何觀虹，姚麗

MicroRNA在肺動脈高壓發(fā)病機制中作用的研究進(jìn)展

何觀虹，姚麗

MicroRNA（miRNA）是一類在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼小分子 RNA，在生物體生理、病理等過程中發(fā)揮重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等多種病理生理過程，在心血管系統(tǒng)信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起到重要作用［1-2］。

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是僅次于冠心病和高血壓的第三類常見心血管疾病，發(fā)病率和死亡率都很高。肺動脈壓力進(jìn)行性升高的主要機制為血管收縮、重構(gòu)和血栓形成。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與 PAH中血管收縮和重構(gòu)中多物質(zhì)的調(diào)控，本文將對 miRNA在 PAH調(diào)控中的具體機制作一綜述。

1 miRNA形成及作用機制

miRNA的生物合成可以分為前體轉(zhuǎn)錄、出核轉(zhuǎn)運及成熟這幾個過程［3］，成熟 miRNA通過沉默靶基因，在分化、增殖、細(xì)胞凋亡和代謝等過程發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。miRNA和靶 mRNA作用方式主要有兩種，一是其與靶 mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）不完全互補配對［4］，阻斷該基因的翻譯過程，影響蛋白表達(dá)水平，但不影響mRNA的穩(wěn)定性；二是miRNA和靶mRNA完全互補配對使靶 mRNA在互補區(qū)特異性斷裂，導(dǎo)致基因沉默。

2 miRNA在肺動脈高壓發(fā)病機制中的作用

2.1 miRNA在肺部的表達(dá)

目前，PAH患者miRNA表達(dá)譜中共有 78個差異表達(dá)位點，62個顯示上調(diào)（miR-135a、miR-130a、miR-27b等），16個下調(diào)（miR-147、miR-92b等）［5-6］。PAH患者血漿中58種 miRNA的濃度變化中，miR-150下調(diào)程度最大。晚期 PAH大鼠肺組織中有 30個 miRNA表達(dá)明顯上調(diào)（miR-122、miR-130a、miR-146b等），7個 miRNA顯著下調(diào)（miR-382、miR-192、miR-29c等）［7］。在野百合堿誘導(dǎo)的 PAH大鼠模型和 PAH患者 miR-21的水平均下調(diào)，miR-405水平均上調(diào)［8-9］。

2.2 miRNA對肺血管組分的調(diào)控作用

miRNA參與肺血管收縮和重構(gòu)。既調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡、促進(jìn)血管新生，又在血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化方面起重要作用，進(jìn)而在肺血管收縮和重構(gòu)各個環(huán)節(jié)中發(fā)揮功能。

2.2.1 miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控作用 缺氧條件下，內(nèi)皮細(xì)胞中 miR-21表達(dá)使二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶 1（dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1，DDAH1）表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而造成內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，而 miR-21拮抗劑以及 DDAH轉(zhuǎn)染可以阻斷該表達(dá)下調(diào)，提高環(huán)鳥苷酸（cGMP）水平進(jìn)而改善肺動脈高壓［10］。另外，miR-21的模擬物證實可以下調(diào)程序性死亡因子 4（programmed cell death protein-4，PDCD4）的表達(dá)，抑制 PDCD4/caspase-3凋亡通路從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［11］。

在內(nèi)皮細(xì)胞中，缺氧誘導(dǎo) miR-27a的表達(dá)，使內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）表達(dá)增加，過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ， PPARγ）表達(dá)下降，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。而且，PPARγ的配體 RSG能夠下調(diào)缺氧所誘導(dǎo)的 miR-27a，證實PPARγ與 miR-27a的負(fù)反饋調(diào)節(jié)與 PAH的發(fā)生相關(guān)［12］。

miR-126是內(nèi)皮型的 miRNA，在 PAH中表達(dá)上調(diào)，由于 miR-126靶定位 Spred-1和 PIK3R2基因，使其能促進(jìn)動脈環(huán)模型的血管新生，加重血管重構(gòu)［13-14］。

胎盤生長因子（placenta growth factor，PIGF）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞 miR-199a2的表達(dá)下調(diào)。miR-199a2靶定缺氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）mRNA的 3'-UTR，進(jìn)而使 ET-1的表達(dá)增強。位于 DNM3os轉(zhuǎn)錄區(qū)的 miR-199a2受 PPARα的調(diào)控，因此 PPARα激動劑非諾貝特能夠上調(diào) miR-199a2和 DNM3os的表達(dá)，降低ET-1的水平，從而減輕肺動脈高壓［15］。另外，PIGF通過下調(diào) PAX5表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞中 miR-648的表達(dá)，增強ET-1表達(dá)［16］。

