王 晗 羅向霞 李 歡 馮玉沛

化學(xué)誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型研究進(jìn)展

王 晗1羅向霞2李 歡1馮玉沛1

糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型的制備方法有多種，其中化學(xué)誘導(dǎo)的動物模型因其來源簡單、方法簡便、經(jīng)濟(jì)、并發(fā)癥少等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。本文就現(xiàn)在常用的化學(xué)誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型的構(gòu)建、藥物類別、使用劑量、給藥途徑、成模標(biāo)準(zhǔn)、動物種屬、成模時間等方面進(jìn)行闡述，同時簡要說明體內(nèi)成像技術(shù)在這些模型中的特征性表現(xiàn)，為研究人員了解以及選擇合適的動物模型進(jìn)行研究提供參考。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；化學(xué)誘導(dǎo)；動物模型

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是由糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）引起的一種眼部慢性并發(fā)癥，同時是世界各地糖尿病患者致盲的主要原因之一。對于DR的了解，只能通過深入對其發(fā)病機(jī)制的研究來實現(xiàn)，然而，研究過程復(fù)雜而漫長，不能輕易將人類作為受試者。為了研發(fā)新的更好的藥物及防治方法，動物模型在此過程中至關(guān)重要。根據(jù)動物模型的不同制備方法，我們將常用的DR模型分為胰腺部分切除模型、轉(zhuǎn)基因模型、自發(fā)性遺傳性模型以及化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)性模型4種。其中化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)性模型通過化學(xué)藥物破壞胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素生成減少，引起動物糖尿病。其誘發(fā)的糖尿病模型因具有造模時間短，發(fā)病率高，病情發(fā)展較統(tǒng)一等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，本文就該動物模型的相關(guān)情況綜述如下。

1 造模試劑

我國目前常用的化學(xué)誘導(dǎo)試劑主要有四氧嘧啶（alloxan，ALX）和鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）等。

1.1 四氧嘧啶（ALX）

自從1943年ALX被發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)家兔胰島β細(xì)胞壞死以來，已被作為糖尿病動物模型誘導(dǎo)劑使用至今〔1〕。ALX誘導(dǎo)的糖尿病動物模型在病理生理上與人類1型糖尿病相似。其價格便宜，來源廣泛，但對肝腎危害較大，動物致死率較高。另外，值得注意的是，大劑量ALX可使犬、貓等動物產(chǎn)生永久性糖尿病，但部分嚙齒類動物（如鼠）形成的糖尿病可自發(fā)緩解。

1.2 鏈脲佐菌素（STZ）

Rakieten等〔2〕在1963年就指出STZ可致狗和大鼠患糖尿病。STZ對動物腎臟、免疫組織等均有毒性，但較ALX輕。鏈脲佐菌素可誘導(dǎo)1型或2型糖尿病，其中2型糖尿病成模率較四氧嘧啶高，且成模后能維持穩(wěn)定的高血糖狀態(tài)〔3〕。

由于STZ與ALX有不同的優(yōu)缺點，有研究人員嘗試兩藥聯(lián)合誘導(dǎo)，減少二者劑量，既降低了單用ALX對肝、腎的損害，又彌補(bǔ)了單用STZ劑量過大導(dǎo)致動物死亡或劑量過小所致成模率低的不足。

1.3 其他藥物

除了常用的STZ及ALX外，也有研究人員使用其他試劑或者多種試劑聯(lián)合應(yīng)用成功誘導(dǎo)了糖尿病動物模型。肖樂等〔4〕在注射ALX前5 min經(jīng)兔耳緣靜脈注射地塞米松2.5 mg（0.5 ml），比單純注射ALX的動物成模效果佳。梁志峰等〔5〕的實驗結(jié)果顯示，中劑量（100 mg/kg腹腔注射×2）ALX配伍高劑量（2 mg/kg腹腔注射×4）阿托品制作糖尿病動物模型效果較好，能顯著提高成模率，降低死亡率并使血糖維持較高且穩(wěn)定的水平。Sasaki等〔6〕給ICR新生小鼠皮下注射谷氨酸鈉2 mg/g，順利誘發(fā)糖尿病。張小華等〔7〕用高脂飼料加地塞米松隔日腹腔注射，成功建立實驗性胰島素抵抗大鼠模型。另外，有實驗結(jié)果〔8〕顯示，STZ（30 mg·kg-1·d-1）及弗氏完全佐劑（CFA）0.1 ml聯(lián)合腹腔注射，亦可成功誘導(dǎo)糖尿病模型，長期可出現(xiàn)晶狀體、視網(wǎng)膜等部位的眼部并發(fā)癥。以上方法由于操作繁瑣復(fù)雜，或技術(shù)要求高，或造模周期過長等，均未能大范圍普及，但不失為可選的造模方法，研究人員可根據(jù)自身條件選取合適的試劑。

