吳 婷，王 敏，蘇 欣，施 毅

近年來免疫抑制人群逐漸增加，真菌已成為此類人群罹患感染性疾病最主要的病原體。隨著全球真菌感染發(fā)病率的增加，致死率高，對真菌感染疾病認識不足、診斷困難、抗真菌藥物療效有限且已出現(xiàn)耐藥的現(xiàn)狀都是臨床工作中面臨的困難，因此急需開拓新的治療方向以應(yīng)對真菌感染［1］?？拐婢幬锍藢φ婢闹苯託缱饔猛?，還可以通過激活機體固有免疫應(yīng)答而抵御真菌感染。故本文圍繞廣譜抗真菌藥物對固有免疫應(yīng)答的影響，尤其是抗真菌藥物與Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）在觸發(fā)固有免疫應(yīng)答間的關(guān)系作一綜述。

1 真菌與抗真菌藥物

1.1 真菌感染現(xiàn)狀

自然界中約存在150萬種真菌，其中僅150～400種能感染人類［2］。免疫抑制人群可發(fā)生從淺表至深部直至一系列機會性真菌感染。在地方性真菌病流行的發(fā)展中國家，免疫抑制和免疫健全人群都可罹患真菌感染［3］。在所有侵襲性真菌感染（invasive fungal infections，IFI）中，念珠菌是最主要的病原體，占70%～90%，其次是曲霉，占10%～20%，第3 位是隱球菌［4］。IFI具有高患病率和病死率，即使抗真菌治療能帶來獲益，但對有危險因素的患者而言真菌感染仍是醫(yī)院獲得性感染的第4大病原體［5］。

1.2 抗真菌藥物

兩性霉素B是多烯類抗真菌藥物，選擇作用于真菌細胞膜上的麥角固醇，在膜上形成微孔，使細胞內(nèi)K＋、核苷酸、氨基酸等物質(zhì)外滲，無用物質(zhì)或有毒物質(zhì)滲入而致真菌死亡。兩性霉素抗菌譜廣，作用于念珠菌、隱球菌、毛霉、曲霉等引起的系統(tǒng)性感染，是重癥真菌感染治療的基石［6］。脫氧膽鹽兩性霉素B（deoxycholate AmB）是兩性霉素B的常規(guī)劑型，脂質(zhì)體兩性霉素B（liposomal AmB）劑型易于吸收［5］。棘白菌素類是新型抗真菌藥物，能抑制1，3-β-葡聚糖合成酶而抑制真菌細胞壁1，3-β-葡聚糖合成，從而破壞真菌細胞壁結(jié)構(gòu)致真菌破裂死亡［7］。1，3-β-葡聚糖不僅是細胞壁結(jié)構(gòu)，也是C型凝集素受體家族（C-type lectins receptors，CLR）中樹突狀細胞相關(guān)性C型植物血凝素1（Dectin-1）的配體，刺激宿主細胞TLR、CLR這類固有免疫受體，觸發(fā)免疫應(yīng)答［8］。棘白菌素類也能激活吞噬作用和促炎應(yīng)答，其抗菌譜覆蓋念珠菌、曲霉、肺孢菌等［7］。三唑類可用于系統(tǒng)性真菌感染，包括氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑。其能抑制羊毛甾醇14α-去甲基化酶素P450酶這一細胞色素P450蛋白超家族一員，從而抑制真菌細胞膜麥角固醇生物合成［9］。具有口服吸收特性的三唑類可用于治療輕癥或重癥真菌感染，如氟康唑治療念珠菌陰道炎，伏立康唑治療曲霉感染。

2 抗真菌藥物與固有免疫關(guān)系

眾所周知，微生物與抗菌藥物、微生物與免疫系統(tǒng)之間存在直接作用，此外，抗菌藥物對免疫系統(tǒng)也起直接調(diào)節(jié)作用，可表現(xiàn)在調(diào)節(jié)吞噬作用、趨化作用、內(nèi)毒素釋放、細胞因子產(chǎn)生、免疫抑制后造血干細胞恢復(fù)、增強或抑制細胞凋亡等方面。如抗菌藥物的代表喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類即具有多種免疫調(diào)節(jié)作用。

