方麗婷 李俊 吳偉虎（廣西-東盟經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)（南寧華僑投資區(qū)）動物衛(wèi)生監(jiān)督所 530105）

奶水牛子宮內(nèi)膜炎病原菌鑒定與藥敏試驗

方麗婷 李俊 吳偉虎（廣西-東盟經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)（南寧華僑投資區(qū)）動物衛(wèi)生監(jiān)督所 530105）

通過對南寧的某奶水牛場中的12頭患子宮內(nèi)膜炎奶水牛進行子宮采樣和調(diào)查，并在無菌條件下，對采集的樣本進行了病原菌的分離鑒定和藥物敏感性試驗。分離純化培養(yǎng)得到38種細菌，沒有發(fā)現(xiàn)真菌。藥物敏感性試驗結(jié)果表明，葡萄球菌對紅霉素、克林霉素、米諾環(huán)素、諾氟沙星、頭孢吡肟高度敏感，對復(fù)方新諾明、氨曲南等產(chǎn)生了不同程度的耐藥性；奈瑟氏菌對克拉霉素、頭孢吡肟高度敏感，對復(fù)方新諾明、氨曲南產(chǎn)生了不同程度的耐藥性；非發(fā)酵菌和腸桿菌科對頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南等有較高的敏感性，對氨芐西林、哌啦西林、氧氟沙星、鏈霉素等產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。

奶水牛；子宮內(nèi)膜炎；病原菌；分離鑒定；藥敏試驗

1 試驗?zāi)康?/h2>

由于近年來，人們不合理地使用抗生素類藥物，導(dǎo)致具有耐藥性菌株越來越多，藥物殘留也越來越嚴(yán)重，造成不同地區(qū)和不同環(huán)境引起子宮內(nèi)膜炎的致病菌都有所不同，使得奶水牛子宮內(nèi)膜炎的治療難度越來越大，要求也越來越高。而且奶水牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病依然比較高，給奶水牛養(yǎng)殖業(yè)帶來相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

因此，本試驗通過對南寧某奶水牛場中的患子宮內(nèi)膜炎奶水牛進行了子宮采樣和調(diào)查，并在無菌條件下，對采集的樣本進行了病原菌的分離鑒定，并進行藥物敏感性試驗，耐藥性分析。為了更好地了解當(dāng)?shù)氐淖訉m內(nèi)膜炎的病原菌的細菌種群，篩選出抑菌效果明顯的藥物，為臨床治療奶水牛子宮內(nèi)膜炎及用藥提供理論依據(jù)。

2 試驗材料

2.1 試驗樣品來源

本試驗樣品是按照臨床型奶水牛子宮內(nèi)膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)選取南寧附近某牛場的12頭患病奶水牛。清洗病牛陰部，用直腸檢查的方法用手握住子宮頸，使子宮內(nèi)黏液流出陰道。棄去最初流出黏液，用已經(jīng)消毒好的青霉素瓶收集中間或最后流出的黏液，密封，做好標(biāo)記，迅速帶回實驗室做細菌的培養(yǎng)分離鑒定[1]。

2.2 主要培養(yǎng)基及制備

2.2.1 營養(yǎng)肉湯（北京陸橋）

準(zhǔn)確稱取成品李氏菌增菌肉湯2.2g，放入燒杯中，加入100ml蒸餾水，加熱溶解，分裝試管5ml每管，高壓滅菌l5min，待冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 營養(yǎng)瓊脂02.2.5（北京奧博星）

準(zhǔn)確稱取成品營養(yǎng)瓊脂3.3g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱煮沸至溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃時倒制成平板，待凝固，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 Fungi Medium真菌培養(yǎng)基CM802（北京陸橋）

準(zhǔn)確稱取成品Fungi Medium真菌培養(yǎng)基2.85g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃時倒制成平板，待凝固后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 MH血瓊脂基礎(chǔ)CM177（北京陸橋）

準(zhǔn)確稱取成品MH血瓊脂基礎(chǔ)3.8g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15min，冷至50℃，每瓶加入10ml新鮮無菌家兔血，倒制成平板，制成9%血液瓊脂培養(yǎng)基，待凝固，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 麥康凱瓊脂CM908（北京陸橋）

準(zhǔn)確稱取成品麥康凱瓊脂5.5g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃時倒制成平板，待凝固后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.6 SS瓊脂HB4089（青島海博）

準(zhǔn)確稱取成品SS瓊脂6.35g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃時倒制成平板，待凝固后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.7 伊紅美藍瓊脂（EMB）02.0.2（北京奧博星）

準(zhǔn)確取成品伊紅美藍瓊脂4.25g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃時倒制成平板，待凝固后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 試驗方法

3.1 細菌的培養(yǎng)分離及純化

按照無菌操作，取出樣品，搖勻后用移液器吸取100μl注入普通瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，再用推棒來回推動，使之在普通瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)分布均勻。待稍干后倒置放入電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，取出觀察并記錄菌落生長情況。如果細菌太多無法分離時，進行倍比稀釋后再涂布平板分離。對生長的可疑菌落，結(jié)合菌落特征、涂片染色鏡檢特征，標(biāo)記菌株號，并挑取單個菌落進行純化，再涂片，染色鏡檢。若鏡檢無雜菌，再接種于肉湯中，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24h，觀察細菌在肉湯中的生長情況，并進行涂片、染色、鏡檢，做好試驗記錄和標(biāo)記，作為鑒定菌種，同時保存?zhèn)浞菥N，低溫冷藏于冰箱[2]。

