高 峰，于伯華，王麗娟，楊瑞章，沈山江，秦志軍

（鹽城出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇鹽城 224002）

基因條形碼技術(shù)在魚類物種識(shí)別與鑒定中的應(yīng)用

高 峰，于伯華，王麗娟，楊瑞章，沈山江，秦志軍

（鹽城出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇鹽城 224002）

食品安全關(guān)乎國計(jì)民生，隨著食品的摻假方式越來越多，水產(chǎn)品真?zhèn)舞b別也愈發(fā)引起關(guān)注。本文主要介紹目前水產(chǎn)品的鑒定方法，以及用于水產(chǎn)品鑒定的各種目的基因的選擇?；仡橠NA條形碼技術(shù)在國內(nèi)外水產(chǎn)品摻假鑒定中的重要應(yīng)用，使其有望實(shí)踐中得到推廣應(yīng)用。

DNA條形碼技術(shù)；水產(chǎn)品；摻假；鑒定；食品安全

伴隨著食品工業(yè)的飛速發(fā)展，食品的摻假方式越來越多，范圍越來越廣，內(nèi)容越來越復(fù)雜。摻假的方式包括摻兌、混入、抽取、假冒等。摻假范圍涉及糧油、肉類和肉制品、乳制品、果蔬等[1]。目前，國際市場(chǎng)上在水產(chǎn)品的生產(chǎn)與銷售中，利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙買家，謀取暴利的事件屢屢發(fā)生。斑點(diǎn)叉尾鮰魚由于具有生長快、適溫范圍廣、抗病力強(qiáng)、肉嫩味美、易于加工（無肌間刺）等特點(diǎn)，一直深受養(yǎng)殖者、加工企業(yè)和國內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎。在我國斑點(diǎn)叉尾鮰魚大量出口美國的同時(shí)，越南瞄準(zhǔn)美國冷凍鯰魚片市場(chǎng)，大量的越南鯰魚（巴沙魚）在加工后借道中國，打上中國斑點(diǎn)叉尾鮰的標(biāo)簽進(jìn)入美國市場(chǎng)。越南鯰魚借道中國進(jìn)入美國市場(chǎng)，一方面損壞中國斑點(diǎn)叉尾鮰的國際品牌信譽(yù)，影響我國正宗斑點(diǎn)叉尾鮰魚產(chǎn)品的出口；另一方面這些冒牌的越南鯰魚壓低了我國斑點(diǎn)叉尾鮰魚的出口價(jià)格，損害經(jīng)營者的利益。為了維護(hù)我國漁民的正常權(quán)益，保護(hù)我們國內(nèi)的市場(chǎng)，保證我國在國際市場(chǎng)的正當(dāng)?shù)匚缓透偁巸?yōu)勢(shì)，對(duì)出口水產(chǎn)品進(jìn)行摻假摻雜檢驗(yàn)就顯得非常必要。因此，開發(fā)新型快速的鑒別方法顯得十分必要，其重點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確地鑒定水產(chǎn)品的品種來源。而要達(dá)到上述目的需分子生物學(xué)方法的協(xié)助，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，以物種間基因差異為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)鑒定方法成為研究的熱點(diǎn)，這就需要我們對(duì)檢測(cè)物品的生物大分子特性做出深入了解和認(rèn)識(shí)。目前主要有以核酸和蛋白為基礎(chǔ)的鑒定方法，而以核酸為基礎(chǔ)的鑒定方法已成為水產(chǎn)品品種鑒別最常用的方法。這其中尤以基因條形碼最具有代表性，是目前適合我們?cè)谒a(chǎn)品中進(jìn)一步推廣和研究的技術(shù)鑒定手段。

1 出口水產(chǎn)品品種的鑒定方法

動(dòng)物品種的鑒定方法主要從蛋白和核酸兩個(gè)層次進(jìn)行。以蛋白為基礎(chǔ)的鑒定方法主要包括十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS-PAGE）等電聚焦電泳和免疫學(xué)方法[2]。以核酸為基礎(chǔ)的鑒