固有免疫是抵抗肺部真菌感染的第一道防線，抗真菌藥物能協(xié)同宿主吞噬細胞共同抵抗感染組織中的微生物［10］，在體內(nèi)、體外實驗中都表現(xiàn)出與效應(yīng)細胞的協(xié)同作用［4］。在無真菌感染條件下，單純給予兩性霉素B 刺激人原代單核細胞、THP-1 細胞、HEK293細胞可 生成炎 性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8，細胞因子單核細胞趨化蛋白（MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白（MIP-1β）和IL-8，前列腺素（PG）和一氧化氮（NO）［11］。確診或擬診真菌感染的粒細胞缺乏患者，持續(xù)3 d給予兩性霉素B 后其血清中TNF-α、IL-6、IL-1-RA 增多［12］。上述結(jié)果提示兩性霉素B 可激活固有免疫反應(yīng)，刺激多種細胞因子、炎性因子產(chǎn)生。早在20 世紀(jì)90 年代，Garcha等［13］證實唑類藥物與小鼠巨噬細胞、人中性粒細胞、單核細胞和單核細胞源的巨噬細胞協(xié)同殺滅真菌；Van′t Wout等［14］證實兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑能抑制巨噬細胞內(nèi)念珠菌的芽管萌發(fā)；Roilides等［15］證實兩性霉素B、氟胞嘧啶、酮康唑、氟康唑、Sch-39304（三唑類）、西洛芬凈（LY121019）6種抗真菌藥物在體外中性粒細胞應(yīng)對念珠菌感染中起免疫調(diào)節(jié)作用。近期，陸續(xù)有報道新型抗真菌藥物唑類和棘白菌素類的免疫調(diào)節(jié)作用［16-17］。Choi等［16］證實抗菌藥物（莫西沙星）和抗真菌藥物可調(diào)節(jié)免疫，抗真菌藥物在體外應(yīng)對煙曲霉感染的免疫應(yīng)答時可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

三類抗真菌藥物在殺滅真菌的同時與固有免疫系統(tǒng)協(xié)同作用，增強機體固有免疫系統(tǒng)對入侵病原體的抵御。TLR 類模式識別受體是這一過程中最重要的成分。TLR 在有免疫功能的組織及與外界環(huán)境相交通的呼吸道、胃腸道上都有表達，在免疫系統(tǒng)應(yīng)對病原體入侵時識別病原體。人類已發(fā)現(xiàn)10種TLR（TLR1～TLR10），可識別病原體表面的病原相關(guān)模式分子（pathogen associated microbial patterns，PAMP）或者危險相關(guān)模式分子（dangerassociated molecular patterns，DAMP）［18］。TLR1識別的PAMP 是革蘭陽性菌；TLR2 識別多種細菌、真菌、病毒和特定的內(nèi)源性結(jié)構(gòu)；TLR4 識別革蘭陰性菌的脂多糖；TLR9在多種免疫細胞如樹突狀細胞、B淋巴細胞、單核細胞、自然殺傷細胞上表達，識別DNA 中非甲基化胞嘧啶核苷酸-鳥嘌呤核苷酸（CpG）序列［18］。

3 抗真菌藥物與TLR

3.1 兩性霉素B和TLR

由于兩性霉素B 是革蘭陽性細菌鏈霉菌的產(chǎn)物，因此推測固有免疫細胞可通過TLRs識別兩性霉素B。兩性霉素B 可刺激TLR1、TLR2 和TLR4。Sau等［19］研究發(fā)現(xiàn)TLR2和CD14受體對炎性因子TNF-α和IL-8的釋放起重要作用；TLR2也對IL-1β的釋放起作用。在無真菌感染情況下，TLR2-／-小鼠的 腹膜巨 噬細胞（peritoneal macrophages，PM）給予兩性霉素B 刺激后不能產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-8，而野生型小鼠經(jīng)兩性霉素B刺激后上述炎性因子生成增加。給TLR4突變的C3H／HeJ（TLR4mt）小鼠PM 以兩性霉素B 刺激，TNF-α生成受到抑制，但此現(xiàn)象僅在高劑量兩性霉素B（4 mg／L）給藥組時出現(xiàn)。TLR 應(yīng)對兩性霉素B刺激的反應(yīng)受CD14 影響，即兩性霉素B 刺激CD14-／-小鼠PM，CD4-／-細胞不 能產(chǎn)生TNF-α，但IL-1β生成不受此影響。上述現(xiàn)象均由脫氧膽鹽兩性霉素B觸發(fā)，脂質(zhì)體兩性霉素B 不能刺激PM 細胞因子的生成。原因系脂質(zhì)體兩性霉素B 中兩性霉素B 被包裹在脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中，游離的、非脂質(zhì)體形式兩性霉素B 濃度低，不能有效刺激TLR2／CD14和其他受體［19］。