2 用藥劑量

無論是ALX還是STZ等其他誘導(dǎo)劑，目前均沒有統(tǒng)一的劑量標(biāo)準(zhǔn)。對此，研究人員進(jìn)行了一系列探索，為求以最小的劑量誘導(dǎo)出最成功的模型。

2.1 使用ALX誘導(dǎo)

代小思等〔9〕采用150～160 mg/kg劑量的ALX對雌性SD大鼠腹腔注射，建立了成模率低，但穩(wěn)定且長期存活的1型糖尿病動物模型。李羨筠等〔10〕將SPF級雄性昆明種小鼠禁食后，以不同劑量腹腔注射ALX。結(jié)果顯示，180 mg/kg劑量的成模率和死亡率均高于160 mg/kg劑量，但后者造模血糖平穩(wěn)上升，維持時間長。因此認(rèn)為160 mg/kg劑量注射后造模效果比180 mg/kg劑量好。另外亦有諸多學(xué)者〔11〕表示運(yùn)用中等劑量成模率高，由此我們可以假設(shè)，對于一般品系的嚙齒類動物，腹腔注射ALX，160 mg/kg為最適劑量。

2.2 使用STZ誘導(dǎo)

STZ的用量一般波動在50～60 mg/kg之間。周琳等〔12〕按60mg/kg單次劑量對SD大鼠腹腔注射，造模成功率僅為82.5%。郭學(xué)軍等〔13〕將Wistar大鼠隨機(jī)分為中劑量組（55 mg/kg）和高劑量組（65 mg/kg），高劑量組成模率不及中劑量組，且死亡率高。但中劑量組成模率亦不及一些文獻(xiàn)報道的可達(dá)80%～90%。由此可見，STZ的用量仍沒有固定標(biāo)準(zhǔn)，筆者推斷這種不確定性主要有三方面因素。第一，STZ的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，配制過程中要求避光低溫保存，且必須現(xiàn)配現(xiàn)用，操作不當(dāng)，易失活影響藥效；第二，實驗大鼠間個體差異較大，存在實驗室環(huán)境、地域差別等；第三，腹腔注射藥物時誤入皮下或腹腔臟器導(dǎo)致藥物流失〔13〕。

3 給藥途徑

嚙齒類動物模型誘導(dǎo)劑給藥途徑一般有尾靜脈注射、皮下注射和腹腔注射。何學(xué)令等〔14〕將SD大鼠分別給予靜脈和腹腔兩種給藥方式，靜脈給藥相對腹腔給藥動物的癥狀及血糖水平穩(wěn)定性均較理想。因此，制作糖尿病模型采用靜脈給藥效果優(yōu)于腹腔給藥。少數(shù)研究人員〔11〕采用皮下注射方法，將SD大鼠皮下注射ALX水溶液，亦能順利造出成模率高，死亡率低，穩(wěn)定的模型。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，盡管靜脈注射的用量較小，成模率高，但由于其操作較腹腔注射、皮下注射技術(shù)要求高，同時皮下注射試劑用量較大，實驗人員最常用的方法仍為腹腔注射。

4 成模標(biāo)準(zhǔn)

