楊振泉，饒勝其，高 璐，薛 峰，李 平，方維明，焦新安

副溶血性弧菌Vop T蛋白的表達(dá)及其抗體的毒力菌株特異性研究

楊振泉1,3，饒勝其1，高 璐1，薛 峰2，李 平1，方維明1，焦新安3

目的 研究副溶血性弧菌VopT蛋白的菌群特異性，為建立致病性副溶血性弧菌的快速檢測(cè)方法以及探討VopT的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法 根據(jù)副溶血性弧菌VopT蛋白基因(VPA1327)序列設(shè)計(jì)合成引物，通過PCR從副溶血性弧菌致病株WX06152(血清型O3∶K6)中擴(kuò)增出目的基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a(+)-VPA1327并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白應(yīng)用MALDI-TOF-MS/MS鑒定和His鎳柱純化，并通過免疫BALB/c小鼠制備抗血清，建立副溶血性弧菌VopT蛋白的間接ELISA檢測(cè)方法，并分析其敏感性和毒力菌株特異性。結(jié)果 成功表達(dá)了大小為33 kDa融合蛋白，肽指紋圖譜與副溶血性弧菌VopT蛋白一致。重組VopT抗血清能夠特異性檢測(cè)副溶血性弧菌毒力株的全菌細(xì)胞及其裂解蛋白，與環(huán)境株及其它種屬菌株無明顯交叉反應(yīng)，靈敏度達(dá)到105CFU·mL-1。結(jié)論 重組VopT的抗血清具有良好特異性，為探討VopT致病機(jī)理和分泌機(jī)制研究提供了一定的參考依據(jù)。

副溶血性弧菌；VopT蛋白；原核表達(dá)；多克隆抗體；特異性

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副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)廣泛分布于海水環(huán)境和海產(chǎn)品中，流行病學(xué)研究顯示Vp引起的食源性疾病呈世界性分布，目前已經(jīng)成為沿海國家和地區(qū)面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一[1]。研究表明95%以上的環(huán)境分離株不具有致病性[2]，盡管耐熱性直接溶血素(Thermostable Direct Hemolysin，TDH)以及耐熱相關(guān)溶血毒素(Thermostable Related Hemolysin，TRH)被公認(rèn)的致病性副溶血性弧菌主要的毒力標(biāo)志物，基于這兩個(gè)蛋白及其編碼基因(tdh和trh)的生化及分子方法已被用于副溶血性弧菌毒力株的體外檢測(cè)，但是近年來流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌的臨床分離菌株中存在少數(shù)不含有tdh和trh基因，顯示了流行株還存在新的分子特征的菌群[3]。

VopT是一種具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的效應(yīng)蛋白[4]，它的編碼基因(VPA1327)位于副溶血性弧菌染色體Ⅱ的毒力島上。這種蛋白與綠膿假單胞菌T3SS分泌的雙功能細(xì)胞毒素ExoT和ExoS的ADPRT結(jié)構(gòu)域分別具有45%和44%的同源性，并且VopT基因敲除能夠使副溶血性弧菌毒力株的細(xì)胞毒性顯著減弱，顯示該基因與菌株致病性具有密切關(guān)系[5]。另一方面，VPA1327基因片段顯示了良好的毒力菌株特異性，是副溶血性弧菌毒力菌株檢測(cè)的潛在分子靶標(biāo)[6]，但其編碼產(chǎn)物VopT的作用機(jī)制、菌群特異性及其在致病菌株快速檢測(cè)中的應(yīng)用仍有待深入研究。本研究對(duì)副溶血性弧菌大流行株Vop T的編碼基因VPA1327進(jìn)行表達(dá)和多克隆抗體制備，建立了副溶血性弧菌VopT的ELISA檢測(cè)方法，并驗(yàn)證了Vop T的毒力菌株特異性，為進(jìn)一步探討VopT的作用機(jī)制提供了新參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 副溶血弧菌WX06152(tdh陽性，血清型O3∶K6)為揚(yáng)州大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)以及表達(dá)載體pET-30a(+)為揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶BamHI和Xhol、T4 DNA 連接酶、Taq酶、dNTPs、DNA Marker、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、UNIQ-10柱式DNA凝膠回收試劑盒購自上海生物工程股份有限公司；BALB/c小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；酵母浸出粉、胰蛋白胨、IPTG等生化試劑購自北京奧博星生物技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，所有化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成及基因測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 表達(dá)載體構(gòu)建 副溶血弧菌基因組DNA的提取參考文獻(xiàn)[7]所述方法進(jìn)行。依據(jù)GenBank中副溶血弧菌VPA1327基因序列和表達(dá)質(zhì)粒pET-30a (+)上的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，上游引物VPA1327-F (P1) 為5′-GAAGGATCCGTGAAGGTTTGTAGAATACA-3′，5′端添加BamHI酶切位點(diǎn)；下游引物VPA1327-R (P2)為5′-GAACTCGAGTCACTTAGCTAAATCTAGCG-3′，5′端添加Xhol酶切位點(diǎn)。25 μLPCR擴(kuò)增體系為：模板(50 μg/mL)1 μL； dNTP(10 mmol/mL)0.5 μL；上游引物 (50 pmol/ μL)0.5 μL；下游引物(50 pmol/ μL)0.5 μL；10×Buffer 2.5 μL；MgCl2(2 mmol/L)2 μL；Taq酶(5 U/μL)0.5 μL；ddH2O 17.5 μL；PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 cycles，72 ℃再延伸10 min。