定方法包括物種特異引物多重PCR、熒光PCR、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（ PCRRFLP）等[3]。相應(yīng)的，分析水產(chǎn)品品種的方法也主要有兩種，即蛋白質(zhì)鑒定（等電聚焦電泳、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、色譜等）和分子生物學(xué)鑒定（DNA分子雜交、PCR方法等）。蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)已成功用于鑒別生鮮肉類的品種，但當(dāng)水產(chǎn)品經(jīng)過切碎、混合、蒸煮等加工烹調(diào)過程后，失去了原有的形態(tài)學(xué)特征和質(zhì)地，加工處理也會(huì)改變其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，從而破壞物種特有的蛋白質(zhì)或抗原決定部位，所以，蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)鑒定水產(chǎn)品品種的穩(wěn)定性和可靠性較差，已不能滿足水產(chǎn)品檢測(cè)的要求。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，以物種間基因差異為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)鑒定方法成為研究的熱點(diǎn)。主要原因是 ：分子生物學(xué)鑒定方法不依賴于組織和細(xì)胞的類型，且DNA比蛋白質(zhì)的耐熱性強(qiáng)，即便高溫處理過的水產(chǎn)品中仍能提取出小片段的 DNA。由于不同的基因片段進(jìn)化效率不同，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇不同的目的基因進(jìn)行研究。此外，DNA比蛋白質(zhì)具有更高的種間多態(tài)性，更有利于品種鑒定[4]。由于分子生物學(xué)鑒定中的DNA雜交法費(fèi)時(shí)、昂貴且復(fù)雜，而PCR方法由于反應(yīng)時(shí)間短，具有較高靈敏性、特異性和可鑒別性，已成為水產(chǎn)品品種鑒別最常用的方法。

2 PCR 技術(shù)鑒定出口水產(chǎn)品品種基因的選擇

利用PCR法對(duì)物種鑒定的關(guān)鍵因素是選擇合適的分析基因。2002年，DNA條碼技術(shù)（DNA barcoding）首次被提出來，并在多個(gè)物種鑒定中成功應(yīng)用，為研究和利用地球上眾多的生物資源、鑒定生物多樣性提供了強(qiáng)大的工具[5]?；驐l形碼以傳統(tǒng)的DNA序列標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)，其在概念上與基因分型類似，并與系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)研究有一定的關(guān)聯(lián)。簡單來說，即通過對(duì)一組來自不同生物個(gè)體的短的同源DNA序列（約800bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，隨后對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行多重序列比對(duì)和聚類分析，從而將某個(gè)體精確定位到一個(gè)已描述過的分類群中［6］。對(duì)某些物種來說，甚至還具有足夠的結(jié)構(gòu)特征可將其定位到特定的地理種群?；驐l形碼工作可以建立在一段長度為幾百個(gè)堿基的基因序列信息的基礎(chǔ)之上，從理論上來講完全可以包括所有物種［7］。

目前，被廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育研究標(biāo)志基因的核糖體12S和16S基因，因存在大量的插入和缺失現(xiàn)象，不宜用作條形編碼基因［8］。而線粒體中存在的13個(gè)蛋白編碼基因卻很少存在插入和缺失，在這13個(gè)候選基因中，綜合基因序列的長度和進(jìn)化速率兩個(gè)條件，最終選定了線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（mtCOI）中一段約645個(gè)堿基長度的片段作為條形編碼基因［9］。此外，線粒體細(xì)胞色素b基因（Cytb）是構(gòu)成線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)復(fù)合體Ⅲ的蛋白質(zhì)之一，也是其中唯一由線粒體基因組編碼的蛋白質(zhì)。由于Cytb基因遵循嚴(yán)格的母系遺傳，并在線粒體基因組中進(jìn)化速度適中，較短的l個(gè)DNA片段就能包含從種屬水平到屬水平乃至綱水平的系統(tǒng)發(fā)育信息，因而線粒體Cytb基因成為研究分子系統(tǒng)進(jìn)化的理想材料，在研究魚類如鯛魚、藍(lán)鰓太陽魚、花斑裸鯉、條紋斑竹鯊等的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生等方面有著廣泛的應(yīng)用［10］。