在 PAH中，miR-424與 miR-503表達(dá)下調(diào)，抑制內(nèi)皮增殖，抑制內(nèi)皮依賴性中間物分泌，進(jìn)而抑制內(nèi)皮誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖［17］，而這種表達(dá)下調(diào)受肌細(xì)胞增強因子 2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）的調(diào)控。組蛋白去乙?；敢种苿┛梢蕴岣?MEF2的活性，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，對肺動脈高壓動物模型具有治療作用［18］。

2.2.2 miRNA對平滑肌細(xì)胞的調(diào)控作用

2.2.2.1 miRNA影響平滑肌細(xì)胞的收縮性 缺氧使肺血管 miR-190表達(dá)上調(diào)，研究者發(fā)現(xiàn)合成的 miR-190類似物促進(jìn)苯腎上腺素和氯化鉀預(yù)收縮肺動脈的收縮以及肺動脈平滑肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流。電壓門控型鉀通道亞家族 Kcnq5 的 mRNA被證實為 miR-190的靶點。miR-190反義寡核苷酸可有效減輕 miR-190對肺動脈平滑肌細(xì)胞和肺動脈的作用。綜上，miR-190通過促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流，在缺氧誘導(dǎo)肺動脈收縮中起重要作用［19］。

miR-130/301通過調(diào)控 PPARγ調(diào)控肺動脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間一系列的血管收縮因子，如 ET-1，進(jìn)而促進(jìn)肺動脈的收縮［20-21］。

2.2.2.2 miRNA影響平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡 最早發(fā)現(xiàn) miRNA與肺血管平滑肌的關(guān)系是在受傷血管平滑肌中發(fā)現(xiàn)了 miRNA的表達(dá)上調(diào)。在 PAH中，miR-17-5p、miR-21等表達(dá)上調(diào)，miR-124、miR-204等表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，抑制平滑肌細(xì)胞凋亡。

在人肺動脈平滑肌細(xì)胞中，缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的精氨酸酶 II是由 miR-17-5p調(diào)控的，進(jìn)而介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖，且精氨酸酶 II與 miR-17-5p之間存在著反饋［22］。

miR-21在受傷的頸動脈中表達(dá)上調(diào)，而后發(fā)現(xiàn)miR-21通過沉默張力蛋白同源基因（PETN）的表達(dá)及增加bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖［23］。缺氧可誘導(dǎo)人肺動脈平滑肌中 miR-21表達(dá)量增加 3倍，同時伴隨miR-21靶蛋白 PDCD4、SPRY2及 PPARα的下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移［24］。

miR-124通過靶定NFATC1、CAMTA1和 PTBP1基因抑制了活化 T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）活性、磷酸化和核遷移程度，進(jìn)而抑制了肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖能力［25］。

miR-130a在 PAH肺動脈組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，且呈時間依賴性。通過miR-130a模擬物證實 miR-130a促進(jìn)血管平滑肌增殖，且可被其 miR-130a阻斷劑抑制，該作用可能介導(dǎo) PAH肺血管重構(gòu)［26］。

miR-138在缺氧條件下表達(dá)上調(diào)，內(nèi)源性的 miR-138抑制平滑肌細(xì)胞凋亡，抑制 caspase活性同時干擾 bcl-2信號通路。哺乳動物 STE20樣激酶 1（Mst1）是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性酶，其活性以及蛋白激酶 B（Akt）信號通路都在miR-138對肺動脈平滑肌凋亡抑制作用中起重要作用［27］。

miR-204在肺循環(huán)中的功能和數(shù)量要遠(yuǎn)大于其他血管，而 miR-204在 PAH患者和 PAH大鼠的肺動脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)下調(diào)［28］，這種下調(diào)可以使肺動脈平滑肌細(xì)胞呈增殖和抗凋亡表型，且下調(diào)程度與 PAH嚴(yán)重程度相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT-3） 的激活可以抑制miR-204的表達(dá)，使蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP2的表達(dá)上調(diào)，從而激活 Src激酶和 NFAT。NFAT和 SHP2能夠維持PAH-PASMC的增生和抗凋亡作用，而 STAT-3則被認(rèn)為促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和血管壁增厚。另外，miR-204的靶蛋白轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor β，TGF-β）、表皮細(xì)胞生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、叉頭蛋白 C1（forkhead box protein C-1，F(xiàn)OXC-1）、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、多聚 ADP核糖聚合酶 1（poly ADP-ribose polymerase，PARP-1）等都對平滑肌細(xì)胞生理調(diào)節(jié)起著重要作用［29-33］。

miR-206在缺氧肺動脈平滑肌中高表達(dá)，增加平滑肌分化標(biāo)志——α肌動蛋白和鈣調(diào)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和分化。而且，miR-206的過度表達(dá)能夠下調(diào)肺動脈高壓發(fā)病過程一個重要因子——Notch-3的表達(dá)［34］。