3.2 細菌的形態(tài)觀察

對各細菌菌落的生長情況和形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進行觀察記錄，并將純化的細菌進行革蘭氏染色、鏡檢，鏡檢后對尚未純化的細菌從新分離培養(yǎng)及純化。

3.3 細菌的生化鑒定

參照《獸醫(yī)微生物實驗指導(dǎo)》[3]《伯杰細菌鑒定手冊》[4]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]中的細菌分群方法，并根據(jù)菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色特征及鏡檢形態(tài)等將各分離純化的細菌進行初步確定細菌類屬，確定其生化反應(yīng)和其他鑒定項目。并將其分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h后供生化試驗用。

3.4 藥敏試驗

參照中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布的《動物及其制品中細菌耐藥性的測定-紙片擴散法》中的標(biāo)準(zhǔn)，選擇藥物進行藥物敏感性試驗。

4 試驗結(jié)果

4.1 細菌分離純化培養(yǎng)結(jié)果

從試驗樣品中分離純化培養(yǎng)共得到38株菌株，沒有發(fā)現(xiàn)真菌。將經(jīng)過純化的38株細菌根據(jù)形態(tài)、生長特征和生化特性鑒定，分別為：1、12、13、15、16號菌株是表皮葡萄球菌；8、11、18、23、27、37號菌株是木糖葡萄球菌；4、5、10、22、38號菌株是溶血葡萄球菌；35號菌株是腐生葡萄球菌；14號菌株是金黃色葡萄球菌；20、28號菌株是微球菌；17號菌株是黏液奈瑟氏菌；19號菌株是卡他布蘭漢氏菌；36號菌株是金黃奈瑟氏菌；6、29、30、32號菌株是惡臭假單胞菌；24號菌株是類產(chǎn)堿假單胞菌；31、34號菌株是醋酸鈣不動桿菌；2、7、9、33號菌株是黃桿菌（ⅡB群）；21號菌株是缺陷假單胞菌；3號菌株是施氏假單胞菌和25、26號菌株是大腸埃希氏菌。

4.2 藥敏試驗結(jié)果

從《動物及其制品中細菌耐藥性的測定-紙片擴散法》中選定藥物對12份試驗樣品中分離鑒定出來的16種細菌進行藥敏試驗，藥物敏感性參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）《抗生素敏感性試驗紙片擴散法操作標(biāo)準(zhǔn)》。

藥物敏感性試驗結(jié)果表明，葡萄球菌對紅霉素、克林霉素、米諾環(huán)素、諾氟沙星、頭孢吡肟高度敏感，對復(fù)方新諾明、氨曲南等產(chǎn)生了不同程度的耐藥性；奈瑟氏菌對克拉霉素、頭孢吡肟高度敏感，對復(fù)方新諾明、氨曲南產(chǎn)生了不同程度的耐藥性；非發(fā)酵菌和腸桿菌科對頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南等有較高的敏感性，對氨芐西林、哌啦西林、氧氟沙星、鏈霉素等產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。

5 討論與小結(jié)

從分離培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，該奶水牛場患病奶水牛大部分是混合感染，大多數(shù)都是由2種或者2種以上的病原菌引起的。這可能與該牛場的飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)管理條件有關(guān)。所以在臨床抗菌藥物的使用中，應(yīng)考慮停用對細菌不敏感的藥物，治療中建議采取聯(lián)合用藥方法，不能隨意加大劑量，避免耐藥性產(chǎn)生，從而取得最佳療效。

藥敏試驗結(jié)果表明，紅霉素、克林霉素、米諾環(huán)素、諾氟沙星、頭孢吡肟等藥物對葡萄球菌屬的菌株敏感或高度敏感；克拉霉素、頭孢吡肟等藥物對奈瑟氏菌屬菌株敏感或高度敏感；頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南等藥物對非發(fā)酵菌屬和腸桿菌科的菌株敏感。以上的藥物可作為奶牛子宮內(nèi)膜炎的首選藥物。

本試驗受設(shè)備的限制，沒有進行厭氧菌和真菌的分離培養(yǎng)，但是不能排除尚有厭氧菌和真菌感染的可能。本試驗從患病奶水牛分離到了多種細菌，但這并不一定意味著它們都是子宮內(nèi)膜炎的直接致病因子。它們中多數(shù)為環(huán)境中常見菌，有些可能只是繼發(fā)性感染。至于具體哪種或哪幾種細菌是子宮內(nèi)膜炎的直接致病菌，有待進一步研究。

[1]Azawi OI.Postpartum uterine infection in cattle[J].Animal Reproduction Science,2008,105（3）：187-208.

[2]覃慶玉,畢芳芳,張朝勝,楊照海,何寶祥,等.南寧市郊奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定[J].廣西畜牧獸醫(yī),2009,25（2）：74-75.

[3]姚火春.獸醫(yī)微生物實驗指導(dǎo)（第二版）[M].中國農(nóng)業(yè)出版社,2002,1.

[4][美]R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等.伯杰細菌鑒定手冊（第八版）[M].科學(xué)出版社,1984.

[5]東秀珠,蔡妙英,等.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社,2001,2.