郝志敏，朱虹

(寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院，浙江 寧波315000）

·臨床研究·

ASPP1在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的表達下調(diào)與超甲基化、凋亡活動及葡萄胎預后相關性的研究

郝志敏，朱虹

(寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院，浙江 寧波315000）

目的探討ASPP1在不同滋養(yǎng)細胞組織中促甲基化作用和表達水平，以及在體外絨毛膜癌JEG-3和JAR細胞株的效應，判定其與葡萄胎惡變的相關性。方法 通過定量PCR和免疫組化技術，檢測滋養(yǎng)細胞中ASPP1 mRNA表達水平。用MS-PCR技術評估ASPP1 mRNA表達與甲基化狀態(tài)相關性，及ASPP1在正常胎盤和妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中表達差異。用TUNEL法檢測ASPP1表達與增殖指數(shù)（Ki67，MCM7）、凋亡指數(shù)（M30細胞凋亡抗體）、P53、caspase-8相關性。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示ASPP1在絨毛膜癌和葡萄胎中表達低于正常胎盤組織中的表達(P＜0.01），進展為持續(xù)性葡萄胎組低于自然消退組，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。ASPP1表達與增殖指數(shù)（Ki67，MCM7）、凋亡指數(shù)(M30）、P53、caspase-8高度相關。ASPP1通過內(nèi)源性與外源性路徑誘導凋亡，上調(diào)活化的caspase-9及配體蛋白的表達。結(jié)論ASPP1通過超甲基化的表達下調(diào)進而誘導凋亡可能在葡萄胎的發(fā)病機制及葡萄胎惡變中發(fā)揮作用。

凋亡；ASPP1；絨毛膜癌；妊娠滋養(yǎng)細胞疾?。怀谆?；甲基化

葡萄胎是一種良性疾病，多數(shù)葡萄胎在吸宮后病灶自然消退，然而仍有10%～20%葡萄胎會進展成持續(xù)性滋養(yǎng)細胞腫瘤而需要化療[1]。對于滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)病機制已進行過大量的遺傳學和生物學研究，但其發(fā)病機制尚不明確，既往研究表明滋養(yǎng)細胞的凋亡下降可能導致滋養(yǎng)細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。P53凋亡刺激蛋白1（ASPP1）能夠與P53蛋白結(jié)合增強該蛋白的促進細胞凋亡的功能，發(fā)揮抑制腫瘤的作用[2]；近來研究表明ASPP1在野生型P53陽性的人類癌細胞株中表達下調(diào)，如乳腺癌[3]，小細胞肺癌[4]及急性粒細胞白血病[5]，但關于ASPP1在滋養(yǎng)細胞中的作用機制研究甚少。本研究中，為了揭示ASPP1在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病發(fā)病機制及臨床預后中的作用，本文檢測ASPP1在正常胎盤組織及滋養(yǎng)細胞疾病中的表達及甲基化狀態(tài)以及其與臨床參數(shù)的相關性，同時進行了體外細胞功能分析。

1 材料與方法

1.1材料 檢測87例滋養(yǎng)細胞標本，包括19例早期正常絨毛組織，13例足月胎盤，50例完全性葡萄胎（妊娠5～28周，平均14周），5例絨毛膜癌，在完全性葡萄胎組中42例良性轉(zhuǎn)歸，8例發(fā)生惡變。葡萄胎及絨毛膜癌標本來自于寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2009～2012年病理存檔的石蠟切塊。采用定時PCR和MS-PCR技術，提取50例葡萄胎，5例絨毛膜癌，13例足月胎盤和19例早期正常絨毛組織的cDNA及DNA。早期絨毛組織為人工流產(chǎn)的新鮮組織，足月胎盤為正常分娩后的胎盤組織，葡萄胎或絨毛膜癌組織為吸宮術或子宮切除術的標本。所有組織均獲得倫理委員會的批準，并符合組織學診斷標準。葡萄胎后發(fā)展為持續(xù)性滋養(yǎng)細胞腫瘤的診斷凡符合下列標準中的任何一項且排除妊娠可能即可診斷為妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤（GTN）：（1）葡萄胎排空后HCG測定連續(xù)4次呈平臺狀態(tài)