采用常規(guī)分子克隆技術(shù)，將VPA1327基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-30a(+)分別進(jìn)行BamHI和Xhol雙酶切，膠回收目的片段及酶切后的表達(dá)載體，采用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21，于Km+(100 μg/mL)平板上篩選重組子。提取質(zhì)粒后，采用PCR、雙酶切以及測(cè)序鑒定陽性克隆，并用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果和GenBank中所報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3 誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物鑒定 將鑒定結(jié)果為陽性的重組質(zhì)粒pET-30a(+)-VPA1327轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中。挑取上述陽性克隆接種于5 mL LB(Km+)液體培養(yǎng)基中37 ℃活化過夜，次日以1%接種量接入新鮮的LB( Km+)液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.5時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，37 ℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，用PBS重懸沉淀后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，同時(shí)以宿主菌DE3誘導(dǎo)前、pET-30a(+)/DE3誘導(dǎo)前后以及pET-30a(+)-VPA1327/DE3誘導(dǎo)前的全菌體作為對(duì)照。

表達(dá)產(chǎn)物的鑒定應(yīng)用MALDI-TOF-MS/MS進(jìn)行分析，酶解方法：Trypsin酶解；質(zhì)譜參數(shù)：ABI 4800 MALDI-TOF質(zhì)譜儀；YAG激光源，波長355 nm，頻率200 Hz；采用陽離子工作反射模式進(jìn)行MS/MS檢測(cè)，離子加速電壓為20 kv；使用標(biāo)準(zhǔn)肽混合物(Angiotensin II Mr1046.5420； Angiotensin I Mr1296.6853；Substance P Mr1347.7361；Bombesin Mr1619.8230； ACTH clip 1-17 Mr2093.0868；ACTH clip 18-39 Mr2465.1990；Somatostatin 28 Mr3147.4714)作為外標(biāo)校正。

1.4 重組蛋白純化 對(duì)于成功表達(dá)出重組蛋白的 BL21(DE3)按 1%比例接種后擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，4 ℃離心收集細(xì)胞并洗滌后，冰浴超聲裂解細(xì)胞，4 ℃，10 000 r/min離心20 min，收集包涵體并用1% Triton X-100洗滌后，用變性液(1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0，8 mol/L尿素，5%甘油)溶解，接著用變性液平衡過的Ni-NTA柱進(jìn)行親和層析，先用含50 mmol/L 咪唑的變性液充分洗去雜蛋白后，再用含300 mmol/L咪唑的變性液洗脫目標(biāo)融合蛋白。將Ni-NTA柱純化后收集的目標(biāo)蛋白溶液裝入透析袋(截留分子量10 kDa)，放入復(fù)性緩沖液中，于4 ℃磁力攪拌(轉(zhuǎn)速150 r/min)，進(jìn)行尿素濃度梯度透析。透析復(fù)性液為：25 mmol/L Tris-HCl (pH 7.3)，0.15 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1.5 mmol/L GSH，0.3 mmol/L GSSG，5%甘油，0～6 mol/L尿素。每隔8 h換一緩沖液，依次為含6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L與0 mol/L尿素的復(fù)性液，最后對(duì)含0.9% NaCl的生理鹽水(pH 7.3)進(jìn)行透析。用SDS-PAGE分析純化復(fù)性后的目標(biāo)蛋白，并用灰度掃描軟件分析蛋白純度。