目前常用的成模標(biāo)準(zhǔn)主要考慮空腹血糖以及尿糖兩方面，一般為誘導(dǎo)劑注射后3 d空腹血糖值≥16.7 mmol/L，尿糖++～+++提示造模成功。但部分研究人員〔15-18〕認(rèn)為以11.1 mmol/L、12 mmol/L、13.9 mmol/L、14 mmol/L等作為標(biāo)準(zhǔn)較為合適。而對于廣西巴馬小型豬，相關(guān)研究者則認(rèn)為連續(xù)2次空腹血糖大于6.3 mmol/L即可。成模血糖水平雖然不盡相同，但都是根據(jù)人體正常血糖值與動物正常血糖值對比換算而得出，理論依據(jù)基本相同。有學(xué)者〔13〕經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）在動物實驗中比空腹血糖監(jiān)測更有診斷意義，不易造成漏診。但鑒于空腹血糖值測定簡便易行，仍然為多數(shù)研究者所采用。

5 造模動物種屬

郭學(xué)軍等〔13〕通過腹腔注射STZ制作SD和Wistar大鼠糖尿病模型，注射相同劑量，Wistar大鼠成模率和死亡率均高于SD大鼠。唐東紅等〔19〕則選用恒河猴進(jìn)行糖尿病視網(wǎng)膜并發(fā)癥造模，成功誘導(dǎo)出不同程度的糖尿病視網(wǎng)膜并發(fā)癥。近期，有學(xué)者指出〔20〕，雖然嚙齒類動物具有和人類視網(wǎng)膜病變類似的病理變化，但是由于嚙齒類動物視網(wǎng)膜沒有黃斑，不能作為糖尿病性黃斑水腫的動物模型。其慢性炎性病變亦不能與人類炎癥反應(yīng)很好地吻合，所以他們嘗試選用雞胚作為受試動物來研究視錐細(xì)胞的功能，以更新此領(lǐng)域的研究認(rèn)識。

熒光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA）是檢查DR血管病變的重要方法，為了解有或無色素動物FFA圖像及視網(wǎng)膜血管消化鋪片的差異，周偉等〔21〕使用MicronⅢ視網(wǎng)膜影像系統(tǒng)，對不同品系DR大鼠模型進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BN大鼠由于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞黑色素的存在，消除了背景熒光的干擾，更容易發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜血管改變，F(xiàn)FA成像效果明顯優(yōu)于SD大鼠，提示可用BN類有色素大鼠替代無色素大鼠（SD或Wistar）進(jìn)行DR研究，若僅需判斷視網(wǎng)膜血管有無異常時，可采用FFA活體檢查技術(shù)替代離體的視網(wǎng)膜血管消化鋪片、熒光鋪片等方法，以減少實驗動物的數(shù)量，提高實驗效率。

6 成模時間

當(dāng)前的DR動物模型均建立在糖尿病動物模型基礎(chǔ)上，但并不能認(rèn)為所有造模成功的糖尿病動物均能出現(xiàn)DR。有研究表明〔22〕，STZ注射4周后，部分實驗大鼠的視網(wǎng)膜出現(xiàn)DR背景期的改變，與周偉等〔21〕人的觀察結(jié)果一致。但劉玉等〔23〕發(fā)現(xiàn)，成模后2個月，C57BL/6小鼠仍未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管改變，與上述結(jié)果截然相反。經(jīng)過4個月或更長病程，有研究人員〔24〕發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠的視網(wǎng)膜組織學(xué)表現(xiàn)顯示視網(wǎng)膜組織水腫，細(xì)胞排列紊亂。在細(xì)胞層面上，宋晗等〔25〕人發(fā)現(xiàn)Wistar糖尿病鼠5個月組視網(wǎng)膜水腫較3個月重，內(nèi)、外顆粒層細(xì)胞排列紊亂，界線消失，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和顆粒層空泡樣變性明顯，可見血管樣結(jié)構(gòu)。血管形態(tài)方面，段慧慧等〔26〕將SD大鼠造模成功后飼養(yǎng)6個月，視網(wǎng)膜血管基底膜增厚，毛細(xì)血管排列紊亂，管腔粗細(xì)不等，或節(jié)段膨大或退化，血管管腔閉鎖形成無細(xì)胞毛細(xì)血管。但未見毛細(xì)血管瘤。