兩性霉素B對TLR1的作用由Razonable等［11］證實?？?人TLR1 單克隆抗 體（anti-human TLR1 monoclonal antibody，anti-TLR1 MAb）處理THP-1細胞后，給予兩性霉素B刺激后IL-6、IL-8、TNF-α生成都較對照組減少；予TLR2-TLR1 配體Pam-3-Cys（tripalmitoyl cysteinyl lipopeptide）刺激，IL-8 生成減少；予TLR2配體肽聚糖（peptidoglycan，PNG）刺激，則 對IL-8 產(chǎn)生無影響。THP-1 細胞經(jīng)anti-TLR2 MAb處理后，再給予兩性霉素B后，IL-8的生成抑制作用弱于經(jīng)anti-TLR1 MAb 處理組；若 此時加入anti-TLR1 MAb，則IL-8的生成明顯抑制。綜上，結(jié)合Sau等［19］的研究表明TLR1參與到TLR2介導(dǎo)的兩性霉素B對細胞的激活作用。

Bellocchio等［20］證實人和小鼠中性粒細胞分別經(jīng)脫氧膽鹽兩性霉素B 或脂質(zhì)體兩性霉素B 處理后再予曲霉感染，致TLR2和TLR4表達上調(diào)。曲霉分生孢子和菌絲均能誘導(dǎo)TLR2增加，但僅菌絲誘導(dǎo)TLR4增加。兩性霉素B 不同劑型對中性粒細胞上TLR 信號通路的激活有選擇性：脫氧膽鹽兩性霉素B 優(yōu)先激活TLR2信號通路，增加TLR2和促炎因子TNF-α；脂質(zhì)體兩性霉素B 優(yōu)先激活TLR4信號通路，增加TLR4和抑炎因子IL-10，減少TNF-α的產(chǎn)生。對于TLR4-／-小鼠，脂質(zhì)體兩性霉素B 則起到脫氧膽鹽兩性霉素B 的作用，刺激TNF-α產(chǎn)生［20］。Matsuo等［21］用RAW264.7 cells單核細胞系證明兩性霉素B 磷酸化NF-κB 的p65（RelA），通過TLR2和NF-κB調(diào)節(jié)促炎因子產(chǎn)生。

Salvenmoser等［22］予兩性霉素B處理人中性粒細胞后再感染煙曲霉，僅TLR9表達上調(diào)。原因考慮是煙曲霉未甲基化的CpG DNA 是TLR9的天然配體，由Ramirez-Ortiz等［23］用如下實驗證實：對小鼠骨髓來源樹突狀細胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs）和人漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）分別給予煙曲霉DNA 或富含CpG 的煙曲霉基因序列合成物，都能刺激TNF-α、IL-12p70、INF-γ生成；TLR9-／-的小鼠BDMCs生成TNF-α減少。綜上表明TLR9識別煙曲霉DNA，促進炎性反應(yīng)因子分泌，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

2 棘白菌素類與TLR

Salvenmoser等［22］予卡泊芬凈處理人中性粒細胞后再感染煙曲霉、念珠菌，結(jié)果示中性粒細胞應(yīng)對煙曲霉感染時增加TLR2表達，而應(yīng)對念珠菌感染時增加TLR4和TLR9表達。

Moretti等［24］證實卡泊芬凈抗真菌效應(yīng)與TLR2／Dectin-1、Dectin-1與TLR4、TLR9的關(guān)系。不同種 系Dectin-1-／-小鼠侵 襲性曲霉?。╥nvasive aspergillosis，IA）模型給予低濃度（0.1 mg／kg）卡泊芬凈后，療效與遺傳背景相關(guān)：Dectin-1-／-C57BL／6小鼠經(jīng)卡泊芬凈治療后真菌生長受限、炎性反應(yīng)細胞招募減少，但療效不及野生組小鼠；而Dectin-1-／-BALB／c小鼠卻無此作用。免疫完整、環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)、骨髓移植3種IA 小鼠模型中，卡泊芬凈的抗真菌療效表現(xiàn)出“矛盾現(xiàn)象”（the Eagle effect）：低濃度（0.1 mg／kg）時抑制真菌生長，減少炎性反應(yīng)細胞招募；而高濃度時（5 mg／kg）則不能抑制真菌生長，增加炎性反應(yīng)細胞招募。但在Dectin-1-／-的2種種系小鼠中及TLR2-／-的C57BL／6小鼠IA 模型中卡泊芬凈的“矛盾現(xiàn)象”消失，即低濃度時不能抑制真菌生長，高濃度反而抑制真菌生長。綜上表明卡泊芬凈抗真菌作用依賴TLR2／Dectin-1。在TLR4-／-、TLR9-／-C57BL／6小鼠IA 模型中，TLR4-／-小鼠卡泊芬凈的“矛盾現(xiàn)象”也消失，表明TLR4部分參與卡泊芬凈TLR2／Dectin-1依賴的保護作用；對于TLR9-／-小鼠，低濃度和高濃度卡泊芬凈治療，均抑制真菌生長、減少炎性反應(yīng)細胞招募，表明TLR9抑制卡泊芬凈的抗曲霉作用［24］。