1.5 多克隆抗體制備 取10只6周齡的BALB/c小鼠，將表達(dá)蛋白產(chǎn)物用PBS稀釋成3 mg/mL，首次免疫將蛋白與弗氏完全佐劑以1∶1的體積比混合，充分乳化后，每只小鼠經(jīng)腹部皮下注射400 μL；分別于首次免疫后的第3和第5周進(jìn)行加強(qiáng)免疫, 每次用3 mg/mL表達(dá)蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合，充分乳化后，對(duì)小鼠進(jìn)行腹部皮下注射，每只小鼠經(jīng)腹部皮下注射400 μL。取2只BALB/c小鼠以PBS和弗氏完全佐劑混合作為抗原免疫，作為陰性對(duì)照，免疫程序同上。第3次免疫后第10 d眼眶采血，分離血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆??？寡宓男r(jià)采用間接ELISA方法檢測(cè)，分別以經(jīng)超聲處理(200 W，持續(xù)10 s，間隔5 s，共10次)的副溶血弧菌裂解蛋白和重組蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，以未經(jīng)免疫的鼠血清作為陰性對(duì)照，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果確定抗體的效價(jià)。

1.6 抗血清反應(yīng)性和敏感性試驗(yàn) 抗血清對(duì)副溶血性弧菌的反應(yīng)性和敏感性的通過間接ELISA方法檢測(cè)。包被抗原采用菌株WX06152的細(xì)胞、細(xì)胞裂解蛋白以及培養(yǎng)物上清。將副溶血弧菌WX06152于37 ℃，150 r/min培養(yǎng)3 h、6 h、9 h和12 h，培養(yǎng)物通過離心分離菌體和培養(yǎng)上清。菌體經(jīng)過3次洗滌后用PBS制備成108CFU·mL-1的菌懸液。細(xì)胞裂解蛋白通過菌懸液超聲處理(200 W，持續(xù)10 s，間隔5 s，共10次)后離心收集。將上述組分用PBS緩沖液10倍稀釋后為抗原包被酶標(biāo)板，每樣設(shè)3個(gè)平行孔，以1∶400、1∶800和1∶1 600稀釋的抗血清作為檢測(cè)抗體，1∶10 000稀釋的HRP酶標(biāo)羊抗鼠IgG作為二抗，按照間接ELISA程序進(jìn)行反應(yīng)，OPD顯色后測(cè)定OD492值。陰性對(duì)照為同樣稀釋度的陰性血清。陽性血清和陰性血清的比值(P/N)最大的組合作為最佳抗原和抗體的工作濃度，P/N≥2.1判定為陽性。

1.7 抗血清交叉反應(yīng)試驗(yàn) 將6株不同來源的副溶血弧菌菌株、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃，150 r/min培養(yǎng)12 h，離心收集的菌體細(xì)胞，制備106CFU·mL-1的菌懸液，通過超聲處理(參數(shù)同1.7)制備菌體蛋白作為包被抗原，以1∶800稀釋的抗血清作為檢測(cè)抗體，1∶10 000稀釋的HRP酶標(biāo)羊抗鼠IgG作為二抗，同樣稀釋度的陰性血清為對(duì)照，建立間接ELISA檢測(cè)方法。通過比較P/N值檢測(cè)抗血清是否具有交叉反應(yīng)，P/N≥2.1判定為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增和表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果 根據(jù)VopT編碼基因VPA1327序列設(shè)計(jì)引物VPA1327-F和VPA1327-R，建立優(yōu)化的PCR體系擴(kuò)增目的基因，并克隆至表達(dá)載體pET-30a(+)的多克隆位點(diǎn)中，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果成功從副溶血性弧菌WX06152株(血清型O3∶K6)基因組DNA中擴(kuò)增出目的基因片段，片段大小為711 bp，與預(yù)期值相符(泳道4)。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a(+)-VPA1327經(jīng)BamHI和Xhol雙酶切消化后出現(xiàn)兩條條帶，一條與經(jīng)雙酶切的空質(zhì)粒pET-30a(+)大小一致(泳道2)，另一條帶分子量為711 bp，與預(yù)期大小一致(泳道1)。重組質(zhì)粒能夠擴(kuò)增出目的條帶(泳道3)，大小與基因組模板擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致(泳道4)，而以空質(zhì)粒模板未擴(kuò)增出任何條帶(泳道5)。重組質(zhì)粒進(jìn)一步應(yīng)用T7通用引物測(cè)序，結(jié)果顯示，克隆序列與GenBank中發(fā)表的VPA1327序列同源性達(dá)100%，且基因沒有發(fā)生移碼和突變。以上結(jié)果表明目的基因VPA1327已成功克隆入表達(dá)載體pET-30a(+)中。

泳道M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1和2，重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；泳道3、4和5，重組質(zhì)粒、基因組DNA以及空質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；箭頭方向?yàn)槟康幕驐l帶(711 bp)。

Lane M: DNA ladder; Lane 1 and 2: enzyme-digested products of recombinant and empty plasmid; Lane 3, 4 and 5: PCR amplicons of recombinant plasmid, genomic DNA and empty plasmid; Arrow means aim gene band (711 bp).

