于志勇

（湖南省長(zhǎng)沙市第八醫(yī)院病理科，湖南 長(zhǎng)沙 410100）

左旋肉毒堿對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞及OPG表達(dá)的作用

于志勇

（湖南省長(zhǎng)沙市第八醫(yī)院病理科，湖南 長(zhǎng)沙 410100）

目的 探討左旋肉毒堿對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞及OPG的表達(dá)作用，為臨床預(yù)防骨質(zhì)疏松提供參考。方法 以小鼠骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，用左旋肉毒堿對(duì)其表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，最后，以免疫組化法檢測(cè)左旋肉毒堿干預(yù)前后OPG蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變，分析左旋肉毒堿對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)作用。結(jié)果 1 mmol/L左旋肉毒堿對(duì)小鼠成骨細(xì)胞無(wú)明顯作用，10～100 mmol/L左旋肉毒堿能促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖，顯著抑制人成骨細(xì)胞凋亡，增加小鼠骨密度。結(jié)論 左旋肉毒堿可通過(guò)促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，并且左旋肉毒堿可抑制人成骨細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)其存活時(shí)間。

左旋肉毒堿；MC3T3-E1；成骨細(xì)胞；OPG；骨質(zhì)疏松

左旋肉毒堿（L-C）是人體細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種基本成分，人體肝臟、腎臟可合成約1/4的左旋肉毒堿，其余通過(guò)食物攝?。?］。有報(bào)道表明，左旋肉毒堿可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的表達(dá)來(lái)促進(jìn)骨形成，另外，左旋肉毒堿也可對(duì)OPG（骨保護(hù)素，又稱破骨細(xì)胞抑制因子）產(chǎn)生作用，以此來(lái)預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。本次探究以小鼠骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，探討左旋肉毒堿對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)作用，分析左旋肉毒堿促進(jìn)骨形成的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 成骨細(xì)胞培養(yǎng)：在含有10%胎牛血清（FBS）、50 μg/mL抗壞血酸，50 μg/mL慶大霉素和50 U/mL青鏈霉素的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-El。保持溫度37 ℃、濕度100%、CO2濃度5%。觀察組以0.1～10 mmol/L左旋肉毒堿培養(yǎng)24 h，對(duì)照組加等量蒸餾水作為對(duì)照。

1.2 表型鑒定：將細(xì)胞接種于24孔板，第2天換含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再換不含BSA的無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基，分別以0、1、10、100 mmol/L左旋肉毒堿干預(yù)2 d后，PBS反復(fù)沖洗3次，超聲粉碎裂解細(xì)胞，離心、取上清液、測(cè)定ALP活性，以骨鈣素放射免疫試劑盒測(cè)定上清液中骨鈣素含量（靈敏度為0.2 ng/mL）檢測(cè)成骨細(xì)胞中OPG蛋白表達(dá)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料以表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料的比較用χ2檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

10～100 mmol/L左旋肉毒堿促進(jìn)人成骨細(xì)胞增殖。1 mmol/L以下左旋肉毒堿對(duì)人成骨細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響（與對(duì)照組相比，P＞0.05）。10 mmol/L以上劑量后，左旋肉毒堿使人成骨細(xì)胞增殖量隨濃度遞增（與對(duì)照組相比，P＜0.05）。另外，實(shí)驗(yàn)組1 mmol/L左旋旋肉毒堿可見(jiàn)細(xì)胞核濃縮，核裂解，大量凋亡細(xì)胞，隨著左旋肉毒堿劑量增加，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞明顯減少。

3 討 論

人體骨吸收和再生之間的動(dòng)態(tài)平衡維持著骨代謝的穩(wěn)定，其形成和吸收的速率由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量、活性及存活時(shí)間來(lái)決定［2］。老年人及絕經(jīng)后的婦女由于分泌、代謝等因素易導(dǎo)致成骨細(xì)胞減少、破骨細(xì)胞增加引起骨質(zhì)疏松。左旋肉毒堿已經(jīng)被證實(shí)可作為長(zhǎng)鏈脂肪酸的載體，將期運(yùn)送至線粒體內(nèi)進(jìn)行氧化功能，還可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，增加骨密度預(yù)防骨質(zhì)疏松。

本次探究以小鼠成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，探討左旋肉毒堿對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞及OPG的表達(dá)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10 mmol/L以上的左旋肉毒堿通過(guò)MC3T3-E1成骨細(xì)胞OPG蛋白的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞生成，從而提高骨密度。有文獻(xiàn)報(bào)道，左旋肉毒堿是通過(guò)下調(diào)Caspase-3、Caspase-9的活化，來(lái)抑制成骨細(xì)胞凋亡的，從雙方面降低了骨質(zhì)疏松的發(fā)生［3］。說(shuō)明左旋肉毒堿不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、還可以延長(zhǎng)其生存時(shí)間，緩解其凋亡速率，另外，左旋肉毒堿對(duì)OPG表達(dá)的抑制作用可抑制破骨細(xì)胞生成，對(duì)骨重建及骨密度的增加具有重要意義。對(duì)老年人及絕經(jīng)后的婦女，可顯著改善其骨質(zhì)量，降低骨折的發(fā)生率［4］。

綜上所述，一定劑量的左旋肉毒堿可促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)，刺激成骨細(xì)胞增殖，且其作用強(qiáng)度呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。另一方面，左旋肉毒堿可抑制人成骨細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞生成，促進(jìn)骨形成、減少骨量丟失。本次探究是提高動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其作用，具體將左旋肉毒堿應(yīng)用于臨床治療，還有待進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。

［1］ 姚靜，鄧益峰，周振雷，等.雞骨保護(hù)素（chOPG）編碼區(qū)基因的克隆和序列分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，14（5）:816-817.

［2］ 崔蓉蓉，謝輝，黃佼，等.左旋肉毒堿對(duì)人成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2007，13（10）:681-682.

［3］ 楊宇，吳元華，鄭雅楠?利用重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行DNA的人工合成［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（9）:1810-1811.

［4］ 張勇，楊彤濤，黃立軍，等.人破骨細(xì)胞分化因子（ODF）的克隆和序列分析［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2006，35（3）:269-270.

［5］ 于志勇，魏?jiǎn)⒂?左旋肉毒堿對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞及去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型中OPG和RANKL表達(dá)的作用［D］.長(zhǎng)沙:中南大學(xué)，2009.

［6］ 梁秋華，廖二元.左旋-肉毒堿對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨丟失模型大鼠骨密度和骨微結(jié)構(gòu)的影響［D］.長(zhǎng)沙:中南大學(xué)，2009.

［7］ 張瑞娟，羅湘杭.牛磺酸和左旋肉毒堿協(xié)同抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和成骨分化［D］.長(zhǎng)沙:中南大學(xué)，2011.

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1671-8194（2015）14-0045-01