（±10%），并持續(xù)3周或更長時間 ，即1、7、14、21日； （2）葡萄胎排空后HCG測定連續(xù)3次 升高（＞10%），并至少持續(xù)2周或更長時間，即1、7、14日；（3）葡萄胎排空后HCG水平持續(xù)異常達6個月或更長時間；（4）組織學診斷。

1.2方法 葡萄胎組織經(jīng)過顯微鏡切割及染色體原位雜交后進行熒光微衛(wèi)星基因定位。從數(shù)據(jù)庫中檢索增殖與凋亡指數(shù)與ASPP1免疫反應的相關性。

1.2.1免疫組化試驗4μm石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；置入檸檬酸緩沖液 （pH= 7.6），在高壓鍋中進行抗原修復，加熱至沸騰l分鐘，室溫下冷卻15分鐘；每張切片滴加30μL內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（試劑A），以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，ASPP1（LXO54.2）（Sigma、St Louis、MO、USA）鼠抗人單克隆抗體1：200稀釋、孵化，新鮮配制的DAB顯色液，鏡下控制顯色，蘇木素復染細胞核，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡觀察、攝片。免疫組化用PBS代替一抗作為陰性對照，已知的正常早期絨毛組織作為陽性對照。判定標準：陽性染色為細胞漿著色，細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，根據(jù)陽性細胞百分率來判定結(jié)果:無細胞顯色為（-）；0%～25%細胞顯色為（+）；25%～50%細胞顯色為 （++）；50.1%～75.0%細胞顯色為（+++）；75.1%～100%細胞顯色為 （++++）。ASPP1蛋白陽性定位以細胞漿和/或細胞核出現(xiàn)棕黃色顯色為ASPP1蛋白表達陽性細胞，每個視野計數(shù)200個細胞，共計5個高倍視野的陽性細胞數(shù)。免疫組化結(jié)果采用半定量計分法判定，根據(jù)Remmele和stegner提出的免疫反應積分（IRS）打分，它采用染色強度（SI）和陽性細胞百分比（PP）的乘積，即IRS=SI×PP，分級如下，IRS：0～3分為陰性（－），4～6分為弱陽性 （+），8～9分為中度陽性（++），12分為強陽性（+++）。

1.2.2定時定量PCR根據(jù)已知的研究程序?qū)嵤┒縋CR。Trizol試劑 （Invitrogen，Life Technologies Inc.，Rockville，MD，USA）提取2.5μgRNA，用寡核苷酸作為引物通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應合成DNA，在ABI PRISM 7900序列檢測體系（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）實施定量PCR。使用的引物詳見表1，磷酸甘油醛脫氫酶DNA擴增作為對照組。以磷酸甘油醛脫氫酶表達為標準，用2DDCT方法確定ASPP1表達。

1.2.35-脫氧胞苷和曲古柳菌素處理絨毛膜癌細胞 人絨毛膜癌JEG-3及JAR細胞系引自北京中國科學院動物研究所計劃生育及生殖生物學國家重點實驗室。絨毛膜癌細胞株在10%胎牛血清及100U/mL青霉素及鏈霉素組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。處理JEG-3和JAR細胞，5 mM 5’-aza-2’脫氧胞苷

（5-aza-dc，Sigma）培養(yǎng)3天，0.3 mM曲古柳菌素（TSA，Sigma）培養(yǎng)1天，然后兩者結(jié)合（5 mM 5-aza-dc兩天，然后5 mM 5-aza-dc和0.3 mM TSA 1天）。以中介物二甲基亞砜作為對照組，在預定的時間內(nèi)收集細胞。

1.2.4DNA配置、亞硫酸鈉修復和MS-PCR在未甲基化的胞核嘧啶經(jīng)過蛋白激酶K的消化并利于硫酸氫鈉處理時轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，然后用苯酚氯仿提取5μgDNA，用QIAEX II kit（Qiagen，Hiden，Germany）提純DNA，根據(jù)已知的MS-PCR分析的研究，甲基化和未甲基化敏感的引物，如表1所示，被設計用來擴增ASPP1啟動基因 （-681 to-476）（GeneBank NM 015316）。甲基化DNA（Chemicon，Atlanta，GA，USA）作為PCR陽性對照，沒有模板的空白鏈作為陰性對照。在95℃烤箱中放置10分鐘使蛋白變性，然后95℃、59℃、72℃各30秒。PCR完成了35個周期，30秒在95℃，30秒在55℃。在2%的瓊脂凝膠電泳中分離MS-PCR產(chǎn)物，溴化乙錠染色，紫外線照射成像。