圖1 VopT基因的PCR擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果

Fig.1 Results of PCR amplification of VopT gene and construction of expression plasmid

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化結(jié)果 將重組質(zhì)粒pET-30a(+)-VPA1327轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21(DE3)，通過抗性篩選和PCR鑒定成功獲得了重組表達(dá)菌pET-30a(+)-VPA1327/DE3。通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖2-A所示。重組菌pET-30a(+)-VPA1327/DE3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后在33 kDa處有一條新增蛋白條帶，與預(yù)期的融合蛋白分子量大小一致(泳道5)。宿主菌E.coliBL21(DE3)及空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)前后，以及未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-30a(+)-VPA1327/DE3均沒有產(chǎn)生目的條帶。結(jié)果表明VPA1327在E.coliBL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能成功表達(dá)融合蛋白。誘導(dǎo)后的pET-30a(+)-VPA1327/DE3全菌體經(jīng)超聲處理后的沉淀和上清分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(圖2-A，泳道6和7)，結(jié)果顯示培養(yǎng)上清中不存在重組蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白主要以包涵體形式存在于菌體沉淀中。表達(dá)產(chǎn)物包涵體經(jīng)變性液溶解、His鎳柱純化及尿素濃度梯度透析后取樣用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，在33 kDa處出現(xiàn)清晰條帶, 其他蛋白雜帶不明顯(圖2-B) , 經(jīng)灰度掃描分析蛋白純度大于90%。

2.3 重組蛋白質(zhì)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定 重組蛋白質(zhì)進(jìn)行割膠回收、脫色和膠內(nèi)Trypsin酶解，產(chǎn)物應(yīng)用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，獲得的肽片段質(zhì)量數(shù)據(jù)通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Mascot(http://www.matrixscience.com)進(jìn)行檢索，結(jié)果顯示重組蛋白與庫中副溶血性弧菌推測(cè)胞外酶VopT序列(VPA1327的編碼產(chǎn)物)的PMF匹配得分最高，達(dá)到263，VopT序列相匹配的肽段覆蓋率達(dá)61%(圖3)，顯示表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列與副溶血性弧菌VopT蛋白一致。

(A)泳道M，蛋白標(biāo)樣；泳道1，DE3未誘導(dǎo)細(xì)胞；泳道2，pET-30a(+)/DE3未誘導(dǎo)細(xì)胞；泳道3，pET-30a(+)/DE3誘導(dǎo)后細(xì)胞；泳道4，pET-30a(+)-VPA1327/DE3未誘導(dǎo)細(xì)胞；泳道5、6和7分別pET-30a(+)-VPA1327/DE3誘導(dǎo)后全細(xì)胞超聲破碎原液、沉淀和上清；(B)泳道M，蛋白標(biāo)樣；泳道1，純化后蛋白樣

(A) Lane M: molecular marker; Lane 1: DE3 cell without being induced; Lane 2: pET-30a(+)/DE3 cell without being induced; Lane 3: induced pET-30a(+)/DE3 cell; Lane 4: pET-30a(+)-VPA1327/DE3 cell without being induced; Lane 5, 6 and 7: culture, cell and supernant of induced pET-30a(+)-VPA1327/DE3.(B) Lane M: molecular marker; Lane 1: purified recombinant product.

