doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.025

·專題綜述·

食源性致病菌疫苗研究進(jìn)展①

曾海娟宋春美吳淑燕楊標(biāo)李建武邱實(shí)劉箐

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

中圖分類號Q939.91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼碼A

文章編號號1000-484X(2015)11-1553-04

①本文受國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(GSCIQ_2010IK220)、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371776)和上海市科委高校能力建設(shè)項(xiàng)目(13430502400)資助。

作者簡介：曾海娟(1990年-)，女，博士，主要從事食源性致病菌快速檢測技術(shù)研究，E-mail:zenghaijuan12@126.com。

通訊作者及指導(dǎo)教師：劉箐(1970年-)，男，博士，教授，主要從事食源性致病菌致病機(jī)理及快速檢測技術(shù)研究，E-mail:liuq@usst.edu.cn。

食源性致病菌是可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細(xì)菌。致病性細(xì)菌直接或間接污染食品及水源，人經(jīng)口感染可導(dǎo)致腸道傳染病的發(fā)生、食物中毒，及畜禽傳染病的流行。常見的食源性致病菌主要有大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyt-icus)、志賀氏菌(Shigella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocyt-ogenes)等。食源性致病菌是引起食品安全問題的重要來源。在一般情況下，食源性致病菌常引起急性中毒，輕者多以急性胃腸炎癥狀出現(xiàn)，如嘔吐、惡心、腹瀉等，較重者可出現(xiàn)呼吸、神經(jīng)系統(tǒng)等癥狀[1]。

疫苗含有刺激免疫系統(tǒng)的抗原成分，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體并產(chǎn)生記憶性B淋巴細(xì)胞，保護(hù)機(jī)體免受入侵病原體的感染。目前對食源性致病菌的防治主要依賴抗生素，抗生素的使用導(dǎo)致微生物產(chǎn)生耐藥性，并可能使食品存在藥物殘留。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌對紅霉素的耐藥率達(dá)33.3%，副溶血性弧菌對四環(huán)素和復(fù)方磺胺甲惡唑耐藥率分別為2.1%和3.2%，沙門菌對萘啶酸的耐藥率為50%[2]。研發(fā)高效疫苗，通過免疫途徑提高動物自身免疫力，降低抗生素的使用量，是預(yù)防食源性致病菌的有效方法之一。

我國在食源性致病菌傳統(tǒng)疫苗的滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗的制備上已經(jīng)取得了一些科研成果，截止到2014年9月19日，山東濱州華宏生物制品有限公司研制的雞大腸桿菌病蜂膠滅活疫苗通過注冊，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)管所與山東濱州華宏生物制品有限公司研制的鴨傳染性漿膜炎、大腸桿菌病二聯(lián)滅活疫苗通過注冊。對于基因工程菌，中國科學(xué)院上海生物工程中心研制的仔豬大腸埃希菌K88、K99雙價(jià)基因工程滅活疫苗，寧夏大學(xué)研制的犢牛、羔羊大腸埃希菌、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌基因工程滅活疫苗相繼通過了注冊，軍事科學(xué)院生物工程研究所研制的仔豬大腸埃希菌病K88、LTB雙價(jià)基因工程活疫苗也通過注冊[3,4]。對于國外，美國輝瑞公司林肯廠研制的仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病、大腸桿菌病二聯(lián)滅活疫苗通過注冊，德國羅曼動物保健有限公司研制的雞腸炎沙門氏菌病活疫苗也通過注冊。近幾年，食源性致病菌新型疫苗的基因工程亞單位疫苗以及核酸疫苗，都具有較好的免疫效果，但仍處于試驗(yàn)階段，尚無商品化的疫苗投放市場。本文主要對食源性致病菌的傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗的研究進(jìn)展及優(yōu)缺點(diǎn)做了詳細(xì)的綜述。

1傳統(tǒng)疫苗

傳統(tǒng)疫苗即采用病原微生物及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、脫毒、滅活等方法制成的疫苗，與新型疫苗相對。食源性致病菌的傳統(tǒng)疫苗主要有滅活疫苗、減毒疫苗和亞單位疫苗。