1.2.5ASPP1轉(zhuǎn)染、蛋白印記分析，亞細胞定位用脂質(zhì)體法2000將ASPP1合成物轉(zhuǎn)染到JEG-3和JAR培養(yǎng)基。反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸（PCDNA）定量3.1作為對照組，用含有蛋白抑制劑的SDS緩沖液提取總蛋白溶解液。用親和性洗滌劑 （Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）蛋白實驗確定蛋白含量。通過SDS-PAGE溶解20μg蛋白轉(zhuǎn)染到氯乙烯細胞膜，再針刺到相對應的抗體中。蛋白印記使用的抗體詳見表2。用ProteoExtract Native細胞膜蛋白提取基 （Calbiochem，San Diego，CA，USA）分離JEG-3細胞核和細胞質(zhì)。

1.2.6轉(zhuǎn)移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記 用原位細胞死亡檢測基（Roche Biochemical，Indianapolis，IN，USA）實施轉(zhuǎn)移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記（TUNEL）。TUNEL陽性細胞數(shù)作為對照組，用ASPP1轉(zhuǎn)染后的JEG-3和JAR陽性細胞數(shù)在光學顯微鏡下呈40倍放大，觀察3個視野。

1.3統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行處理。χ2檢驗檢測各組的甲基化計數(shù)資料；兩樣本間的計量資料比較采用t檢驗；采用Spearman等級相關分析ASPP1和增殖指數(shù)及凋亡指數(shù)的相關性。

2 結(jié)果

2.1ASPP1在絨毛膜癌和葡萄胎中表達下調(diào)，而且與葡萄胎的進展有關 研究結(jié)果顯示，ASPP1免疫組化染色主要定位于絨毛細胞滋養(yǎng)細胞及絨毛外中間型滋養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)，在合體滋養(yǎng)細胞、絨毛間質(zhì)、蛻膜染色較淺且局限（第76頁圖1A-1E），和早孕絨毛組織相比，絨毛膜癌和葡萄胎的ASPP1免疫表達下調(diào)（圖1）。在絨毛膜癌的合體滋養(yǎng)細胞

ASPP1免疫表達范圍局限，強度弱 （第76頁圖1E），更重要的是，在細胞滋養(yǎng)細胞的ASPP1表達在葡萄胎惡變組顯著低于良性轉(zhuǎn)歸組（P＜0.05），詳見表3。ASPP1抗體在JEG-3的亞細胞片段的蛋白印記分析顯示在細胞質(zhì)強表達175 kDa，而在細胞核無表達（圖2）。研究結(jié)果與ASPP1在免疫組化中細胞質(zhì)表達一致。

2.2ASPP1啟動區(qū)甲基化狀態(tài)與mRNA表達相關性 在cDNA樣本檢測的定量PCR結(jié)果表明：mRNA在正常早期絨毛組織的表達高于葡萄胎（P=0.003）及絨毛膜癌（P=0.001）（圖3）。ASPP1 mRNA在絨毛膜癌中的表達低于葡萄胎。ASPP1在足月胎盤中的表達水平高于其在早期絨毛組織中的表達（P=0.004）。體外研究表明，JEG-3經(jīng)過5-氮-2’-脫氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine）處理后ASPP1表達上升2倍，經(jīng)過曲古柳霉素A（TSA）處理后ASPP1表達上升5倍，而在JAR中分別上升2倍和7倍。兩種藥物雙重處理JEG-3及JAR后ASPP1 mRNA表達分別上升10倍和5倍 （圖4）。結(jié)果表明，DNA甲基化可能與ASPP1失活在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中發(fā)揮重要作用有關。甲基化PCR研究表明，葡萄胎中DNA甲基化等位基因頻率高于正常胎盤組織 （圖5）。甲基化ASPP1等位基因表達在葡萄胎中為34.8%（16/ 46）在正常早期絨毛中為11.8%（2/17），足月胎盤中為22.2%（2/9）。此外，ASPP1 mRNA表達與甲基化狀態(tài)高度相關（r=0.702，P=0.029）。絨毛膜癌同時含有甲基化及未甲基化狀態(tài)的ASPP1的等位基因（圖5）。

