樊 華，國九英，馬素麗，張 楠，安春麗

人工合成肺孢子菌p55抗原串聯(lián)基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

樊 華1,2，國九英1，馬素麗1，張 楠1，安春麗1

目的 研究肺孢子菌p55抗原人工合成串聯(lián)基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建及其表達(dá)鑒定。方法 從肺孢子菌p55蛋白5個變異體中選取可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用抗原表位，串聯(lián)合成一段多表位基因，命名為TAG。將TAG雙酶切后克隆到pIRES-hrGFP-1a真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感受態(tài)TG-1大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增后，經(jīng)提取純化質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，用Western blot鑒定蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 構(gòu)建的pIRES-hrGFP-1a/TAG重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后測序鑒定，證明其序列正確，成功轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，Western blot檢測其在HKE293細(xì)胞中能進(jìn)行有效基因表達(dá)。結(jié)論 本研究構(gòu)建了pIRES-hrGFP-1a/TAG重組質(zhì)粒，并在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)，為進(jìn)一步闡明TAG的免疫保護(hù)功能以及核酸疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

肺孢子菌；p55抗原；串聯(lián)抗原基因；真核表達(dá)

肺孢子菌肺炎(Pneumocystispneumonia, PCP) 是由肺孢子菌引起的一種機(jī)會感染性肺炎[1]。常見于艾滋病、惡性腫瘤、器官移植及其他免疫功能不全的人群[2-3]。在艾滋病全病程中均可合并PCP，且可經(jīng)歷多次反復(fù)發(fā)病。根據(jù)最新的數(shù)據(jù)[4]，PCP的發(fā)病率不僅在HIV感染者中逐年增加，而且在非HIV感染的免疫抑制人群中也在不斷增多。目前PCP傳統(tǒng)的防治藥物不僅副作用很大，而且耐藥突變株已經(jīng)或正在產(chǎn)生，使PCP的治療變得極為困難。由于缺少可靠、穩(wěn)定的連續(xù)的體外培養(yǎng)體系，迄今體外培養(yǎng)技術(shù)難以提供大量肺孢子菌抗原，用肺孢子菌可溶性抗原或活肺孢子菌進(jìn)行免疫在實(shí)際工作中受到限制[5]。因此，新的治療方法的研究就變得非常重要。Smulian等[6]和Theus等[7]發(fā)現(xiàn)肺孢子菌55 kDa蛋白(p55)作為肺孢子菌的主要抗原成分之一，能刺激宿主產(chǎn)生抗肺孢子菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)，而且重組p55蛋白能刺激宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。因此, p55做為PCP預(yù)防疫苗的候選抗原成為研究熱點(diǎn)。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法，分析肺孢子菌p55蛋白，參考GenBank 發(fā)布的5個變異體，選擇可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用并具有較好抗原性參數(shù)的區(qū)域作為候選抗原表位，將各表位進(jìn)行串聯(lián)后形成嵌合體，合成了多表位串聯(lián)基因，命名為TAG。在此基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了該蛋白的原核表達(dá)載體[8]，期望為制備蛋白疫苗打基礎(chǔ)。但因表達(dá)蛋白量少及回收的困難，難以滿足蛋白疫苗的需求。因此，本文構(gòu)建了pIRES-hrGFP-1a/TAG的重組真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢驗(yàn)重組質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG在真核細(xì)胞中的表達(dá)水平。以期為該基因疫苗的免疫特性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因、菌株、細(xì)胞及載體 人工合成p55抗原串聯(lián)基因(本實(shí)驗(yàn)室已成功合成并測序證明，命名TAG)，EsherichiacoliTG-1菌株(本實(shí)驗(yàn)室保存)，HEK293細(xì)胞(細(xì)胞生物教研室提供)，質(zhì)粒載體pIRES-hrGFP-1a(Agilent公司)

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI、T4DNA連接酶、耐熱TaqDNA聚合酶、AntiFLAG-Ab、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、PVDF膜購自大連寶生物工程有限公司，質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生物公司，轉(zhuǎn)染試劑購自QIANGEN公司。其他常規(guī)試劑購自沈陽化學(xué)試劑采購供應(yīng)站。

1.2 方法

1.2.1 pIRES-hrGFP-1a/TAG真核表達(dá)載體的構(gòu)建 取適量TAG基因和pIRES-hrGFP-1a質(zhì)粒，分別用BamHI和XhoI雙酶切。再進(jìn)行連接反應(yīng):10×T4DNA連接酶buffer 1 μL，T4DNA連接酶(20 U/μL)1 μL，雙酶切的pIRES-hrGFP-1a 1 μL，雙酶切的基因片段5 μL，雙蒸水補(bǔ)足10 μL體系；并以水代替目的基因片段作為對照。構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG，與標(biāo)簽FLAG連接。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG的鑒定 將pIRES-hrGFP-1a/TAG轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌E.coliTG-1內(nèi)。用含重組質(zhì)粒的E.coli涂布于含有氨芐青霉素( Amp, 100 μg/ mL) 的LB培養(yǎng)基( 1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl)，于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。收獲大腸桿菌并抽提重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG。用BamHI和XhoI雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定并測序。