1.1滅活疫苗滅活疫苗主要是采用熱滅活或甲醛滅活制成的疫苗，該疫苗較為安全，具有保護(hù)性好，易于貯存運(yùn)輸?shù)膬?yōu)點(diǎn)。滅活疫苗，由于含有病原體的蛋白或多糖等成分，可通過抗原或佐劑激活途徑使機(jī)體對病原體產(chǎn)生獲得性免疫應(yīng)答[5]。滅活疫苗主要啟動體液免疫作用，其體液免疫作用很強(qiáng)，能產(chǎn)生足夠的抗體，且抗體在機(jī)體的維持時(shí)間較長。

劉富來等[6]制備腸炎沙門氏菌滅活苗，得出高溫最佳滅活條件為60℃、30 min或50℃、120 min；得出甲醛最佳滅活條件為0.2%的甲醛溶液，37℃滅活24 h。以所制備的滅活疫苗免疫小鼠后，獲得了100%免疫保護(hù)率，表明該滅活疫苗制備成功，且是安全有效的。周宸等[7]制備副溶血弧菌滅活苗，以云芝多糖和該滅活苗免疫斜帶石斑魚，可獲得87.6%的免疫保護(hù)率。Yousif等[8]采用熱滅活方式制備出血性大腸桿菌疫苗并免疫小鼠，攻毒后顯示出100%保護(hù)率。Barman等[9]對6種不同血清型的志賀氏菌進(jìn)行熱滅活制備混合滅活疫苗，該滅活疫苗經(jīng)口服免疫豚鼠，24 h后顯示，免疫組中95.8%的豚鼠未出現(xiàn)痢疾癥狀，而對照組全部出現(xiàn)出血性痢疾或痢疾癥狀?？梢?，滅活疫苗的免疫原性良好，且免疫后可得較高的保護(hù)率。

1.2減毒疫苗減毒疫苗相對于滅活疫苗，其免疫力較強(qiáng)、作用時(shí)間較長。減毒疫苗模擬病原體自然感染的途徑激活Toll樣受體(TLRs)，誘導(dǎo)產(chǎn)生與病原體感染類似的免疫應(yīng)答[10]，可啟動細(xì)胞免疫和體液免疫作用，其免疫作用比較全面，且刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體所需時(shí)間較短，但主要以細(xì)胞免疫作用為主，誘發(fā)的體液免疫作用較弱，產(chǎn)生的抗體水平較低，維持時(shí)間較短。

潘志明等[11]采用減毒雞沙門氏菌疫苗免疫肉雞，顯示出的免疫保護(hù)率≥80%，而對照組100%死亡。孫洋等[12]構(gòu)建了O157:H7的ler/stx雙基因缺失突變的弱毒疫苗株，以該突變株O157:H7免疫昆明鼠母鼠，所產(chǎn)乳鼠授乳一周后，用O157:H7強(qiáng)毒株攻毒，保護(hù)率達(dá)81.03%。殷月蘭等[13]構(gòu)建了單核細(xì)胞李斯特菌actA/plcB雙基因缺失的減毒疫苗株，采用該缺失株免疫小鼠，野生型李斯特菌株攻毒后顯示出100%的免疫保護(hù)率，表明該疫苗安全性好，免疫保護(hù)力強(qiáng)。

1.3亞單位疫苗亞單位疫苗是利用微生物表面的一種或幾種主要抗原成分制成的疫苗，如細(xì)菌的外膜蛋白、脂多糖(LPS)、外毒素、胞外蛋白酶等。此類疫苗只含有特異性的保護(hù)性抗原，主要誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，因而毒性低，安全性好，接種后不引起過敏反應(yīng)或其他副作用。

Satoshi等[14]用PCR方法對EHEC O157的志賀毒素1(Stx1)進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變毒素?zé)oVero細(xì)胞毒性，以該突變毒素免疫小鼠后能夠抵抗100倍LD50野生型Stx1的攻擊。Ursula等[15]對大腸桿菌的AB5型志賀毒素的A亞單位進(jìn)行定點(diǎn)突變(絲氨酸272突變?yōu)楸彼?，突變的A亞單位失去毒性。該毒素純化后免疫小鼠，攻毒后顯示，小鼠獲得80%的免疫保護(hù)率，而對照組全部死亡。