2.3ASPP1在JEG-3和JAR中過度表達誘導凋亡和上調(diào)配體表達 為了探索ASPP1在凋亡中的作用，在JEG-3和JAR細胞中實施了ASPP1瞬時轉(zhuǎn)染。蛋白印跡轉(zhuǎn)染48小時后評估轉(zhuǎn)染效應。如TUNEL實驗所述，JEG-3和JAR空白載體凋亡細胞數(shù)百分比分別為2.4%和3.5%，然而ASPP1過度表達可以使凋亡細胞數(shù)分別升高到9.4%和13.3%，詳見第76頁圖2A-2B和第77頁圖1。

數(shù)據(jù)庫中檢索葡萄胎中增殖指數(shù) （Ki67和MCM7）、M30凋亡指數(shù)、P53的表達與ASPP1表達相關性。結(jié)果表明ASPP1與P53呈負相關 （r=-0.482；P＜0.001）Ki67（r=-0.304；P=0.020）MCM7增殖指數(shù) （r=-0.409；P=0.016），M30表達的凋亡指數(shù)（r=-0.397；P=0.004）。此外，ASPP1表達與caspase-8的免疫表達呈正相關（r=0.458；P=0.024），而ASPP1轉(zhuǎn)染的絨毛膜癌細胞caspase-9表達升高，說明ASPP1可以通過內(nèi)源性凋亡路徑刺激凋亡。同時還發(fā)現(xiàn)ASPP1免疫計數(shù)與caspase-8呈正相關，故caspase-8在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病凋亡外源性路徑中表達下調(diào)。ASPP1異位表達定量PCR研究發(fā)現(xiàn)配體mRNA表達增加，但是受體和TRAF2表達不變,還發(fā)現(xiàn)配體受體mRNA表達中等強度增加。后來的蛋白印跡分析結(jié)果表明在ASPP1過度表達后出現(xiàn)配體蛋白表達上調(diào)（圖6-7），其中FasL和Fas表達明顯上調(diào)。在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中ASPP1及caspase-8表達均下調(diào)，說明ASPP1可能通過Fas/FasL體系控制凋亡的外源性路徑。

3 討論

滋養(yǎng)細胞對于受精卵的著床、胎盤形成及胎兒的生長發(fā)育發(fā)揮至關重要的作用，在滋養(yǎng)細胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移時的分子機制或信號傳導路徑發(fā)生改變可能導致葡萄胎的發(fā)生及惡變[6]。既往研究表明凋亡在滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)病機理中尤為重要[7-9],而對P53相關基因及調(diào)控基因的研究有助于了解滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)病機制，ASPP1能夠與P53蛋白結(jié)合繼而促進細胞凋亡。

對滋養(yǎng)細胞及絨毛膜癌細胞進行免疫組化和微量蛋白印記分析，結(jié)果表明ASPP1免疫反應主要定位于細胞滋養(yǎng)細胞和中間型滋養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)，和ASPP1首次報道結(jié)果相一致[10-11]。本研究中，用ASPP1抗體LOX54.2判定ASPP1N端（1-308），具有完整N端調(diào)控區(qū)的長鏈ASPP1將其免疫反應最大化，對P53的轉(zhuǎn)活刺激強度強于缺少N端調(diào)控區(qū)的ASPP1轉(zhuǎn)染。因此，抗ASPP1抗體LOX54.2可以辨認內(nèi)在的完整的ASPP1，其可以顯示P53完整的調(diào)控功能。雖然ASPP1表達定位于細胞質(zhì)，P53表達定位于細胞核，但是既往研究表明，ASPP1含有靶序列將其導向細胞質(zhì)，ASPP核心轉(zhuǎn)染區(qū)（872-1090）和綠色熒光蛋白溶合蛋白導致合成物定位于細胞核[12]，然而全長的ASPP1（1-1090）-GFP融合蛋白表達主要定位于細胞質(zhì)，后者符合本文的免疫組化結(jié)果，可能是因為轉(zhuǎn)錄后的基因修復和結(jié)合蛋白有助于ASPP1在不同亞細胞分割間的

交換，然后充分發(fā)揮其生物作用。ASPP1在滋養(yǎng)細胞腫瘤中表達定位于細胞滋養(yǎng)細胞及中間型滋養(yǎng)細胞，有學者認為正是這兩種細胞的干細胞的特性決定了滋養(yǎng)細胞腫瘤的發(fā)生[13]。