3 國外研究進(jìn)展

20世紀(jì)80年代，國外開始對(duì)水產(chǎn)品物種溯源進(jìn)行研究，初期的研究對(duì)象主要是一些淡水魚類，采用的方法主要有DNA雜交、免疫擴(kuò)散和等電點(diǎn)聚焦［11］等。這些方法大都成本高，工作量大，對(duì)檢測(cè)對(duì)象要求高。因此，建立一種快速、靈敏、特異性強(qiáng)的檢測(cè)水產(chǎn)品品種的方法一直是研究的熱點(diǎn)。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，PCR方法已成為國外鑒別水產(chǎn)品物種最成熟的方法。Yancy等[12]對(duì)基于線粒體COI基因的DNA條碼技術(shù)進(jìn)行了研究，利用DNA條碼技術(shù)方法簡單，可快速準(zhǔn)確地鑒定單個(gè)物種，也能可靠有效地發(fā)現(xiàn)隱藏物種的特性。研究表明，物種鑒定DNA條碼技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用潛力。Wong，LL等[13]對(duì)基于線粒體COI基因序列的DNA條碼在鯰魚屬魚類物種鑒定中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，應(yīng)用COI基因，通過DNA條碼技術(shù)，可對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚進(jìn)行鑒定。Pereira等[14]應(yīng)用COI基因，通過DNA條碼技

術(shù)，可準(zhǔn)確對(duì)新熱帶地區(qū)的淡水魚類物種進(jìn)行鑒定，其中80%的魚類屬于脂鯉目、鯰形目、鱸形目。Bhattacharjee等[15]對(duì)基于線粒體COI基因序列的DNA條形碼在鯰科魚類物種鑒定中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，構(gòu)建了魚類物種基因條形碼檢測(cè)技術(shù)。Locke等[16]應(yīng)用線粒體COI基因?qū)幽么笫趥愃购拥谋庑蝿?dòng)物門復(fù)殖亞綱的魚類進(jìn)行物種鑒定，研究表明，物種鑒定DNA條碼技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用潛力。Pazian等[17]聯(lián)合應(yīng)用COI和Cytb基因，通過DNA條碼技術(shù)對(duì)脂鯉目魚類物種進(jìn)行了鑒定，研究表明應(yīng)用COI和Cytb基因?qū)χ幠眶~類DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定具有一定的可行性。Hanner等[18]聯(lián)合應(yīng)用COI和Cytb基因，通過DNA條碼技術(shù)為主的基因分析方法對(duì)中國南海主要魚類進(jìn)行物種鑒定。

4 國內(nèi)的研究進(jìn)展

國內(nèi)用 PCR 方法對(duì)水產(chǎn)品的摻假、摻雜檢驗(yàn)和品種溯源的研究起步較晚，隨著我國水產(chǎn)科技工作者的努力，到目前為止已取得了可喜的成果。程磊等[5]研究了線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（COI）基因5’端651 bp的片段在這些種和亞種（共計(jì)128尾標(biāo)本）中的變異。結(jié)果表明，黑鯽、白鯽和鯽均為有效種，同時(shí)，歐亞大陸與日本列島的鯽有明顯分化；而銀鯽和鯽有一些共享的單倍型，銀鯽應(yīng)被視為鯽的一個(gè)亞種，而不是一個(gè)有效物種。由于鯽和銀鯽等類群中同時(shí)存在二倍體和三倍體，因此，倍性不宜作為種或亞種的劃分標(biāo)準(zhǔn)。田金輝等[11]綜述了目前通過分子標(biāo)記手段檢測(cè)動(dòng)物源性成分的常用方法，COI和Cytb基因都擁有適合的長度和慢的進(jìn)化速率，所以適合作為DNA鑒定系統(tǒng)的目標(biāo)基因。寧平等[10]應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)印度-西太平洋沿岸6種金線魚屬魚類分類及親緣關(guān)系進(jìn)行了研究。彭居俐等[19]研究探討了線粒體COI基因作為DNA條形碼對(duì)鲌屬魚類進(jìn)行物種鑒定的可行性，研究中獲得了鲌屬4種魚類共32個(gè)個(gè)體長度為816bp的COI基因序列，利用MEGA軟件計(jì)算鲌屬魚類種間及種內(nèi)遺傳距離，利用鄰接法、最大簡約法、最大似然法和Bayesian方法分別構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，結(jié)果顯示，鲌屬魚類的種間遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離，在系統(tǒng)樹中，鲌屬魚類每一物種的個(gè)體分別形成各自獨(dú)立的分支?；贑OI基因的DNA條形碼在識(shí)別鲌屬魚類物種方面和傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)基本一致，而且該基因可以探討鲌屬魚類種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。該研究表明以COI基因作為鲌屬魚類DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定具有一定的可行性。周曉犢等[20]分析了150尾刀鱭、湖鱭、短頜鱭、七絲鱭及鳳鱭個(gè)體的COI基因DNA條形碼序列變異，研究表明COI基因條形碼技術(shù)可用于我國鱭屬物種的鑒定。張鳳英等[21]對(duì)采自東海的銀鯧、翎鯧和中國鯧3種鯧屬魚類的線粒體COI基因序列片段進(jìn)行擴(kuò)增和序列測(cè)定。柳淑芳等[22]對(duì)石首魚科19屬30種魚類75個(gè)COI基因片段的序列比較和系統(tǒng)進(jìn)化研究，證明線粒體COI基因可作為DNA條形碼對(duì)石首魚科魚類進(jìn)行有效的物種鑒定。孟瑋等[23]以亞東鮭為研究對(duì)象，測(cè)定分析了線粒體COI基因638bp堿基序列，探討了該基因作為DNA條形碼在鮭科三種魚類（亞東鮭、大西洋鮭和紅點(diǎn)鮭）鑒定方面的可行性和有效性。

