于曉軍

（吉林省吉林市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院乳甲外科，吉林 吉林 132012）

阿霉素對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的體外作用研究

于曉軍

（吉林省吉林市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院乳甲外科，吉林 吉林 132012）

目的通過實(shí)驗(yàn)觀察研究阿霉素對(duì)于乳腺癌干細(xì)胞的病理藥理的作用，從而來研究乳腺癌細(xì)胞系MCF-7干細(xì)胞通過使用了藥物阿霉素在其體外所產(chǎn)生的變化，來選擇乳腺癌干細(xì)胞更有針對(duì)性的治療方案和研究比較更加行之有效的藥物。方法使用流式細(xì)胞儀器，在乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7），剝離乳腺癌干細(xì)胞CD24（-/low）、CD44（+）、ESA（+）。在濃度不同的阿霉素培養(yǎng)液中放置乳腺癌干細(xì)胞與沒有進(jìn)行分揀的細(xì)胞，測(cè)得阿霉素對(duì)不同干細(xì)胞的抑制生長生，進(jìn)行細(xì)胞凋亡及克隆形成能力的分析。結(jié)果MTT表明乳腺癌干細(xì)胞具有耐藥性。藥物阿霉素呈濃度依賴型抑制了乳腺癌未分類細(xì)胞及干細(xì)胞：未分類細(xì)胞IC50為5.5 μmol/L；而分選出的干細(xì)胞IC50為29.1 μmol/L（P＜0.001）。乳腺癌干細(xì)胞在使用藥物阿霉素可加速病變的恢復(fù)，隨著用藥時(shí)間的增加其效果愈加明顯。研究中還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌干細(xì)胞在阿霉素的作用下可減少其形成和擴(kuò)散。結(jié)論乳腺癌干細(xì)胞在使用了藥物阿霉素成瘤性有所降低，對(duì)于其克隆能力具有抑制作用，其變化呈時(shí)間依賴型與濃度依賴型。

乳腺癌；干細(xì)胞；阿霉素

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，有極少的腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）包含于腫瘤細(xì)胞當(dāng)中，這些干細(xì)胞不僅具有分化成各種不同類型腫瘤細(xì)胞的能力，而且具有長時(shí)間的自我更新能力，這些特性決定了其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了極其重要的作用[1-2]。

阿霉素（adriamycin，ADM）是具有細(xì)胞周期非特異性的藥物，可以有效的殺死有害細(xì)胞，有很好的抑制腫瘤細(xì)胞克隆的作用，是乳腺癌化學(xué)治療常用藥物[3]。研究人員在含有了濃度不一樣的阿霉素干細(xì)胞培養(yǎng)液中放置未分類細(xì)胞以及乳腺癌干細(xì)胞，觀察阿霉素在干細(xì)胞移植動(dòng)物模型中發(fā)揮的抑制作用，檢測(cè)阿霉素對(duì)MCF-7干細(xì)胞生長的抑制曲線，分析乳腺癌干細(xì)胞在使用阿霉素時(shí)準(zhǔn)確的效果。

1 材料與方法

1.1 材料：人體乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的細(xì)胞株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳腺癌干細(xì)胞：使用流式儀分選出ESA（+）、CD44（+）、CD24（-/low），放置于6孔板或96孔板。將干細(xì)胞置于培養(yǎng)液中：含20 ng/mL EGF，1∶50 B27，4 μg/mL 胰島素DMEM，F(xiàn)12（1∶1）的培養(yǎng)液，0.400%牛血清白蛋白，阻止干細(xì)胞分化情況[4-5]。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)：利用MTT方法（the 3-（4-5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromidedye reduction assay），比較阿霉素對(duì)乳腺癌未分類細(xì)胞以及干細(xì)胞的作用影響。不同藥物濃度的96孔板中每一濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔放置沒有進(jìn)行分類的MCF-7細(xì)胞與干細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中37.0 ℃的實(shí)驗(yàn)溫度，5.0% CO2下進(jìn)行；阿霉素的作用濃度分別為0.1、1、10、50、100 μmol/L；藥物作用24 h后，每孔注入MTT 20 μL（將PBS配成5 mg/mL）然后繼續(xù)培養(yǎng)4 h之后結(jié)束，進(jìn)行去除無關(guān)液體的處理之后，混合DMSO 150.0 μL，搖勻處理10 min。觀察光吸收值（OD值），每組重復(fù)3次試驗(yàn)，把記錄的結(jié)果標(biāo)注。在SSPS18.0軟件中輸入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出抑制濃度IC50。

