn)：在條件適宜的情況下，人脂肪干細(xì)胞在體外可以通過Smad和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）/JNK（c-jun NH2-terminal kinase）促進成骨細(xì)胞的增殖和分化，也能通過ERK/JNK/p38的活化來促進破骨細(xì)胞的成活和分化?？偟膩碚f，人脂肪干細(xì)胞旁分泌的因子能夠促進骨的修復(fù)，并且脂肪干細(xì)胞是骨質(zhì)疏松治療方面一非常重要的方法。

3 影響干細(xì)胞成骨分化的生長因子和藥物

脂肪干細(xì)胞對受損組織修復(fù)和再生的主要機制包括旁分泌的細(xì)胞因子和生長因子及直接向特定細(xì)胞的分化［18］。某些與成骨相關(guān)的生長因子及細(xì)胞因子甚至某些促進成骨的藥物對干細(xì)胞在骨質(zhì)疏松的治療中也會發(fā)揮重要作用。骨誘導(dǎo)生長因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）已被廣泛應(yīng)用于骨組織工程和臨床。BMPs能夠誘導(dǎo)連續(xù)的級聯(lián)事件促進軟骨形成、骨形成和血管形成，并且能夠控制細(xì)胞外基質(zhì)的合成。BMP-2和BMP-7是應(yīng)用最為廣泛的BMPs，其價格昂貴。盡管BMPs對促進骨形成具有優(yōu)越的性能，但是，在某些情況下也會出現(xiàn)負(fù)作用。在骨組織工程研究方面，研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多方法通過延緩其釋放來減少BMPs的使用量和提高BMPs的骨誘導(dǎo)效果。但是，我們應(yīng)用最簡單的方法來尋找一種有效、價格低廉的替代物來代替昂貴的BMPs。這也就更加證實了需要開發(fā)一種便宜的骨誘導(dǎo)藥物的重要性［19］。

越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷具有骨誘導(dǎo)性，因為它能促進骨的形成、軟骨形成和血管形成。淫羊藿苷具有多種功能，它的骨誘導(dǎo)功能尤為顯著。對骨修復(fù)來說，將淫羊藿苷包被于磷酸鈣生物材料上是局部應(yīng)用淫羊藿苷的一種好方法，并且磷酸鈣支架具有骨傳導(dǎo)性。Wu等［20］研究證實早期局部應(yīng)用淫羊藿苷對促進骨形成具有良好效果。一些研究試圖闡明淫羊藿苷促進成骨的分子機制?？傊蜣杰湛梢酝ㄟ^誘導(dǎo)BMP-2和NO的合成、激活BMP-2/Smad4信號轉(zhuǎn)錄途徑，上調(diào)BMP-2、BMP4、Smad4、Cbfα1/Runx2、OPG、RANKL和OPG/RANKL的比率來促進成骨［21］。淫羊藿苷可以通過抑制p38和JNK通路的激活來抑制脂多糖介導(dǎo)的骨吸收，這反過來也促進了骨的形成［22］。但是，淫羊藿苷的骨誘導(dǎo)機制和臨床應(yīng)用需要進一步研究。

與BMP相比，淫羊藿苷價格低并且副作用小［23］。淫羊藿苷價格非常低、數(shù)量多又具有良好的骨再生功能，這些使它能夠非常適合臨床應(yīng)用。因此，它可以成為BMPs的替代物或輔助物。然而，局部應(yīng)用淫羊藿苷的效果仍需繼續(xù)研究，需要找到一合適的載體來進行最有效的轉(zhuǎn)運。按照目前的研究，我們認(rèn)為淫羊藿苷是一良好的骨誘導(dǎo)劑。

4 展望

干細(xì)胞移植是一項新型的治療手段，具有獨特的優(yōu)勢。干細(xì)胞能夠成骨分化，且來源豐富，獲取方便，因此研究者希望將干細(xì)胞移植技術(shù)引入到骨質(zhì)疏松癥治療中。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，目前干細(xì)胞基礎(chǔ)研究已取得了一定的進展。干細(xì)胞移植主要有直接移植、基因修飾后移植以及體外誘導(dǎo)分化等。無論哪種干細(xì)胞移植途徑，其治療骨質(zhì)疏松癥的機制均是直接或間接促進成骨分化，增加成骨細(xì)胞數(shù)量，抑制破骨分化，改善骨代謝，從根本上治療骨質(zhì)疏松癥。

為提高和保證干細(xì)胞能夠分化為產(chǎn)生有功能的骨基質(zhì)細(xì)胞，就需要通過蛋白直接轉(zhuǎn)運或病毒基因轉(zhuǎn)染的方法將生長因子和細(xì)胞因子植入。生長因子數(shù)量多，主要包括骨形成蛋白（BMPs）、血漿源性生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）和胰島素樣生長因子（IGFs），現(xiàn)在已對這些因子進行了大量研究，并且這些生長因子對種子細(xì)胞的增殖和分化具有明顯效果。但是，這些生長因子價格高、降解快，限制了其廣泛應(yīng)用，尤其是在臨床的應(yīng)用。BMP家族蛋白是促進成骨所有因子中作用效果最強的。但是它們生物活性不穩(wěn)定，BMP-2在體外的半衰期短，只有7～16min，價格昂貴。因此，迫切需要開發(fā)一些比生長因子更高效、價格更低的成骨產(chǎn)品或藥物來代替生長因子。淫羊藿是治療骨質(zhì)疏松最常用的中藥之一。淫羊藿苷是其發(fā)揮作用的主要成分，價格非常低、數(shù)量多又具有良好的骨再生功能，這些使它能夠應(yīng)用于臨床。它可以成為BMPs的替代物或輔助物。但是，局部應(yīng)用淫羊藿苷的效果仍需繼續(xù)研究，需要找到一合適的載體來進行最有效的轉(zhuǎn)運。并且淫羊藿苷誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化以及促進骨質(zhì)疏松癥骨修復(fù)的具體分子機制還需要進一步研究。

［1］Gurban CV，Mederle O.The OPG/RANKL system and zinc ions are promoters of bone remodeling by osteoblast proliferation in postmenopausal osteoporosis［J］.Rom J Morphol Embryol，2011，52（3 Suppl）:1113-1119.