5 討論

雖然蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)已成功用于鑒別生鮮肉類品種的檢測(cè)中，但是當(dāng)應(yīng)用于水產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)就會(huì)出現(xiàn)很多問題。根本原因就在于水產(chǎn)品經(jīng)過加工烹調(diào)過程后，失去了原有的形態(tài)學(xué)特征和質(zhì)地，而進(jìn)一步的加工處理也會(huì)改變其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，從而破壞物種特有的蛋白質(zhì)或抗原決定部位，所以，蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)鑒定水產(chǎn)品品種的穩(wěn)定性和可靠性較差，已不能滿足水產(chǎn)品檢測(cè)的要求。而基因條形碼技術(shù)則不存在上述局限，并且基因條形碼技術(shù)在國內(nèi)外的其他類物品檢測(cè)中都得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用，實(shí)踐表明該技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品的檢測(cè)是切實(shí)可行的，在我們選取合適的基因位點(diǎn)后其準(zhǔn)確性和特異性都很好，完全能夠滿足我們進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫的需要。

DNA作為分子標(biāo)記使用的可行性及其在物種分類和生物進(jìn)化研究領(lǐng)域的實(shí)用價(jià)值已為大量的分子系統(tǒng)發(fā)育研究所證實(shí)，明顯提高物種鑒定的效率[24]。序列標(biāo)記、DNA庫和組織庫（分類憑證標(biāo)本）是基因條形碼標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的3個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著大規(guī)模測(cè)序計(jì)劃所伴隨的海量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，基因條形碼研究在過去以DNA為基礎(chǔ)的分類鑒定研究

上又具有了新的內(nèi)涵。被視為數(shù)字化的基因條形碼數(shù)據(jù)庫，能提供明確的信息，不僅彌補(bǔ)了形態(tài)描述的不足，而且可以加快已知物種的識(shí)別速度，同時(shí)便于新物種的發(fā)現(xiàn)，將會(huì)使分類學(xué)科的發(fā)展更加快速和深入。這無疑對(duì)品種繁多、形態(tài)各異的水生動(dòng)物及其產(chǎn)品的分類、鑒定提供有效的研究手段。更為不同水產(chǎn)品的來源溯源提供可靠的檢測(cè)技術(shù)保障。

基因條形碼技術(shù)快速、簡便的操作特點(diǎn)，使其有望在一線口岸得到推廣應(yīng)用，從而為水產(chǎn)品順利出口提供有力保障，促進(jìn)外貿(mào)業(yè)更加健康、順利發(fā)展。

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Application of Genetic Barcode Technology in Recognition and Identifi cation of Fish Species

Gao feng，Yu Bohua，Wang Lijuan，Yang Ruizhang，Shen Shanjiang，Qin Zhijun
（Yancheng Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau，Yancheng，Jiangsu 224002）

Food safety is of vital importance to the national economy and people's livelihood. With more and more food adulterations，the identification of adulterated aquaculture products has aroused much attention. The present identification methods for aquaculture products were introduced in the paper，with selection of target genes used for aquaculture product identification in particular. The applications of DNA barcode technology both at home and abroad were reviewed，hoping the technology to be extended in practice.

DNA barcode；aquaculture product；adulteration；identification；food-safety

S763.3

A

1005-944X（2015）06-0044-04

江蘇檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（2011KJ43）