圖2 重組蛋白的表達(dá)(A)與純化(B)電泳結(jié)果

Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression (A) and purification (B) of recombinant protein

2.4 抗血清反應(yīng)性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將純化的VPA1327表達(dá)產(chǎn)物免疫6周齡的BALB/c小鼠，加強(qiáng)免疫后眼眶采血并分離抗血清，以陰性血清作為對(duì)照，經(jīng)間接ELISA法檢測(cè)抗血清對(duì)重組蛋白的效價(jià)為1∶25 600。以1∶800稀釋的抗血清作為檢測(cè)抗體，建立ELISA法對(duì)過夜培養(yǎng)的副溶血性弧菌的全細(xì)胞、細(xì)胞裂解蛋白以及培養(yǎng)上清的反應(yīng)性和敏感性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示抗原的細(xì)胞濃度大于105CFU·mL-1時(shí)，全菌包被和超聲波裂解產(chǎn)物包被均檢測(cè)為陽性(P/N>2.1), 但是以培養(yǎng)上清包被的各個(gè)稀釋度均沒有檢出陽性。

2.5 細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)的影 利用不同培養(yǎng)時(shí)間(3 h、6 h、9 h和12 h)的副溶血弧菌WX06152的全細(xì)胞、細(xì)胞超聲裂解物以及培養(yǎng)物上清液作為抗原包被酶標(biāo)板，按照建立的ELISA方法檢測(cè)Vop T，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示3 h和6 h培養(yǎng)物的全細(xì)胞、細(xì)胞裂解物以及培養(yǎng)物上清液中均未檢出Vop T(P/N<2.1)，但在培養(yǎng)9h的全細(xì)胞和細(xì)胞裂解物中Vop T呈明顯陽性(P/N值分別為6.67±2.33和8.53±4.15)，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長P/N值有所上升但不顯著(P>0.05)，12 h 培養(yǎng)物的全細(xì)胞和細(xì)胞裂解物的P/N值分別為7.54±3.12和9.06±4.38；而3～12 h培養(yǎng)物上清液作為包被抗原時(shí)，Vop T始終為陰性(P/N<2.1)。結(jié)果表明副溶血弧菌在生長過程中(3～12 h)，Vop T在生長后期表達(dá)并主要存在于細(xì)胞內(nèi)或者膜表面，分泌到胞外的VopT及其微量，無法通過ELISA檢測(cè)出。因此，選擇培養(yǎng)時(shí)間9 h后的副溶血性弧菌細(xì)胞，經(jīng)過超聲處理形成的裂解物后作為最佳檢測(cè)抗原。

2.6 抗血清交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果 以不同來源的副溶血弧菌菌株以及溶藻弧菌、哈維氏弧菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌的細(xì)胞裂解物(106CFU·mL-1)作為包被抗原，檢測(cè)抗血清的特異性，結(jié)果(如表2所示)顯示只有副溶血性弧菌臨床株檢測(cè)結(jié)果呈陽性(P/N>2.1)，其余細(xì)菌均呈陰性(P/N<2.1)，表明副溶血性弧菌VopT蛋白具有良好的毒力菌株特異性。

注：A原液為108CFU·mL-1菌懸液;B原液為起始濃度為108CFU·mL-1菌懸液裂解產(chǎn)物；C原液為副溶血性弧菌12h培養(yǎng)物上清。OD值為3次測(cè)定的平均值。

Note:AStock solution is bacterial suspension of 108CFU·mL-1;BStock solution is pyrolysis products of 108CFU·mL-1bacteria suspension;CStock solution is culture supernatant ofVibrioparahaemolyticuscultured 12 h.

3 討 論

副溶血性弧菌耐熱性溶血素(TDH)及其編碼基因(tdh)是目前判斷該菌毒力的主要靶標(biāo)。李巧蘋[8]等對(duì)tdh基因進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫學(xué)特性研究，證實(shí)了重組菌表達(dá)的TDH與原始菌株產(chǎn)生的TDH抗原性一致，但是TDH在天然細(xì)菌中表達(dá)量極少，重組蛋白的抗血清卻不與胞外產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)。另一方面流行病學(xué)調(diào)查也顯示了部分臨床菌株并不攜帶tdh基因[3,9]。本研究成功表達(dá)了副溶血弧菌VopT基因 (VPA1327)，通過免疫BALB/c小鼠制備了高效價(jià)的VopT抗血清(1∶25 600)，并且抗血清能夠與副溶血性弧菌的臨床菌株的12 h 培養(yǎng)物的菌體細(xì)胞和菌體裂解蛋白特異性反應(yīng)，顯示了該蛋白在常規(guī)培養(yǎng)12 h后大量存在細(xì)胞膜上，這又可以為副溶血性弧菌毒力菌株菌體細(xì)胞的免疫檢測(cè)提供一個(gè)新的檢測(cè)靶標(biāo)。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間的副溶血性弧菌VopT ELISA檢測(cè)結(jié)果

Fig.4 Result of VopT detecting forVibrioparahaemolyticusat different culture time using ELISA.