本次免疫組化研究還發(fā)現(xiàn)，ASPP1表達在足月胎盤及正常早孕絨毛組織中最高，在葡萄胎良性轉(zhuǎn)歸組及惡變?yōu)樽甜B(yǎng)細胞腫瘤組的表達依次降低，在絨毛膜癌細胞株中表達最低，說明ASPP1低表達預測葡萄胎有一定的惡變潛能，與Mak等[14]的研究結(jié)果相一致，認為ASPP1通過內(nèi)源性與外源性路徑誘導凋亡，上調(diào)活化的半胱天冬酶9及配體蛋白的表達，故推測ASPP1的凋亡表達逐漸丟失可能阻礙了細胞滋養(yǎng)細胞和絨毛中間型滋養(yǎng)細胞的日益凋亡，導致滋養(yǎng)細胞腫瘤的發(fā)生。

定量PCR結(jié)果表明ASPP1 mRNA在正常早期絨毛組織的表達高于其在葡萄胎及絨毛膜癌組織中的表達，在絨毛膜癌中的表達低于葡萄胎，在足月胎盤中的表達水平高于其在早期絨毛組織中的表達，再次證明了滋養(yǎng)細胞的凋亡下降導致滋養(yǎng)細胞腫瘤的發(fā)生。用5-aza-dc處理mRNA后的表達，結(jié)果表明，在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的進展中，反向DNA甲基化有助于ASPP1表達下調(diào)。腫瘤抑制基因的DNA超甲基化和干細胞轉(zhuǎn)錄因子在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中的表達已有報道[15]。此外，用組蛋白去

乙?；敢种苿㏕SA和去甲基化5-氮脫氧胞苷處理細胞，可以協(xié)同激活ASPP1 mRNA的表達，在SOX2的研究中已報道過[16]?；蛉ゼ谆徒M蛋白去乙酰化酶是必不可少的，但是還包括外源性調(diào)節(jié)機制。甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白能夠啟動HDAC和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，然而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶能夠直接結(jié)合HDAC，表明了DNA甲基化和組蛋白去乙?；嗷プ饔谩Ｓ腥さ氖?，TSA誘導ASPP1 mRNA表達活力高于5-氮脫氧胞。近來研究發(fā)現(xiàn)TSA通過組蛋白去乙?；饔迷诩谆[瘤抑制基因中能夠誘導DNA去甲基化，TSA對組蛋白去乙?；虳NA去甲基化的選擇性交叉反應能夠影響ASPP1表達[17]。

通過檢索數(shù)據(jù)庫分析ASPP1和P53、增殖指數(shù)（Ki67 and MCM7）、凋亡指數(shù)（M30）的相關性分析時呈負相關，表明ASPP1可能在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中平衡增殖與凋亡，具有重要意義。

ASPP1與P53結(jié)合，通過內(nèi)源性路徑激活凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，如BAX、PUMA。研究結(jié)果表明，表達野生型P53的絨毛膜癌細胞中ASPP1的表達可以誘導凋亡，同時活化的caspase-9表達增加，證明ASPP1激活凋亡的內(nèi)源性路徑，作者還發(fā)現(xiàn)ASPP1和caspase-8的全部形式具有相關性。在以前的凋亡實驗中已報道，caspase-8是凋亡外源性路徑的一個成員，其表達在絨毛膜癌組與正常胎盤組織相比顯著下調(diào)[18]。作者研究證明了在絨毛膜癌細胞中配體和受體共同表達以及在ASPP1轉(zhuǎn)染后配體表達上調(diào)，是ASPP1誘導凋亡的外源性路徑。組織的生理性細胞轉(zhuǎn)化中，配體和受體的共同表達與凋亡細胞死亡有關[19]，滋養(yǎng)細胞中配體和受體通過自分泌和旁分泌機制相互作用[20]?？傊?，研究結(jié)果揭示了ASPP1和Fas/FasL體系可能相互作用，特別是在有活力的滋養(yǎng)細胞的凋亡的外源性路徑。

綜上所述，本文探索了滋養(yǎng)細胞疾病中ASPP1通過超甲基化誘導凋亡的表達下調(diào)與葡萄胎的進展及惡變相關，還揭示了滋養(yǎng)細胞中凋亡的外源性路徑中ASPP1和Fas/FasL相互作用，提示ASPP1可能通過凋亡效應在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病發(fā)病機制及預后中發(fā)揮重要作用。

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