■柳 茜 楊文嬌 吳 振 梁萌青 鄭珂珂 牟玉超

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2.唐山拓普生物科技有限公司，河北唐山 063021）

酵母水解物（Autolzed Yeast），是采用新鮮啤酒酵母為原料，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，經(jīng)除雜、自溶、酶解、噴霧干燥等工藝精制而成。酵母水解物富含核酸、核苷酸、小肽、細(xì)胞壁多糖（免疫多糖）、游離氨基酸及豐富的B族維生素[1-2]。氨基酸和小肽易于消化吸收，在動(dòng)物蛋白質(zhì)營養(yǎng)中優(yōu)勢(shì)顯著，因此酵母水解物是一種非常理想的功能性蛋白源，可以作為飼料中優(yōu)質(zhì)蛋白原料（如魚粉）的替代物[3-4]。此外，小肽可以加速蛋白質(zhì)合成，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力[5]。核苷酸及B族維生素具有提高機(jī)體免疫力和抗氧化能力的作用[6-9]。酵母細(xì)胞壁多糖因其特殊構(gòu)型，尤其啤酒酵母由于多代次的特殊優(yōu)勢(shì)，更厚的胞壁，提供更豐富的免疫多糖，易被免疫系統(tǒng)接受，激活機(jī)體巨噬細(xì)胞，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，改善其健康狀況。目前，酵母或酵母提取物等作為蛋白質(zhì)來源或飼料添加劑在淡水魚（鯉魚、豐鯉、淡水白鯧、鳊、草魚、異育銀鯽等）中的應(yīng)用已有研究[10]，但是酵母水解物作為蛋白質(zhì)來源或飼料添加劑在海水魚中研究較少。

大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)是一種底棲的肉食性海水魚類，是我國北方重要的海水養(yǎng)殖品種之一。目前，大菱鲆的基本營養(yǎng)需求已經(jīng)明確，因此如何通過營養(yǎng)途徑進(jìn)行健康養(yǎng)殖逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究利用以魚粉、豆粕、玉米蛋白粉、谷朊粉和酵母粉為復(fù)合蛋白源配制的精飼料，探究酵母水解物對(duì)大菱鲆非免疫性免疫力及抗應(yīng)激能力的影響，為酵母水解物在大菱鲆人工配合飼料中的應(yīng)用積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

大菱鲆幼魚購自青島市通用水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。試驗(yàn)開始前，停食24 h，隨機(jī)挑選大小均勻、體格健壯且體表無病，平均體重(6.17±0.06)g的大菱鲆幼魚360尾，隨機(jī)平均分配到4×3個(gè)養(yǎng)殖桶（40 cm×50 cm×100 cm）中。

1.2 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)飼料原料購自青島七好生物科技有限公司。飼料原料粉碎后，過80目篩網(wǎng)備用。以30%魚粉組為對(duì)照組，以酵母水解物及酵母粉及植物蛋白分別替代10%、15%、20%魚粉，配制成等氮、等能的4種試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)成分分析

1.3 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)采用流水培育，養(yǎng)殖水體水溫(16±1)℃，pH值7.6～8.2，連續(xù)充氧，溶氧含量保持在6 mg/l以上。每天人工表觀飽食投喂兩次（6:30和16:30），投喂后0.5 h換水以排除殘餌，試驗(yàn)為期8周。

1.4 樣品采集與分析

試驗(yàn)結(jié)束后，饑餓24 h，稱每桶魚總重。然后每桶隨機(jī)取6尾魚，用1.0 ml一次性無菌注射器(含肝素鈉)尾靜脈采血，置于4℃冰箱過夜，在2 500 r/min離心10 min，分離血清，-20℃冰箱保存，待測(cè)；取肝臟，-20℃冷凍保存，待測(cè)；每桶隨機(jī)撈取3尾魚，用于常規(guī)分析。

血清溶菌酶（LZM）、肝臟酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、一氧化氮合酶（NOS）、肝臟總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及肝臟丙二醛（MDA）含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.5 抗應(yīng)激試驗(yàn)