由以上研究結(jié)果可見，成功誘導(dǎo)動物致糖尿病后，并不能表示已有眼部并發(fā)癥發(fā)生。血糖水平、控制程度、個體差異等的不同，DR出現(xiàn)及發(fā)展的時間也不同，我們無法精確地計算。由于動物患糖尿病后存活時間短，而常規(guī)糖尿病視網(wǎng)膜病變造模周期長且不可預(yù)期，所以董白霞等〔27〕采用了STZ腹腔注射造成SD大鼠糖尿病模型1個月后行玻璃體注射血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的方法制造增殖性糖尿病眼底病變模型。大鼠不僅出現(xiàn)了臨床中常見的非增殖期病變，還觀察到了視網(wǎng)膜新生血管這種增殖期糖尿病性視網(wǎng)膜病變特有的體征。這種方法大大縮短了造模時間，保證了動物的成活率，為研究增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變提供了快捷方法。

綜上，我們可以看出，對于不同時間，不同研究人員以及不同的實驗動物，實驗結(jié)果不盡相同甚至截然相反，筆者認(rèn)為這種結(jié)果與實驗動物的個體差異以及實驗人員的操作等因素密切相關(guān)。

7 小結(jié)

動物疾病模型的設(shè)計原則，也是創(chuàng)新和選用動物疾病模型的出發(fā)點，相似性、可重復(fù)性、可靠性、適用性、可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性均是需要考慮的問題。我們應(yīng)對目前可用的DM模型進(jìn)行系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化研究，確定各種模型的差異性、相似性與可重復(fù)性，包括各種結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變的頻率、程度和時段，以及測量評估的標(biāo)準(zhǔn)。總之，研究者應(yīng)明確不同類型動物模型各自的特征和局限性，應(yīng)根據(jù)研究目的、實驗要求和經(jīng)費(fèi)等具體情況，選擇合適的動物模型〔28〕。另外，在實驗操作過程中，應(yīng)嚴(yán)格要求，操作規(guī)范，以規(guī)避各種由于研究人員操作不當(dāng)?shù)仍斐傻氖д`，以免影響實驗結(jié)果。

［1］尤杰，孫兆林，季宇彬，等.糖尿病動物模型的種類與研究進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)，2012，21（9）:1-4.

［2］Rakieten N，Rakieten ML，Nadkarin MV.Studies on the diabetogenic action of streptozotocin（NSC-37917）［J］.Cancer Chemother Rep，1963，29（7）:91-98.

［3］周珺，張汝學(xué)，賈正平.不同糖尿病動物模型的特點比較［J］.國際內(nèi)分泌代謝雜志，2010，30（4）:273-276.

［4］肖樂，龔昆梅，王昆華，等.地塞米松預(yù)處理在四氧嘧啶誘導(dǎo)1型糖尿病兔模型中的價值［J］.中國實用醫(yī)刊，2011，38（18）:1-2，6.

［5］梁志鋒，林軍，黃晶，等.阿托品對四氧嘧啶糖尿病動物模型的影響［J］.中醫(yī)臨床康復(fù)，2006，10（28）:76-78.

［6］Sasaki Y，Suzuki W，Shimada T，et al.Dose dependent development of diabetes mellitus and non-alcoholic steatohepatitis in monosodium glutamate-induced obese mice［J］.Life Sci，2009，85（13-14）: 490-498.

［7］張小華，張汝學(xué)，賈正平，等.高脂飲食和地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)胰島索抵抗大鼠模型［J］.中國實驗動物學(xué)報，2008，16（5）:325-329.

［8］崔傳寶，陳美娟，史書龍.糖尿病并發(fā)癥模型研究進(jìn)展［J］.臨床合理用藥，2014，2（7）:196-198.

［9］代小思，康健，萬芮菡，等.四氧嘧啶誘導(dǎo)1型糖尿病動物模型的建立［J］.局解手術(shù)學(xué)雜志，2011，20（1）:20-21.

［10］李羨筠，陳曉琴，鄭艷艷，等.不同劑量四氧嘧啶對制備糖尿病小鼠模型的影響［J］.職業(yè)與健康，2011，27（23）:2714-2715.

［11］古筱茹.不同劑量四氧嘧啶皮下注射對大鼠糖尿病模型穩(wěn)定性的影響［J］.天津藥學(xué)，2007，19（1）:16-17.