2新型疫苗

新型疫苗是采用生物化學(xué)合成技術(shù)、人工變異技術(shù)、分子微生物學(xué)技術(shù)、基因工程技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)制造出的疫苗，是近年來新發(fā)展的疫苗，其有別于傳統(tǒng)常規(guī)疫苗。目前報(bào)道的可用于食源性致病菌的新型疫苗主要有基因工程亞單位疫苗和核酸疫苗。

2.1基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗是將選定的免疫原或抗原決定簇的編碼基因，通過基因重組技術(shù)引入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，并以表達(dá)產(chǎn)物純化后制備的疫苗。此類疫苗是基因工程疫苗中最具安全性和穩(wěn)定性的，且具有接種劑量小、免疫原性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)?；蚬こ虂唵挝灰呙缰饕T導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。

2.1.1單價(jià)基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗的單價(jià)疫苗是選取致病菌的某個(gè)保護(hù)性抗原基因表達(dá)并純化后制備的疫苗。

王洪斌等[16]克隆并表達(dá)了副溶血性弧菌的溶血素基因，對融合蛋白TDH進(jìn)行純化并脫毒后，免疫真鯛并攻毒，該疫苗對真鯛保護(hù)率達(dá)50%。Zhang等[17]選取沙門氏菌致病重要的入侵基因invH制備融合蛋白，攻毒后顯示，保護(hù)率均在60%以上，與對照組相比差異均極顯著。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建C3d分子佐劑核酸疫苗，可顯著提高小鼠體內(nèi)的抗體水平，表明C3d是一種安全有效的分子佐劑。Gao等[18]采用基因工程的方法制備EHEC O157:H7的志賀毒素(STXS)的融合蛋白，免疫小鼠后，在50倍LD50攻毒中顯示70%的免疫保護(hù)率。

2.1.2多價(jià)基因工程亞單位疫苗該疫苗通過將不同的抗原基因聯(lián)到同一載體上，制成多聯(lián)或多價(jià)疫苗，使免疫程序簡化，使生產(chǎn)成本降低。

易勇等[19]采用基因工程方法表達(dá)了EHEC O157:H7的intimin C300及Stx2B的融合蛋白，融合蛋白及O157:H7全菌抗原的保護(hù)率分別為65%和60%。Wen等[20]利用基因工程脫毒方法表達(dá)獲得EHEC O157:H7的Stx1和Stx2的類毒素，純化后免疫小鼠產(chǎn)生了針對同型毒素的中和抗體，同時(shí)能夠起到抵抗毒素攻擊的作用。Mao等[21]選取副溶血弧菌的兩種外膜蛋白pvuA和psuA的基因進(jìn)行融合，表達(dá)的重組蛋白純化后免疫大黃魚，獲得了75%的免疫保護(hù)率。Gu等[22]制備大腸桿菌EspA、Stx2及intimin C300三價(jià)重組蛋白，免疫小鼠并攻毒后顯示出93.3%的免疫保護(hù)率。張雪寒等[23]構(gòu)建并表達(dá)了含EHEC O157:H7的stxlb及tir基因的重組蛋白，可獲得60%免疫保護(hù)率。鄭磊等[24]制備副溶血弧菌高純度融合蛋白FlaA-OmpK，可獲得80%的免疫保護(hù)率。

2.2核酸疫苗核酸疫苗是指將重組表達(dá)載體直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原蛋白一部分誘發(fā)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生，一部分引起CIN+T細(xì)胞反應(yīng)，引發(fā)體液免疫應(yīng)答，一部分呈遞給B細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體，誘發(fā)體液免疫[25]。核酸疫苗既有減毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)又無逆轉(zhuǎn)的危險(xiǎn)，可維持長時(shí)間的免疫反應(yīng)，同時(shí)也便于構(gòu)建多價(jià)疫苗[26]，因此也受到越來越多的重視。核酸疫苗中抗原基因的選取與能否產(chǎn)生良好免疫力密切相關(guān)，因而往往選擇與致病直接相關(guān)的毒理基因構(gòu)建而成。