土壤孔隙率:用已知容積(V)的環(huán)刀切削土壤,使土樣充滿環(huán)刀,再用天平稱量環(huán)刀中土壤的重量(m1),在烘箱(105°C)中烘干土壤水分,稱量烘干后土壤的重量(m2).再將環(huán)刀垂直全部壓入土樣,將土裝入容器(記容器重量為m3),在烘箱(105°C)中烘干土壤水分至恒重記為m4,則

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞 HEK293細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代，至細(xì)胞60%～70%融合，采用創(chuàng)新陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，參照QIANGEN說明書分別將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG質(zhì)粒和pIRES-hrGFP-1a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染完畢加入10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清 。

1.2.4 TAG基因蛋白的檢測 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)液上清和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a的對照組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，1 000×g離心10 min收集上清，丙酮法濃縮細(xì)胞培養(yǎng)液中蛋白。樣品蛋白在10%SDS-PAGE上分離后濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，以AntiFLAG-Ab為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG-HRP為二抗，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG的雙酶切鑒定及測序 pIRES-hrGFP-1a載體片斷長度約5 000 bpTAG基因片段長度為1 180 bp。重組質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG，經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切的電泳結(jié)果出現(xiàn)了約5 000 bp及1 180 bp的特異性條帶(見圖1)，pIRES-hrGFP-1a/TAG表達(dá)載體構(gòu)建成功。同時，重組質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG由北京華大基因生物工程有限公司作序列測定，結(jié)果證實(shí)了其堿基序列及讀碼框架與設(shè)計(jì)完全相符。

2.2 重組質(zhì)粒用QIANGEN 陽離子脂質(zhì)技術(shù)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞 48 h后在熒光顯微鏡下觀察hrGFP的表達(dá)情況。成功轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中的重組質(zhì)粒，其攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)清晰，轉(zhuǎn)染效率高(圖2)。

2.3 重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中表達(dá)的鑒定 Western blot檢測重組質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG在細(xì)胞培養(yǎng)液中的表達(dá)，可見48 kDa處有明顯的免疫雜交帶出現(xiàn)，而空質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a組HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清中未見明顯條帶(圖3)。

M1: DNA Marker DL15000; M2: DNA Marker DL2000 1: pIRES-hrGFP-1a/ TAG digested withBamHI andXhoI; 2: pIRES-hrGFP-1a digested withBamHI andXhoI; 3: pIRES-hrGFP-1a/ TAG digested withBamHI alone; 4: pIRES-hrGFP-1a/ TAG digested withXhoI alone.

圖1 重組真核表達(dá)載體pIRES-hrGFP-1a/TAG的酶切鑒定

Fig.1 Identification of recombinant eukaryotic expression vector pIRES-hrGFP-1a/TAG by enzyme digestion

A: Recombinant plasmids were transfected into HEK293 cells by fluorescence microscope; B: The same vision under the microscope.

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h后熒光顯微鏡觀察hrGFP表達(dá)(×100)

Fig.2 Expression of hrGFP fluorescence microscopy of the recombinant plasmid transfected into HEK293 cells after 48 h (×100)

R: Transfection with recombinant plasmid pIRES-hrGFP-1a/TAG HEK293 cell culture supernatant; Con: Transfected with empty plasmid pIRES-hrGFP-1a HEK293cell culture supernatant.

圖3 Western blot檢測pIRES-hrGFP-1a/ TAG在HEK293細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的表達(dá)

Fig.3 Western blot detection of pIRES-hrGFP-1a/ TAG expression in cultured supernatant in HEK293 cell

3 討 論

肺孢子菌是一種機(jī)會性致病真菌，在免疫功能不全宿主可以引發(fā)嚴(yán)重的致死性PCP。直接接種肺孢子菌雖可以產(chǎn)生保護(hù)性免疫，但由于其不能在體外連續(xù)培養(yǎng)，制約了病原學(xué)的深入研究，全菌疫苗的研制受到很大的限制[9]。同時肺孢子菌的抗原成分復(fù)雜，抗原變異較大。目前對于PCP治療及預(yù)防的關(guān)鍵需求就是要有更為創(chuàng)新的方法[10]。