Moretti等［25］證實米 卡芬凈 治療小 鼠IA 時TNF-α減少，IL-10增加，具有免疫調(diào)節(jié)作用。IL-10-／-小鼠IA模型分別給予1 mg／kg和10 mg／kg米卡芬凈，2種濃度下肺組織菌落負荷均降低，但播散到腦組織的菌落負荷增加，病理炎性反應(yīng)加重，中性粒細胞招募增加、促炎因子TNF-α和IL-17增多，說明米卡芬凈的 抗炎作用需IL-10 參 與。在Dectin-1-／-、TLR2-／-、TLR3-／-、TLR4-／-、TLR9-／-、MyD88-／-（Dectin-1、TLR2、TLR4、TLR9的下游蛋白）及TRIF-／-（TLR3、TLR4的下游蛋白）的小鼠IA 模型分別給予1 mg／kg和10 mg／kg米卡芬凈治療，療效有差異：TLR2-／-小鼠在2種劑量下療效與野生組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在野生組中，1 mg／kg 米卡芬凈的療效與未治療組無差別，10 mg／kg米卡芬凈能降低菌落負荷，減輕組織炎性反應(yīng)，但 在Dectin-1-／-、TLR2-／-、TLR3-／-、TRIF-／-小鼠中該作用消失；2種劑量都使Dectin-1-／-、TRIF-／-小鼠肺部菌落增加，組織炎性反應(yīng)加重；僅10 mg／kg劑量使TLR3-／-小鼠療效惡化。上述結(jié)果表明低濃度（1 mg／kg）米卡芬凈激活Dectin-1／TRIF信號通路，而高濃度（10 mg／kg）米卡芬凈需要Dectin-1、TLR2、TLR3和TRIF共同參與才能起到保護性作用。給予TLR4-／-、TLR9-／-和MyD88-／-小鼠10 mg／kg治療，其療效與野生型相似，表明高濃度卡泊芬凈不依賴上述信號通路。高濃度米卡芬凈的抗真菌作用也體現(xiàn)在炎性反應(yīng)因子的表達上，10 mg／kg治療下Dectin-1-／-、TLR2-／-、TLR3-／-、TRIF-／-小鼠IL-10減少，除TLR3-／-小鼠外，其余小鼠促炎因子TNF-α增加。而TLR4-／-、TLR9-／-和MyD88-／-小鼠中IL-10 和TNF-α與野生組無差異。綜上，作者認為，TLR2／Dectin-1 和TLR3／TRIF信號通路參與米卡芬凈的抗炎反應(yīng)［25］。

3 唑類藥物與TLR

有限的研究數(shù)據(jù)表明唑類藥物也觸發(fā)TLR 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。Salvenmoser等［22］予伏立康唑預(yù)處理人中性粒細胞后感染煙曲霉致TLR2、TLR4、TLR9 表達上 調(diào)。Simitsopoulou 等［17］研究表 明THP-1單核細胞予煙曲霉及伏立康唑處理，均可誘發(fā)不同程度的抗真菌應(yīng)答：單獨給予煙曲霉菌絲或伏立康唑都可致THP-1細胞TLR2和TNF-α表達增加，且伏立康唑單獨作用效果強于煙曲霉菌絲單獨作用；二者共同刺激THP-1時TLR2和TNF-α增加最明顯。然而，無論是煙曲霉菌絲或伏立康唑單獨或聯(lián)合應(yīng)用都不能增加TLR4表達。此外，伏立康唑單獨刺激THP-1細胞致NF-κB核移位增多，強于煙曲霉菌絲的單獨作用；但同時給予伏立康唑和煙曲霉菌絲致NF-κB核移位量最多［17］。綜上，該研究證實伏立康唑激活TLR2信號通路、TNF-α和NF-κB，在應(yīng)對煙曲霉感染時通過免疫調(diào)節(jié)進而增強應(yīng)答效力。

4 結(jié)語

兩性霉素B、棘白菌素類、唑類藥物三類抗真菌藥物的作用機制早已證實，但其通過觸發(fā)TLR 及其信號通路，以協(xié)同作用的方式增強固有免疫應(yīng)答、共同清除真菌感染的作用機制為抗真菌藥物的免疫治療提供新的思路，但目前尚缺乏臨床轉(zhuǎn)化研究。本文綜述了抗真菌藥物在體內(nèi)、體外實驗中對固有免疫調(diào)節(jié)作用的研究進展，對于今后探索抗真菌藥物的免疫治療提供一定依據(jù)。

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