［2］Das De，Wang Z，Goh J，et al.Efficacy of bone marrowderived stem cells in strengthening osteoporotic bone in a rabbit model［J］.Tissue Eng，2006，12（7）:1753-1761.

［3］Verma S，Rajaratnam JH，Denton J，et al.Adipocytic proportion of bone marrow is inversely related to bone formation in osteoporosis［J］.J Clin Pathol，2002，55（9）:693-698.

［4］Bernardo ME，Avanzini MA，Perotti C，et al.Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches:further insights in the search for a fetal calf serum substitute［J］.J Cell Physiol，2007，211（1）:121-130.

［5］Ocarino Nde M，Boeloni JN，Jorgetti V，et al.Intra-bone marrow injection of mesenchymal stem cells improves the femur bone mass of osteoporotic female rats［J］.Connect Tissue Res，2010，51（6）:426-433.

［6］Jakob F，Ebert R，Ignatius A，et al.Bone tissue engineering in osteoporosis［J］.Maturitas，2013，75（2）:118-124.

［7］Zhang XS，Linkhart TA，Chen ST，et al.Local ex vivo gene therapy with bone marrow stromal cells expressing humanBMP4 promotes endosteal bone formation in mice［J］.J Gene Med，2004，6（1）:4-15.

［8］Tang Y，Tang W，Lin Y，et al.Combination of bone tissue engineering and BMP-2 gene transfection promotes bone healing in osteoporotic rats［J］.Cell Biol Int，2008，32（9）: 1150-1157.

［9］RiderDA，DombrowskiC，Sawyer AA，etal.Autocrine fibroblast growth factor 2 increases the multipotentiality of human adipose-derived mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2008，26（6）:1598-1608.

［10］Hicok KC，Du Laney TV，Zhou YS，et al.Human adiposederived adult stem cells produce osteoid in vivo［J］.Tissue Eng，2004，10（3-4）:371-380.

［11］Kakudo N，Shimotsuma A，Miyake S，et al.Omb collagen scaffold［J］.J Biomed Mater ResA，2008，84（1）:191-197.

［12］Ra JC1，Kang SK，Shin IS，et al.Stem cell treatment for patients with autoimmune disease by systemic infusion of culture-expanded autologous adipose tissue derived mesenchymal stem cells［J］.J Transl Med，2011，9:181.

［13］Wagner W，Horn P，Castoldi M，et al.Replicative senescence of mesenchymal stem cells:a continuous and organized process［J］.PLoS One，2008，3（5）:e2213.

［14］Liu HY，Chiou JF，Wu AT，et al.The effect of diminished osteogenic signals on reduced osteoporosis recovery in aged mice and the potential therapeutic use of adipose-derived stem cells［J］.Biomaterials，2012，33（26）:6105-6112.

［15］Tao H，Yu MC，Yang HY，et al.Effect of allogenic adiposederived stem cell transplantation on bone mass in rats with glucocorticoid-induced osteoporosis［J］.Nanfang Yike Daxue Xuebao，2011，31（5）:817-821.

［16］You L，Pan L，Chen L，et al.Suppression of zinc finger protein 467 alleviates osteoporosis through promoting differentiation of adipose derived stem cells to osteoblasts［J］.J Transl Med，2012，10:11.

［17］Lee K，Kim H，Kim JM，et al.Systemic transplantation of human adipose-derived stem cells stimulates bone repair by promoting osteoblast and osteoclast function［J］.J Cell Mol Med，2011，15（10）:2082-2094.

［18］Konno M，Hamabe A，Hasegawa S，et al.Adipose-derived mesenchymal stem cells and regenerative medicine［J］.Dev Growth Differ，2013，55（3）:309-318.

［19］Zhang X，Liu T，Huang Y，et al.Icariin:Does It Have An Osteoinductive Potential for Bone Tissue Engineering［J］？Phytother Res，2014，28（4）:498-509.

［20］Wu JF，Dong JC，Xu CQ.Effects of icariin on inflammation model stimulated by lipopolysaccharide in vitro and in vivo.［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2009，29（4）:330-334.

［21］Liang W，Lin M，Li X，et al.Icariin promotes bone formation via the BMP-2/Smad4 signal transduction pathway in the hFOB 1.19 human osteoblastic cell line［J］.Int J Mol Med，2012，30（4）:889-895.

［22］Zhang L，Zhang X，Li KF，et al.Icariin promotes extracellular matrix synthesis and gene expression of chondrocytes in vitro［J］.Phytother Res，2012，26（9）:1385-1392.

［23］Fan JJ，Cao LG，Wu T，et al.The dose-effect of icariin on the proliferation and osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells［J］.Molecules，2011，16（12）:10123-10133.

2015-02-24

2015-03-23

編輯/李陽利

楊大平，教授、博士生導(dǎo)師；研究方向：組織工程、皮瓣移植和干細(xì)胞的應(yīng)用；E-mail：dapingyang@hotmail.com