利用肺孢子菌p55 或重組p55抗原來研究其作用機(jī)制及提高其能夠提供的保護(hù)能力，是未來的發(fā)展方向，在預(yù)防PCP的疫苗研究中比肺孢子菌的主要表面糖蛋白(MSG,gpA) 更受青睞[11-14]。國內(nèi)對PCP的基因疫苗研究中，有段義農(nóng)等[15]采用基因克隆的方法構(gòu)建肺孢子菌 p55抗原基因片段DNA疫苗，馮燕梅[16]選取5個p55蛋白變異體中的p55-v3抗原基因片段構(gòu)建DNA疫苗，刺激機(jī)體均產(chǎn)生一定的體液免疫和細(xì)胞免疫。本研究分析p55抗原含5個變異體，從中選取具有較高的抗原性參數(shù)指標(biāo)的細(xì)胞表位，人工串聯(lián)后形成嵌合體TAG構(gòu)建DNA疫苗，從理論上比單表位基因疫苗具有更好的免疫原性以及更好的抗蛋白變異體的能力，且可實(shí)現(xiàn)單價疫苗多價免疫的效果。為多表位串聯(lián)基因的疫苗研制進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)，是PCP防治研究的創(chuàng)新性探索。

pIRES-hrGFP-1a是一種分子量為5.0 kb的真核表達(dá)載體。在上游啟動子的控制下，其內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)( internal ribosome entry site, IRES) 序列與其相連的基因可同時轉(zhuǎn)錄，以非依賴帽的方式，啟動遠(yuǎn)端mRNA 的翻譯，從而在同一轉(zhuǎn)錄本上翻譯出不同的蛋白。近年來多基因表達(dá)的重要方法，即采用IRES元件代替內(nèi)部啟動子克服了啟動子間的抑制現(xiàn)象，尤其當(dāng)需要目的基因與其后的選擇標(biāo)記基因共同翻譯時。其Amp選擇抗性和多克隆酶切位點(diǎn)能夠克隆大片段目的基因。啟動子CMV和SV40polyA信號可以在哺乳動物細(xì)胞中高表達(dá)重組蛋白。由于pIRES-hrGFP-1a攜帶有hrGFP(綠色熒光蛋白)標(biāo)記基因，當(dāng)把目的片段連接到MCS區(qū)域，在熒光顯微鏡下就可看到綠色熒光；而且IRES后的hrGFP標(biāo)記基因得到表達(dá)，那么IRES元件前的目的基因也一定表達(dá)。迄今為止, 關(guān)于pIRES-hrGFP-1a的研究已經(jīng)廣泛涉及到臨床各個方面。

本研究所采用HEK293細(xì)胞系，是進(jìn)行外源性DNA真核表達(dá)最常用的宿主細(xì)胞之一。本研究成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a/TAG，采用更低毒性、轉(zhuǎn)染率更高的QIANGEN生物公司的創(chuàng)新陽離子脂質(zhì)技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。結(jié)果表明pIRES-hrGFP-1a/TAG重組質(zhì)粒能成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)HEK293細(xì)胞并在蛋白水平上檢測到有效表達(dá)。這為進(jìn)一步研究高效的抗原表位疫苗及人工合成串聯(lián)基因TAG的免疫功能提供了基礎(chǔ)。

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Construction and identification of eukaryotic expression plasmids of synthetic TAG gene ofPneumocystisp55 antigen

FAN Hua,GUO Jiu-ying,MA Su-li,ZHANG Nan,AN Chun-li

(Department of Medical Microbiology and Parasitology,College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang 110122, China)

We constructed eukaryotic expression plasmids of synthetic TAG gene ofPneumocystisp55 antigen to lay the foundation for the of vaccine research of nucleicPneumocystispneumonia. In a series of synthetic genes for the antigen gene TAG by double digestion, it was cloned in pIRES-hrGFP-1a eukaryotic expression vector to construct recombinant plasmids as pIRES-hrGFP-1a/TAG. After propagating inE.coliTG-1, the recombinant plasmids were transfected into HEK293 cells. After 48 h incubation, Western blot was performed to identify the expression of pIRES-hrGFP-1a/TAG antigenic gene. Results showed that construction of pIRES-hrGFP-1a/TAG recombinant plasmid was expressed by restriction enzyme digestion and sequencing, and the sequence was verifyed, successfully transfected into HEK293 cells. Western blot was used to test the effective gene expression in HKE293 cells. In this study, the recombinant plasmids of pIRES-hrGFP-1a/TAG are conducted successfully and expressed in the HEK293 cells, which provide a basis for clarification of immunologic function of pIRES-hrGFP-1a/TAG and study of DNA vaccine.

Pneumocystiscarinii; p55 antigen; tandem antigen gene; eukaryotic cell expression

An Chun-li, Email: cmucl@126.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.05.002

國家自然科學(xué)基金(No.81370189)資助

安春麗，Email：cmucl@126.com

1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，沈陽 110122; 2.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，齊齊哈爾 161005

R382

A

1002-2694(2015)05-0399-04

2014-08-30；

2014-11-22

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 81370189)