1.2.3 檢驗(yàn)細(xì)胞調(diào)亡變化，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，檢驗(yàn)阿霉影響素干細(xì)胞凋亡的情況。通過軟克隆瓊脂的實(shí)驗(yàn)，在40×10鏡下觀察其變化。記錄超過30個(gè)細(xì)胞菌落的細(xì)胞數(shù)量。重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MCF-7干細(xì)胞比例。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合了現(xiàn)在醫(yī)學(xué)界常用的乳腺癌干細(xì)胞的表型：CD24（-/low），CD44（+），ESA（+），對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7進(jìn)行干細(xì)胞的分選。其中，MCF-7中干細(xì)胞占了（1.4±0.26）%。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果：阿霉素作用的濃度梯度為0.1、1、10、50、100 μmol/L，作用時(shí)間均為24 h。使用MTT的檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)，阿霉素抑制了乳腺癌細(xì)胞的克隆，并且隨著藥物作用的濃度的增加跟隨增加。MCF-7乳腺癌干細(xì)胞要比未分類的乳腺癌細(xì)胞更具有耐藥性：其中未分類細(xì)胞IC50為5.5 μmol/L；而分選出的干細(xì)胞IC50為29.1 μmol/L（P＜0.001）。

2.3 阿霉素作用于干細(xì)胞對(duì)其凋亡的影響：進(jìn)行分析干細(xì)胞早期的凋亡。結(jié)合對(duì)照組（3.180±1.060）%早期凋亡率對(duì)比，阿霉素在實(shí)驗(yàn)24、48、72 h之后MCF-7干細(xì)胞凋亡率為（8.30±0.45）%、（10.29± 0.87）%及（14.79±1.53）%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義（P＜0.01），且凋亡率與藥物作用時(shí)間成正比，呈時(shí)間依賴性。72 h后阿霉素在作用于乳腺癌的原代干細(xì)胞時(shí)可達(dá)到最大值，并誘導(dǎo)干細(xì)胞早期的凋亡，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 乳腺癌干細(xì)胞結(jié)合阿霉素時(shí)體外克隆能力的影響：在本實(shí)驗(yàn)中，MCF-7干細(xì)胞在分別在含或不含10 μmol/L阿霉素藥物的培養(yǎng)液中培養(yǎng)了兩周時(shí)間，40×10鏡下觀察克隆進(jìn)行的變化。鏡下選取隨機(jī)4點(diǎn)進(jìn)行克隆的計(jì)數(shù)取其平均值。在實(shí)驗(yàn)中結(jié)合對(duì)照組的克隆率為100%，阿霉素組中的克隆率為（60.50±7.54）%（P＜0.001），兩組間的克隆形成有顯著區(qū)別。

3 討 論

當(dāng)今以研究乳腺癌干細(xì)胞的試驗(yàn)研究不多，在研究中發(fā)現(xiàn)阿霉素在乳腺癌干細(xì)胞中發(fā)揮的作用。實(shí)驗(yàn)表明阿霉素可有效抑制腫瘤干細(xì)胞發(fā)展。這將為阿霉素進(jìn)一步應(yīng)用在臨床治療上提供了依據(jù)。

通過對(duì)體外克隆形成能力及細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)表明：在結(jié)合未分類細(xì)胞時(shí)效果相似，可以降低體外克隆的干細(xì)胞，而且乳腺癌干細(xì)胞在使用阿霉素之后可以早期凋亡。研究表明阿霉素對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的效果和克隆形成及早期凋亡密切相關(guān)。鄭建勇等[6]誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HCC-9204凋亡時(shí)使用阿霉素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了BCL-2細(xì)胞大量凋亡，蛋白大量減少。王文武[7]等建立了MCF-7細(xì)胞建立了小鼠模型，研究結(jié)果表明：阿霉素有加速小鼠MCF-7乳腺癌的細(xì)胞凋亡和抑制其克隆的作用。綜上所述表明，抑制增殖乳腺癌干細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可以通過使用阿霉素來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，阿霉素具有一定耐藥性，但在一定程度上它可以抑制乳腺癌干細(xì)胞生長。在抑制乳腺癌干細(xì)胞生長機(jī)制方面可能與可以加快乳腺癌干細(xì)胞的早期凋亡、降低體外復(fù)制形成能力相關(guān)，它的抗腫瘤作用機(jī)制，還要繼續(xù)實(shí)驗(yàn)挖掘與完善。

[1]Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7): 3983-3988.

[2]Bell DR,Van Zant G.Stem cells,aging,and cancer: inevitabilities and outcomes[J].Oncogene,2004,23(43): 7290-7296.

[3]Li QQ,Xu JD,Wang WJ,et al.Twist1-mediated adriamycin-induced epithelial-mesenchymal transition relates to multidrug resistance and invasive potential in breast cancer cells[J].Clin Cancer Res, 2009,15(8):2657-2665.

[4]Dontu G,Abdallah WM,Foley JM,et al.In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells[J].Genes Dev,2003,17(10): 1253-1270.

[5]Serrano D,Bleau AM,Fernandez-Garcia I,et al.Inhibition of telomerase activity preferentially targets aldehyde dehydrogenasepositive cancer stem-like cells in lung cancer[J].Mol Cancer,2011, 10(1):96.

[6]鄭建明,李開宗,王為忠,等.阿霉素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究[J].中國普通外科雜志,2005,14(7):509-511.

[7]王文武,歐陽學(xué)農(nóng),姜浩.阿霉素誘導(dǎo)小鼠MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡和抑制增殖的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2005,10(6):78-80.

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1671-8194（2015）02-0057-02