miR-210是由 HIF-1α誘導(dǎo)的一種重要的 miRNA。 miR-210可以通過抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子 3（E2F3）的表達(dá)抑制缺氧誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞凋亡［35］。另外，研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-210的表達(dá)能夠提高絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1（mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1）的表達(dá)，抑制人平滑肌細(xì)胞的增殖，但 miR-210過表達(dá)雖然抑制 MKP-1表達(dá)但對細(xì)胞增殖沒有影響［36］。

miR-328在缺氧肺動脈環(huán)中的表達(dá)下調(diào)，通過抑制L型鈣通道的表達(dá)來降低肺動脈收縮和重構(gòu)的程度，且通過抑制胰島素生長因子 I受體（insulin-like growth factor I receptor，IGF-IR）表達(dá)抑制肺動脈平滑肌的凋亡［37］。

通過比較缺氧 miR-451基因敲除大鼠與 miR-451拮抗劑作用的大鼠模型的作用，miR-451對平滑肌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用機制進(jìn)一步被闡明，結(jié)果顯示短暫的抑制miR-451能夠抑制缺氧條件下肺動脈高壓的發(fā)展，但將miR-451敲除則對平滑肌細(xì)胞的增殖及肺動脈高壓的發(fā)展無影響［38］。

2.2.2.3 miRNA促進(jìn)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換 miR-9參與缺氧誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換。研究者發(fā)現(xiàn)，miR-9基因敲除抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和收縮蛋白基因的表達(dá)，而常氧條件下 miR-9的過表達(dá)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖表型。而缺氧條件下通過調(diào)節(jié) HIF-1α上調(diào) miR-9-1和 miR-9-3的表達(dá)，在平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮作用［39］。

miR-17和 miR-21具有促進(jìn)肺動脈平滑肌肌化和血流動力的作用。Pullamsetti等［40］使用 miR-17與 miR-21的拮抗劑降低肺動脈平滑肌的肌化程度。miR-21通過沉默PDCD4基因增加血管平滑肌細(xì)胞中 TGF-β家族誘導(dǎo)的收縮蛋白，從而增強 Pri-miR-21轉(zhuǎn)錄為成熟 miR-21，增強平滑肌細(xì)胞收縮蛋白表達(dá)的能力［41］。

miR-24是平滑肌細(xì)胞中 PGDF-BB和 TGF-β家族的對抗點，參與平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變。血小板源性生長因子（PDGF）和 TGF-β1是調(diào)節(jié)血管生長和重構(gòu)的主要因子，在 PAH中調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。TGF-β1通過Smad通路增加收縮型表型。PDGF-BB誘導(dǎo) miR-24的表達(dá)上調(diào)，沉默 Trp3的表達(dá)，間接減少 smad1表達(dá)［42］。miR-24的過表達(dá)減少 smad2和 smad3，減少 TGF-β介導(dǎo)的 smad2的激活。

2.2.3 miRNA對成纖維細(xì)胞的調(diào)控作用 在 PAH中，成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及炎癥細(xì)胞因子分泌的增加導(dǎo)致肺動脈外膜的重構(gòu)。研究者在 PAH患者及 PH實驗?zāi)Ｐ椭蟹蛛x的成纖維細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了 miR-124表達(dá)的減少。通過模擬物轉(zhuǎn)染使 miR-124過表達(dá)能夠減輕肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。miR-124可抑制單核細(xì)胞趨化蛋白 1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和核糖核酸結(jié)合蛋白 1 （polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP-1）的表達(dá)，通過 Notch1/phosphatase and tensin homolog/FOXO3/p21Cip1 與 p27Kip1抑制成纖維細(xì)胞的增殖和遷移［43］。

2.3 miRNA對 BMPR-II的作用

BMPR-II的失調(diào)或變異被認(rèn)為是多種肺動脈高壓的標(biāo)志［44］。Brock等［45］發(fā)現(xiàn) miR-17/92家族的 miR17-5p和miR-20a靶定肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞上的 BMPR-II。IL-6通過激活 STAT3上調(diào) miR-17/92的表達(dá)，進(jìn)而抑制 BMRP-II的表達(dá)，促進(jìn)肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。miR-17/92還受 c-Myc 及 E2F1調(diào)控［46-47］。miR-20a的抑制劑 antagomiR-20a增強肺組織中 BMPR-II的表達(dá)，同時減輕肺血管壁增厚和微小動脈的閉塞，從而減輕了肺血管重構(gòu)的程度［48］。

miR-21通過骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、BMPR-II及 Rho/Rho-kinase信號通路來實現(xiàn)對肺血管緊張性和舒張性的調(diào)控。缺氧及 BMPR-II可以上調(diào)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞 miR-21的表達(dá)，也可降低 RhoB和 Rho激酶的表達(dá)，進(jìn)而使肺血管收縮［49］。