［12］周琳，于強(qiáng)，陳瀟，等.復(fù)方血栓通膠囊對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜抗缺氧及抗氧化能力的影響［J］.中華眼視光學(xué)與科學(xué)雜志，2012，14（1）:41-46.

［13］郭學(xué)軍，鄒移海，吳凌，等.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)SD和Wistar大鼠糖尿病模型的影響因素［J］.中國實驗動物學(xué)報，2008，16（4）:301-304.

［14］何學(xué)令，尹海林.四氧嘧啶劑量和給藥途徑對制作糖尿病大鼠模型的影響［J］.四川動物，2003，22（4）:255-257.

［15］周志文，宋成武，王松笛，等.海南苦丁茶的降血糖作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（10）:2380-2381.

［16］宋吻，樸松蘭，盛春華，等.STZ誘導(dǎo)C57BL小鼠T1DM模型優(yōu)化的研究［J］.中國實驗診斷學(xué)，2007，11（1）:36-39.

［17］Barber A J，Antonetti D A.Mapping the blood vessels with paracellular permeability in the retinas of diabetic rats［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（12）:5410-5416.

［18］Khaled A.Hussein，Karishma Choksi，et al.Bone morphogenetic protein 2:A potential new player in the pathogenesis of diabetic retinopathy［J］.Experimental Eye Research，2014，125:79-88.

［19］唐東紅，代解杰，蔣祿芝，等.STZ誘發(fā)實驗恒河猴糖尿病性視網(wǎng)膜并發(fā)癥模型的建立［J］.中國實驗動物學(xué)報，2002，10（3）:173-176.

［20］Liheng Shi，Michael L Ko，Cathy Chia-Yu Huang，et al.Chicken Embryos as a Potential New Model for Early Onset Type I Diabetes［J］.Journal of Diabetes Research，2014:354094.

［21］周偉，靳春杰，孟兆聯(lián)，等.糖尿病視網(wǎng)膜病變模型鼠品系的選擇［J］.中華實驗眼科雜志，2014，32（1）:32-35.

［22］Kowalczuk L，Touchard E，Omri S，et al.Placental growth factor contributes to micro-vascular abnormalization and blood-retinal barrier breakdown in diabetic retinopathy［J］.PLoS One，2011，6（3）: e17462.

［23］劉玉，藺濤，雷博.比較研究C57BL/6和eNOS-/-小鼠1型糖尿病模型的視網(wǎng)膜病變［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，32（12）: 1683-1688.

［24］江志堅，董健鴻，王惠英，等.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立Spragur-Dawley大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變模型的評價［J］.上海醫(yī)學(xué)，2010，33（1）:85-86.

［25］宋晗，滕巖，馬秋莎.糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型的實驗研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2014，43（4）:134-136.

［26］段惠惠，黃建梅，于素云，等.STZ糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變模型的再評價［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（5）:12-18.

［27］董白霞，馬景學(xué)，葉存喜，等.增殖型糖尿病性視網(wǎng)膜病變動物模型的建立［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2012，34（12）:1218-1222.

［28］王應(yīng)利，惠延年.糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型選擇的注意事項［J］.中華眼科雜志，2012，48（7）:587-590.

Research progress of chemical induction diabetic retinopathy animal models

WANG Han，LUO Xiangxia，LI Huan，et al.Gan-su University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，Gansu，China

There are many different kinds of preparation methods to make animal models of diabetic retinopathy.Chemical induced animal models are widely used because of its simple source and method，cheap and less complications.This article showed the method，drug category，dosage，drug-delivery way，standards，animal species and time for success，etc，and briefly introduced the expression by body characteristic imaging technology in these models.It provided the reference for researchers to understand and choose the suitable animal model for research.

diabetic retinopathy；chemical induction；animal models

R774.1

A

1002-4379（2015）04-0297-03

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.04.020

1甘肅中醫(yī)學(xué)院（2014級中醫(yī)五官科學(xué)研究生），蘭州730000

2甘肅省中醫(yī)院，蘭州730050

羅向霞，E-mail:279089608@qq.com