1.5.1 耐低氧能力測(cè)定

參照池田(1976)的方法進(jìn)行，即飼喂結(jié)束24 h后，從各試驗(yàn)組分別隨機(jī)撈取10尾供試魚，放入盛有2.0 L養(yǎng)殖桶水的泡沫箱中。將全部魚放入泡沫箱中后，開始計(jì)時(shí)并觀察各組試驗(yàn)魚的呼吸情況。待10尾試驗(yàn)魚中的8尾停止鰓蓋自主張合動(dòng)作后，將其全部撈起放入原養(yǎng)殖桶中，連續(xù)充氧繼續(xù)觀察2.0 h，記錄各試驗(yàn)組恢復(fù)自主呼吸的魚體數(shù)量。根據(jù)各試驗(yàn)組魚停止鰓蓋自主張合時(shí)間和恢復(fù)自主呼吸的魚體數(shù)量，評(píng)價(jià)各組魚耐低氧的能力。

1.5.2 抗干旱能力測(cè)定

從各試驗(yàn)組中分別隨機(jī)撈取10尾試驗(yàn)魚，進(jìn)行抗干旱能力的測(cè)定。具體做法是將撈起的試驗(yàn)魚放在干燥的塑料筐中，連續(xù)觀察魚體的動(dòng)態(tài)，待10尾試驗(yàn)魚中的8尾停止鰓蓋自主張合運(yùn)動(dòng)后，將其全部放入原養(yǎng)殖桶中，連續(xù)充氧繼續(xù)觀察2.0 h，記錄各試驗(yàn)組恢復(fù)自主呼吸的魚體數(shù)量。根據(jù)各組魚停止鰓蓋自主張合時(shí)間和恢復(fù)自主呼吸的魚體數(shù)量，評(píng)價(jià)各組魚抗干旱的能力。

1.5.3 抗低鹽度應(yīng)激能力測(cè)定

從各試驗(yàn)組分別隨機(jī)撈取10尾供試魚，放入盛有4 L淡水、連續(xù)充氧的泡沫箱中，將全部魚放入泡沫箱中后，開始計(jì)時(shí)并觀察各組試驗(yàn)魚的呼吸情況。記錄試驗(yàn)組和對(duì)照組魚全部停止鰓蓋自主張合的時(shí)間，評(píng)價(jià)試驗(yàn)組和對(duì)照組魚的耐低鹽能力。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA），差異顯著（P＜0.05）后，進(jìn)行鄧肯氏多重比較（Duncan's multiple range tests），所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 飼料中酵母水解物對(duì)大菱鲆幼魚免疫相關(guān)酶活性的影響（見表2）

表2 酵母水解物對(duì)大菱鲆幼魚免疫相關(guān)酶活性的影響

由表2可見，添加酵母水解物的各試驗(yàn)組血清溶菌酶（LZM）、肝臟酸性磷酸酶（ACP）和一氧化氮合酶（NOS）活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；YH-1組肝臟堿性磷酸酶活性高于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）；YH-2及YH-3組肝臟AKP活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；且血清LZM、肝臟ACP、AKP和NOS活性隨著酵母水解物的含量增加呈先上升后下降的趨勢(shì)；YH-2組的LZM、AKP、NOS活性顯著高于YH-1和YH-3組（P＜0.05）；YH-2組的肝臟ACP活性略高于YH-1和YH-3組，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 飼料中酵母水解物對(duì)大菱鲆幼魚肝臟抗氧化能力的影響（見表3）

表3 酵母水解物對(duì)大菱鲆幼魚肝臟抗氧化能力的影響

由表3可知，YH-1組肝臟總抗氧化能力(T-AOC)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），YH-2、YH-3組T-AOC則顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；添加酵母水解物的各試驗(yàn)組超氧化物歧化酶（SOD）活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；YH-2組的SOD活性顯著高于YH-1、YH-3組；YH-1、YH-2組肝臟丙二醛（MDA）含量與對(duì)照組（YH-0）相比無顯著差異（P＞0.05）；YH-2組的過氧化物酶（POD）活性略高于YH-0、YH-1組，但差異不顯著（P＞0.05）；YH-0、YH-1和YH-2三組POD活性均顯著高于YH-3組（P＜0.05）。