2.2.1單價(jià)核酸疫苗Liu等[27]從副溶血弧菌基因組中克隆了vps基因并表達(dá)后，采用PCR方法使絲氨酸蛋白酶突變失活，將突變基因vps(Ser318-Pro)構(gòu)建DNA疫苗，該疫苗最高可獲得96.1%的免疫保護(hù)率。Li等[28]選取副溶血弧菌的ompK基因制備DNA口服微膠囊疫苗，免疫的黑鯛并攻毒后的免疫保護(hù)率為72.3%。

2.2.2多價(jià)核酸疫苗Ren等[29]采用基因工程方法獲得大腸桿菌O139的兩個(gè)主要毒理因子fedF和stx2e，制備DNA疫苗，該疫苗可提供100%的免疫保護(hù)率。

2.2.3二聯(lián)核酸疫苗劉瑞等[30,31]構(gòu)建含哈維氏弧菌oppA基因和副溶血弧菌的tdh2基因的二聯(lián)DNA疫苗，對副溶血弧菌該疫苗可提供100%的保護(hù)率；對哈維氏弧菌該疫苗可提供60%的保護(hù)率。將鰻弧菌外膜蛋白基因ompU和副溶血弧菌的tdh2基因進(jìn)行融合，該DNA疫苗對副溶血弧菌感染的保護(hù)率為100%；對鰻弧菌該疫苗最高提供35%的保護(hù)率。

在食源性致病菌的疫苗中，應(yīng)用最廣泛的是傳統(tǒng)疫苗，目前研究最熱的是基因工程亞單位疫苗和核酸疫苗?；蚬こ虂唵挝灰呙缇哂屑兌雀?、產(chǎn)量高、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，適用于病原菌難于培養(yǎng)或有潛在致癌性的疫苗研究。核酸疫苗較穩(wěn)定，制備及使用過程簡單方便，易于大批量生產(chǎn)，易于貯存和運(yùn)輸，免疫效果持續(xù)可靠。

3展望

傳統(tǒng)疫苗中，滅活疫苗使用劑量較大，且誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)水平較低，持續(xù)時(shí)間較短，因而需要多次接種。減毒疫苗有可能在動物體內(nèi)恢復(fù)毒力具有潛在的致病危險(xiǎn)，且不易貯存，野生型菌株感染也會導(dǎo)致疫苗效果下降。在實(shí)際應(yīng)用中，因傳統(tǒng)疫苗均存在非特異性反應(yīng)強(qiáng)、保護(hù)期短等缺點(diǎn)，這就促使新型疫苗的產(chǎn)生，以期望彌補(bǔ)傳統(tǒng)疫苗的不足并最大化兼?zhèn)鋫鹘y(tǒng)疫苗的優(yōu)點(diǎn)。

隨著生物技術(shù)、免疫技術(shù)及基因測序的發(fā)展，各種新型基因工程疫苗受到越來越多的關(guān)注。但應(yīng)意識到新型疫苗作為高科技產(chǎn)品，生產(chǎn)成本較高，并涉及基因水平，與人類及環(huán)境的健康及安全密切相關(guān)，因而在新型疫苗的開發(fā)、生產(chǎn)等環(huán)節(jié)應(yīng)引起高度重視。

面對食源性致病菌感染率不斷上升的趨勢，食源性致病菌各類高效、安全、低廉疫苗的研發(fā)及推出具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。隨著養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)集約化程度的不斷提高，科研投入的增加和檢測水平的提高，疫苗的市場需求將逐漸增大。同時(shí)，應(yīng)該進(jìn)一步探索各類食源性致病菌的感染機(jī)理，把試驗(yàn)研究和現(xiàn)實(shí)需求結(jié)合起來，并充分發(fā)揮各種疫苗的優(yōu)勢。相信在可預(yù)見的將來，會有更多成本低、制備及使用簡單方便、免疫力強(qiáng)、保護(hù)期長的新型疫苗誕生，給疾病的預(yù)防和治療帶來新的進(jìn)展與希望。

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[收稿2014-09-25修回2014-10-10]

(編輯許四平)

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