■邢麗紅 冷凱良 孫偉紅 李兆新 付樹林 孫曉杰

（農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（青島）中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071）

復(fù)方硝基酚鈉是20世紀(jì)60年代由日本旭化學(xué)工業(yè)株式會社最先發(fā)現(xiàn)的一種高效植物生長調(diào)節(jié)劑，由對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉及其助劑按一定比例混配而成[1-2]。復(fù)方硝基酚鈉是一種新型強(qiáng)力細(xì)胞賦活劑，在農(nóng)業(yè)、畜牧和漁業(yè)上有廣泛應(yīng)用。由于復(fù)方硝基酚鈉的價(jià)廉高效，使得化肥生產(chǎn)商在肥料生產(chǎn)過程中，添加少量的復(fù)方硝基酚鈉，以增強(qiáng)其肥效，降低成本[3]。我國農(nóng)業(yè)部公告第193號《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中將硝基酚鈉列為禁用藥物。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，硝基酚類化合物的測定方法主要有：電位法[4]、分光光度法[5]、高效液相色譜法[6-7]、氣相色譜法[8-9]、液-質(zhì)聯(lián)用法[10-11]和氣-質(zhì)聯(lián)用法[12-14]等。電位法和分光光度法干擾較多，靈敏度較差；氣相色譜法分析具有較高的靈敏度，但前處理過程需要進(jìn)行衍生化操作，對操作人員有較高的要求，步驟較為繁瑣；液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法的檢測成本較高。而采用液相色譜法分析則不需衍生，前處理操作相對簡單，應(yīng)用最為廣泛。

我國是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，對水產(chǎn)飼料的需求巨大。復(fù)方硝基酚鈉在蝦蟹等水產(chǎn)動物飼料中的添加量約為0.02‰～0.03‰。目前，水產(chǎn)飼料中復(fù)方硝基酚鈉含量的檢測方法還未建立。因此，本研究采用高效液相色譜法建立復(fù)方硝基酚鈉在水產(chǎn)飼料中含量的檢測方法，從而為水產(chǎn)飼料樣品中復(fù)方硝基酚鈉的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀，配紫外檢測器（美國Agilent公司）；Waters 2695高效液相色譜儀，配紫外可變波長檢測器（美國Waters公司）；高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；渦旋混合儀（美國Talboys公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidoplh公司）；超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Gradient A10 Mill-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 藥品和試劑

對硝基酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品、5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞99.0%(Sigma公司）；鄰硝基酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞99.0%(東京化成工業(yè)株式會社）；甲醇、乙腈、正己烷：色譜純（德國Merck公司）；無水硫酸鈉、氫氧化鈉、磷酸：分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 溶液配制

對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉、5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉對照品各約0.010 0 g，用甲醇溶解并定容至10 ml，配成濃度為1 mg/ml的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液；對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：準(zhǔn)確移取適量對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇逐級稀釋配成濃度為100 μg/ml和10 μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取和凈化

稱取試樣5 g(精確到0.01 g)，置于50 ml離心管中，加入2 g無水硫酸鈉，加入15 ml乙腈，渦旋混合1 min，使樣品分散均勻，超聲提取10 min，于8 000 r/min離心10 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至100 ml離心管中，殘?jiān)儆靡译嬷貜?fù)提取兩次，每次乙腈用量均為10 ml。提取液合并入100 ml離心管中。在提取液中加入10 ml正己烷，渦旋混合1 min，棄去正己烷。再加入10 ml正己烷重復(fù)上述操作。將提取液轉(zhuǎn)移入100 ml梨形瓶中，加入4 mol/l氫氧化鈉溶液100 μl，35℃下減壓濃縮至近干。再加入1.95 ml甲醇-磷酸水溶液，充分渦旋溶解殘余物，再加入50 μl磷酸，渦旋混合均勻，并于10 000 r/min離心10 min，清液過0.45 μm微孔濾膜，供高效液相色譜儀測定。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

準(zhǔn)確移取適量對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用流動相稀釋成濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/ml和20.0 μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，供高效液相色譜儀測定。

1.5 色譜參考條件

色譜柱：AgelaVenusil XBP C18(2)，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：0.1%磷酸溶液∶甲醇=63∶37（V/V）；柱溫：40 ℃；流速：1 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；紫外檢測器：波長280 nm。

2 結(jié)果

2.1 方法的檢出限和定量限

方法的檢測限（LOD）一般是根據(jù)信噪比外推得到，然而由于基質(zhì)干擾等因素的影響，在進(jìn)行實(shí)際樣品測定時(shí)，LOD通常很難實(shí)現(xiàn)。方法的檢測限和定量限是按樣品實(shí)際添加計(jì)算得到的，在空白飼料中添加硝基酚鈉混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4的方法處理樣品，1.5的方法確定的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以檢出的對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉的峰高為3倍基線噪音值時(shí)所對應(yīng)的濃度計(jì)算，得到檢出限為0.5 mg/kg。以檢出目標(biāo)峰的峰高為10倍基線噪音值時(shí)所對應(yīng)的濃度計(jì)算，得到定量限為1.0 mg/kg。飼料中硝基酚鈉添加樣品色譜圖及空白樣品色譜圖見圖1～圖2。