2.3 飼料中酵母水解物對(duì)大菱鲆幼魚抗應(yīng)激能力的影響（見表4）

表4 酵母水解物對(duì)大菱鲆幼魚抗應(yīng)激能力的影響

由表4可知，各試驗(yàn)組耐干旱時(shí)間和耐干旱存活率差異不顯著（P＞0.05）；YH-3組的耐干旱時(shí)間大于YH-0組；YH-1、YH-2組的耐干旱存活率高于對(duì)照組，但無顯著差異（P＞0.05）；YH-1組與YH-0組的耐低氧時(shí)間差異不顯著（P＞0.05），YH-0、YH-1組耐低氧時(shí)間均顯著高于YH-2、YH-3組（P＜0.05）；添加酵母水解物的各試驗(yàn)組的耐低氧存活率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；添加酵母水解物各試驗(yàn)組大菱鲆幼魚的耐低鹽時(shí)間顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中YH-2組耐低鹽時(shí)間顯著高于其他三組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 飼料中酵母水解物對(duì)大菱鲆幼魚免疫相關(guān)酶活性的影響

LZM是一種堿性蛋白，能水解細(xì)菌細(xì)胞壁中黏肽的乙酰氨基多糖并使之裂解被釋放出來，形成一個(gè)水解酶體系，從而破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，實(shí)現(xiàn)機(jī)體防御功能[11]。王武剛對(duì)凡納濱對(duì)蝦的研究中，魚粉替代量為15%時(shí)，血清LZM活性顯著高于對(duì)照組，替代量大于15%后，各替代組血清LZM活性均低于對(duì)照組[3]。這與本研究結(jié)果一致，YH-2組LZM活性最高，添加量大于2%時(shí)其活性下降，說明適量的酵母水解物可提高大菱鲆幼魚的LZM活性，而過高的添加量可能會(huì)有抑制作用。

AKP和ACP是兩種重要的水解酶，對(duì)細(xì)菌等異物在溶酶體內(nèi)的消化降解具有重要作用。在本研究中，YH-2組的AKP、ACP活性最高，隨著飼料中酵母水解物含量進(jìn)一步提高，其活性下降。NO是吞噬細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用的一種有效分子，一些非免疫細(xì)胞在激活時(shí)也能大量釋放NO。NO的生物合成依賴于NOS[12]。本研究結(jié)果表明，酵母水解物可提高大菱鲆幼魚肝臟NOS活性。

酵母水解物提高機(jī)體免疫能力，可能與其核苷酸、B族維生素等功能性物質(zhì)含量豐富有關(guān)。Sajeevan曾指出核苷酸可作為水產(chǎn)動(dòng)物的免疫增強(qiáng)劑[13]。王廣軍等研究表明，飼料中添加酵母核苷酸可提高凡納濱對(duì)蝦肌肉組織中LZM、ACP活性[14]。許丹丹等研究表明，飼料中添加核苷酸混合物可顯著提高凡納濱對(duì)蝦肝胰腺堿性磷酸酶(AKP)活性[7]。周小秋指出，B族維生素可以通過提高血清LZM活性和血清ACP活性增強(qiáng)殺菌能力，通過增強(qiáng)血清總鐵結(jié)合力提高抑菌能力，通過提高血清凝集素水平和血清補(bǔ)體含量促進(jìn)白細(xì)胞吞噬作用，從而增強(qiáng)魚體的非特異性免疫力[9]。劉立鶴等指出，酵母水解物粉狀或膏狀產(chǎn)品中都含有17%～30%的β-葡聚糖和甘露寡糖，這對(duì)于改善腸道微生態(tài)、增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫能力具有重要的作用[15]。酵母水解物中含有酵母細(xì)胞壁多糖，能刺激免疫，促進(jìn)免疫器官發(fā)育[16]。近年來的研究證實(shí)，β-葡聚糖能夠提高溶菌酶的活性，提高免疫相關(guān)酶的活性，并能夠活化B細(xì)胞和T細(xì)胞。