注：a包被抗原為106CFU·mL-1的菌懸液裂解物；bOD值為3次測(cè)定的平均值；P、N分別表示陽性血清和對(duì)照血清測(cè)定值。

Notes:aCoating antigen is pyrolysis products of 106CFU·mL-1bacteria suspension;bOD value is average of 3 times; P, N signify testing value of positive serum and control serum respectively.

VPA1327是位于副溶血弧菌染色體Ⅱ上編碼一種推測(cè)胞外酶T的基因[4]，史東升等發(fā)現(xiàn)且該基因是具有副溶血弧菌特異性的基因片段[5]。VopT基因敲除能夠使副溶血弧菌毒力株的細(xì)胞毒性顯著減弱，顯示該基因與副溶血弧菌的致病性具有密切關(guān)系，但是目前對(duì)VopT的致病機(jī)理的研究較少。Kodama等[10]研究認(rèn)為VPA1327的編碼產(chǎn)物(VopT)是一種具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的效應(yīng)蛋白，并且可以通過T3SS2分泌并轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)的。本研究結(jié)果顯示VopT重組蛋白的抗血清只與副溶血弧菌臨床株特異反應(yīng)，而與副溶血弧菌環(huán)境株(非致病性菌株)溶藻弧菌、哈維氏弧菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌無交叉反應(yīng)。盡管VPA1327編碼產(chǎn)物被推測(cè)為胞外酶，但本研究結(jié)果顯示副溶血性弧菌培養(yǎng)9 h后胞內(nèi)VopT大量表達(dá)，但主要存在于胞內(nèi)或者細(xì)胞膜表面，分泌到胞外的VopT無法通過ELISA檢測(cè)出，可能這種蛋白的分泌具有獨(dú)特的機(jī)制。盡管沙門氏菌、志賀氏菌都存在III型分泌系統(tǒng)[10]，但是細(xì)胞裂解物外均未檢測(cè)到VopT，表明VopT可能是副溶血弧菌毒力菌株特有的效應(yīng)蛋白。VopT抗體的獲得為進(jìn)一步研究VopT的分泌機(jī)制和致病機(jī)理提供了材料和方法。

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Expression ofVibrioparahaemolyticusVop T protein and the specificity of its antibody against virulent strain

YANG Zhen-quan1,3,RAO Sheng-qi1,GAO Lu1,XUE Feng2,LI Ping1,FANG Wei-ming1,JIAO Xin-an3

(1.College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China;2.Animal, Plant and Food Inspection Center of Jiangsu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China;3.Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, Yangzhou 225009, China)

The aim of this study is to determine group specificity ofVibrioparahaemolyticusVop T protein and provide bases for establishing a rapid detection method and exploring the mechanism of VopT action. The gene VPA1327 which encode Vop T protein was amplified from pathogenicV.parahaemolyticusstrain WX06152 (serotype O3∶K6) by PCR using a pair of synthesized primers. The resulted amplicon in the size of 711 bp was subcloned into vector pET-30a (+), and the resulted recombinant expression plasmid pET-VPA1327/DE3 was transformed into theE.coliBL21 (DE3). After IPTG induction, a recombinant protein was identified using MALDI-TOF-MS/MS spectrum and purified by His affinity column. The antiserum against the VopT was successfully obtained by immunization of the purified recombinant protein to BALB/c mice, and an indirect ELISA for rapid detecting VopT protein of pathogenicV.parahaemolyticuswas developed using the antiserum as the detective antibody. The result showed that the obtained fussion protein, in the size of 33 kDa, showed the same peptide fingerprint with theV.parahaemolyticusVopT protein. The developed indirect ELISA method can specifically detect bacterial cell and its lysate ofV.parahaemolyticuswith the lowest detective limit of 105CFU mL-1. The result of crossing test showed that the VopT antiserum had good specificity against virulent strains ofVibrioparahaemolyticus, and no cross-reaction observed with environmental strains ofV.parahaemolyticusand selected bacterial strains belonging to other species. The data present in this study provides a new way to understand VopT action mechanism of pathogenicV.parahaemolyticusstrains.

Vibrioparahaemolyticus; VopT protein; prokaryotic expression; polyclonal antibody; specificity

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.05.011

1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，揚(yáng)州 225127; 2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，南京 210001； 3.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 揚(yáng)州 225009

R378

A

1002-2694(2015)05-0441-06

2014-10-09；

2015-02-16

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No. BE2013733)、蘇北科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No. BC2013438)聯(lián)合資助