MiR-143/145位于細(xì)胞平滑肌，它的靶蛋白包括心肌蛋白、平滑肌肌球蛋白重鏈，miR-145在重構(gòu)血管平滑肌表達(dá)上調(diào)。Caruso等［50］通過 PCR手段檢測出在缺氧大鼠肺平滑肌 miR-145表達(dá)增加，BMPR-II變異可以使大鼠和 PAH患者的 miR-145表達(dá)上調(diào)。

3 miRNA在肺動脈高壓治療中的應(yīng)用

隨著 miRNA研究不斷深入，開始出現(xiàn)針對 miRNA的肺動脈高壓治療方法。miRNA靶點的預(yù)測將成為藥物開發(fā)的突破口，目前已經(jīng)有生物信息工具可以預(yù)測 miRNA的靶點［51］。研究者利用 miR-21過表達(dá)試劑，在肺動脈平滑肌中通過鏈霉親和素磁珠檢測發(fā)現(xiàn) miR-21的靶mRNA，通過 Affymetrix微距陣分析發(fā)現(xiàn)其靶基因［52］。

載脂蛋白 A-I模擬肽 4F能夠通過誘導(dǎo) miR-193-3p治療肺動脈高壓。Sharma等［53］通過建立野百合堿以及缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型，發(fā)現(xiàn) 4F干預(yù)組大鼠肺動脈高壓顯著改善，且該作用與 miR-193-3p的上調(diào)相關(guān)，4F通過上調(diào) miR-193-3p抑制脂肪氧合酶和胰島素生長因子 1發(fā)揮作用。

另外，通過 miRNA分析發(fā)現(xiàn) PAH患者血漿白細(xì)胞層miR-451、miR-1246表達(dá)下調(diào)，血漿中 miR-23b、miR-130a 及 miR-190明顯上調(diào)，這些 miRNA都可以成為肺動脈高壓早期診斷的生物標(biāo)志物［54］。

4 展望

miRNA是一類長度 18～26 nt的非編碼單鏈小分子RNA，來源于能夠形成分子內(nèi)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體，由其中的一條臂加工而成。其發(fā)現(xiàn)僅有短暫的幾十年，但因序列、結(jié)構(gòu)以及在各類臟器中穩(wěn)定的表達(dá)，使其成為心血管疾病一個重要的研究靶點。miRNA最大的生物學(xué)特性在于單個miRNA可以調(diào)控作用于多個靶點，同時一個靶基因或蛋白又同時受多個 miRNA調(diào)節(jié)，調(diào)控機制相對復(fù)雜，但又因此特性使 miRNA成為治療肺動脈高壓藥物的潛力靶點。

miRNA主要通過作用于 PAH發(fā)病過程中傳導(dǎo)通路靶蛋白及靶基因而發(fā)揮作用，影響肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡，參與肺血管收縮和重構(gòu)過程的調(diào)節(jié)作用。

miRNA治療可能會出現(xiàn)以下幾個問題：第一，盡管證明了miRNA參與PAH的發(fā)病過程，但如何在PAH中調(diào)控 miRNA成為一個關(guān)鍵問題，需要對 miRNA的信號傳導(dǎo)進(jìn)行深入研究。研究中發(fā)現(xiàn)敲除 miRNA可能會引起通路反饋機制導(dǎo)致治療失效，這是值得注意的問題。miRNA通過傳統(tǒng)方法的導(dǎo)入（如靜脈注射），其調(diào)控作用是否會出現(xiàn)，是否會對其他非目的基因產(chǎn)生影響仍然未知。第二，miRNA的靶基因、靶蛋白在不同細(xì)胞中可能不同，仍需要有更好的方法能夠精確地預(yù)測并驗證 miRNA的靶點，有利于更好地了解其生物功能。第三，miRNA治療需要的長期和短期操控技術(shù)尚未達(dá)到應(yīng)有的水平，治療因子的穩(wěn)定性尚不能保證。第四，miRNA治療同時需要 miRNA水平的增加和減少，目前尚不能精準(zhǔn)調(diào)控。這些都將成為未來miRNA在 PAH領(lǐng)域研究的目標(biāo)。

綜上，miRNA是 PAH發(fā)病過程中的關(guān)鍵分子，研究它對 PAH發(fā)病過程中網(wǎng)絡(luò)信號的調(diào)控機制，可以將對PAH的治療從過去的“一個藥物，一種基因，一種疾病”方式晉升成多靶點藥物治療，既提升了治療效果，又降低了藥物的毒副作用，為更多 PAH患者帶來福音。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.014

國家自然科學(xué)基金青年項目（81302764）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金資助課題新教師類（20122307120011）；黑龍江省自然科學(xué)基金（QC2011C021）；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新基金項目

150081哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

姚麗，Email：yaoli197966@tom.com

2014-12-12