3.2 飼料中酵母水解物對(duì)大菱鲆幼魚肝臟抗氧化能力的影響

T-AOC可以反映機(jī)體酶促和非酶促系統(tǒng)的抗氧化能力[17]。本研究中，YH-1組的T-AOC顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。SOD可以消除體內(nèi)多余的自由基，是機(jī)體清除氧自由基的重要抗氧化保護(hù)酶，它能促使自由基的形成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，從而清除自由基對(duì)機(jī)體的危害，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。當(dāng)SOD活性降低時(shí)，其自由基等毒害物質(zhì)就會(huì)積累[11]。丙二醛（MDA）是生物膜中的不飽和脂肪酸受到活性氧攻擊，發(fā)生脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化強(qiáng)弱，間接反映組織細(xì)胞氧化損傷的程度。本研究中，YH-2組的SOD、POD活性高于其他組；YH-2組的MDA含量低于YH-0和YH-3組。綜合上述指標(biāo)，酵母水解物可以提高大菱鲆幼魚肝臟抗氧化能力，且YH-2組大菱鲆幼魚的肝臟抗氧化能力最強(qiáng)。這與王武剛對(duì)凡納濱對(duì)蝦的研究結(jié)果一致[3]。

酵母水解物提高大菱鲆幼魚的抗氧化能力可能與其中含有豐富的B族維生素、核苷酸和小肽有關(guān)。有研究表明，隨著硫胺素、核黃素、煙酸、泛酸、吡哆醇和肌醇添加量的提高，幼建鯉血清和肌肉MDA含量顯著或極顯著下降，血清、肝胰臟、腸道、后腎和肌肉等的一種或多種組織SOD活性顯著或極顯著提高[9]。許丹丹等研究表明，飼料中添加外源核苷酸可顯著提高凡納濱對(duì)蝦肝胰臟的T-AOC活性(P＜0.05)，提高血清SOD活性(P＞0.05)[7]。苗新等研究表明，飼料中核苷酸添加量為300 mg/kg時(shí)，可顯著提高大黃魚血清SOD活性和T-AOC的活性，從而提高機(jī)體抗氧化能力[18]。王廣軍等研究顯示，在飼料中添加酵母核苷酸可顯著提高凡納濱對(duì)蝦肌肉組織中的SOD、POD活性[14]。姜柯君等對(duì)星斑川鰈的研究中，飼料中添加適量小肽后，肝臟和血清的SOD活性升高，MDA含量顯著降低(P＜0.05)[19]。

3.3 飼料中酵母水解物對(duì)大菱鲆幼魚抗應(yīng)激能力的影響

應(yīng)激反應(yīng)是魚體對(duì)各種環(huán)境因子的超常刺激所產(chǎn)生的一種非特異性生理反應(yīng)。過度的應(yīng)激不僅影響魚類的生產(chǎn)性能，還會(huì)誘發(fā)多種疾病，甚至造成死亡[20]。本研究中，飼料中添加酵母水解物可提高大菱鲆幼魚耐干旱及耐低氧應(yīng)激的存活率，顯著延長大菱鲆幼魚耐低鹽應(yīng)激時(shí)間（P＜0.05）。由此可見，飼料中添加酵母水解物可提高大菱鲆幼魚的抗應(yīng)激能力。這可能與酵母水解物中豐富的核苷酸含量有關(guān)。Superchi等對(duì)仔豬的研究表明，在仔豬斷奶前補(bǔ)充日糧核苷酸能提高斷奶應(yīng)激的適應(yīng)能力[21]。王廣軍等研究表明，飼料中添加酵母核苷酸可提高凡納濱對(duì)蝦的抗應(yīng)激能力[14]。

酵母水解物提高大菱鲆幼魚的抗應(yīng)激能力還可能與其中含有的酵母免疫多糖有關(guān)，酵母多糖可增加動(dòng)物對(duì)外界不良刺激的適應(yīng)性。研究顯示，酵母細(xì)胞壁多糖可提高異育銀鯽和草魚的抗應(yīng)激能力[20，22]。

4 結(jié)論

飼料中添加酵母水解物可提高大菱鲆幼魚機(jī)體免疫能力、肝臟抗氧化性能和抗應(yīng)激能力；且在本試驗(yàn)條件下，以添加2%的酵母水解物的效果最佳。