2.2 方法的線性范圍

取系列硝基酚鈉混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，以峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到三種化合物的線性回歸方程，各物質(zhì)在0.5～20 μg/ml濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2＞0.999。當(dāng)樣品中待測目標(biāo)物被檢出，且濃度超出線性范圍時(shí)，需稀釋處理后再次測定。線性回歸曲線及方程見圖3～圖5。

圖1 飼料中添加硝基酚鈉色譜圖（添加水平：1.0 mg/kg）

圖2 空白飼料樣品色譜圖

圖3 對硝基酚鈉校正曲線

圖4 鄰硝基酚鈉校正曲線

圖5 5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉校正曲線

2.3 回收率和精密度

方法的準(zhǔn)確度用回收率表示。分別以魚飼料、蝦飼料、蟹飼料樣品為測試對象，添加不同水平的對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉，添加濃度為1～20 mg/kg時(shí)，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1～表3所示。本方法測定對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉批內(nèi)變異系數(shù)見表1～表3，計(jì)算批間變異系數(shù)是在不同天分別測定3次，本標(biāo)準(zhǔn)的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均在15%以內(nèi)。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

由于對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉是鹽溶液，在普通C18反相色譜柱上難以保留，無法達(dá)到分離效果，但在酸性條件下將其轉(zhuǎn)變成硝基苯酚的形式就可以在C18反相色譜柱上保留。因此本實(shí)驗(yàn)選擇了磷酸水溶液和甲醇作為流動相，并通過反復(fù)調(diào)試流動相的比例，確定0.1%磷酸水溶液與甲醇比例是63∶37時(shí)，三種目標(biāo)化合物在C18反相柱上既能獲得了良好的峰形和穩(wěn)定的保留時(shí)間，又能與雜質(zhì)區(qū)分開。

色譜柱的選擇對本實(shí)驗(yàn)的測定有重要影響。本試驗(yàn)分別比較了不同品牌、不同長度的C18反相色譜柱，結(jié)果表明，普通C18色譜柱均能將三種目標(biāo)化合物分開，但與其他幾款色譜柱相比，采用Agela Venusil XBP C18(2)色譜柱時(shí)，對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉的出峰時(shí)間均較晚，與雜質(zhì)的分離效果較好，可以有效避免雜質(zhì)峰的干擾，因此本實(shí)驗(yàn)最終確定使用Agela Venusil XBP C18(2)色譜柱。

3.2 檢測波長的選擇

表1 對硝基酚鈉的添加回收率及精密度

表2 鄰硝基酚鈉的添加回收率及精密度

表3 5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉的添加回收率及精密度

為提高靈敏度，探索最佳檢測波長，本試驗(yàn)采用紫外可變波長檢測器，分別對樣品中對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖6～圖8。從圖中可以看出，對硝基酚鈉的最大吸收波長為315 nm，鄰硝基酚鈉的最大吸收波長為280 nm，5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉的最大吸收波長為340 nm。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，3種目標(biāo)化合物在280 nm下都有較大吸收響應(yīng)，能同時(shí)滿足三種化合物的測定要求。

3.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

對硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉屬于強(qiáng)極性化合物，根據(jù)相似相溶的原理，提取溶劑一般都選用極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑、緩沖溶液或水和有機(jī)溶劑的混合溶液。本實(shí)驗(yàn)分別比較了有機(jī)溶劑乙腈和甲醇、具有沉淀蛋白作用的1%三氯乙酸水溶液及弱堿性0.1 mol/l碳酸鉀溶液作為提取劑的提取效果。結(jié)果表明，1%三氯乙酸水溶液提取效率不夠高，以甲醇和0.1 mol/l碳酸鉀溶液分別作為提取劑，其提取的雜質(zhì)太多。乙腈與組織的兼容性較好，不僅具有沉淀飼料中蛋白質(zhì)的作用，還有去除部分脂肪的作用，其提取效果最好。因而，最終選用了乙腈作為提取劑。

圖6 對硝基酚鈉紫外掃描圖

圖7 鄰硝基酚鈉紫外掃描圖

圖8 5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉紫外掃描圖

水產(chǎn)飼料中的蛋白質(zhì)、脂肪含量較高[15]，因此，實(shí)驗(yàn)選擇采用正己烷通過液液分離去除乙腈提取液中的脂類雜質(zhì)。無水硫酸鈉可以脫除乙腈提取液中的水分。通過正己烷的凈化和無水硫酸鈉的脫水作用，不僅可以防止溶液暴沸，還有利于縮短濃縮時(shí)間。由于鄰硝基苯酚具有揮發(fā)性，在濃縮過程中幾乎全部損失。因此濃縮時(shí)通過在提取液中加入氫氧化鈉，使之在堿性溶液中以鈉鹽的形式存在，可以有效避免鄰硝基酚鈉的損失。提取液濃縮后呈堿性，目標(biāo)化合物以鈉鹽形式存在，無法在C18柱上保留，因此在定容時(shí)，通過加入磷酸可以將定容溶液pH值調(diào)節(jié)至3，從而在色譜柱上有較好的保留。

4 結(jié)論

本文采用乙腈提取飼料中的硝基酚鈉，正己烷液液萃取除去飼料中的雜質(zhì)，在堿性條件下減壓濃縮至干，通過高效液相色譜儀測定硝基酚鈉的含量。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，該方法操作簡便，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可滿足水產(chǎn)飼料中復(fù)方硝基酚鈉的含量檢測。