馬愛靜，王 艷，王 毅，李東迅,許華青,袁雪嬌，劉 凱，葉長蕓

北京市一些地區(qū)生肉標(biāo)本中單增李斯特菌的分離及其分子流行病學(xué)特征分析

馬愛靜1，王 艷1，王 毅1，李東迅2,許華青3,袁雪嬌1，劉 凱1，葉長蕓1

目的 了解北京市一些地區(qū)生肉中單增李斯特菌的污染情況及其分子流行病學(xué)特征。方法 采用北歐食品分析標(biāo)準(zhǔn)(NMKL)對北京市一些地區(qū)采集的340份牛、羊、豬、雞和鴨生肉標(biāo)本進(jìn)行單增李斯特菌的分離鑒定，并對分離菌株進(jìn)行血清學(xué)分型(Serotyping)、脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)分型及多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)分析。結(jié)果 生肉標(biāo)本中單增李斯特菌污染率為6.2%(21/340)。分離菌株含3種血清型(1/2a，1/2b和1/2c)，以1/2c為優(yōu)勢血清型(占47.6%)。PFGE分析中，使用內(nèi)切酶AscI酶切電泳將21株單增李斯特菌分為12個(gè)型別，可聚類為3個(gè)群。MLST分析將21株單增李斯特菌分為7個(gè)ST型，其中 ST9型最多(10株)。結(jié)論 北京市一些地區(qū)的生肉類食品中存在6.2%的單增李斯特菌污染率，這些單增李斯特菌以家系II菌株占據(jù)絕對優(yōu)勢(80.1%)，其中1/2c型，GX6A16.CN0004和ST9型分別為血清型、PFGE帶型以及MLST序列型的優(yōu)勢型別，與我國食源性單增李斯特菌的優(yōu)勢菌群特征一致。

單增李斯特菌；血清型分型；脈沖場凝膠電泳分型；多位點(diǎn)序列分型

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)屬于李斯特菌屬，是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性短桿菌，不形成芽孢和莢膜[1]。該菌在生冷食品和環(huán)境中廣泛存在，可侵襲人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，導(dǎo)致人類和動(dòng)物的李斯特菌病[1-2]。李斯特菌的易感人群為孕婦、新生兒、老人以及免疫低下的人，可導(dǎo)致發(fā)熱性胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等，死亡率較高[3-4]。自1929年丹麥?zhǔn)状螆?bào)道人類感染性李斯特菌病后，該菌引起的感染病例呈上升趨勢[1]。1981年加拿大沿海省份的一起李斯特菌病的暴發(fā)證實(shí)單增李斯特菌可通過食物在人群中傳播[5-6]。1983-2011年間，美國、加拿大、歐洲相繼報(bào)道了12起李斯特菌病的暴發(fā)[7-18]。單增李斯特菌也被世界衛(wèi)生組織列為重點(diǎn)監(jiān)測的食源性病原菌之一[19]。我國于2000年建立了包括單增李斯特菌在內(nèi)的全國食源性致病菌監(jiān)測網(wǎng)。

研究顯示，食入被單增李斯特菌污染的食品是目前引起人類李斯特菌病暴發(fā)和散發(fā)的重要因素[20-21]。為了解生肉類食品中單增李斯特菌的污染情況及菌株的分子流行病學(xué)特征，本研究采集了北京市一些地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場及超市的生肉類食品(豬、牛、羊、雞、鴨肉)，對其進(jìn)行單增李斯特菌的檢測，并對分離到的菌株進(jìn)行血清學(xué)、PFGE以及MLST分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 自2013年11月-2014年4月從北京市不同農(nóng)貿(mào)市場及超市共采集340份生肉類樣品(牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉)，為了使樣本具有充分發(fā)散性，采樣時(shí)將同一采樣時(shí)間、同一攤位、同種類且來自同一切割部位的生肉記為一份樣本，具體信息見表1。

1.1.2 參考菌株 單增李斯特菌參考菌株EGD-e購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，作為單增李斯特菌陽性對照菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑 FRASER BROTH BASE、BRILLIANCETMLISTERIA AGAR BASE培養(yǎng)基購自英國OXOID公司；腦心浸液購自北京陸橋技術(shù)有限公司；2×TaqMasterMix購自北京康為世紀(jì)公司；APIListeria生化試劑條購自法國bioMérieux公司；Goldview DNA染料、DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司；PCR引物合成、PCR產(chǎn)物純化及測序由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.1.4 主要儀器 Labcycler PCR儀購自德國圣歐國際有限公司；電泳槽購自北京博思公司，Gel Doc XR 凝膠成像儀購自美國伯樂公司；脈沖場凝膠電泳儀為CHEF DRIIIsystem(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)為Gel Doc XR+ System(美國Bio-Rad公司)；水浴搖床為Grant OLS2000(英國Grant公司)；濁度儀為Densimat(法國BioMérieuxVitek公司)。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特菌的分離培養(yǎng) 參照北歐食品分析標(biāo)準(zhǔn)(NMKL)中單增李斯特菌的分離方法：稱取25 g不同生肉標(biāo)本接種至225 mL增菌液(Half Fraser’s broth, Oxoid, Hampshire, UK)，30 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。取1 mL增菌液將其接種至10mL Fraser增菌液中，37 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h。取10 μL Fraser增菌液接種至李斯特菌固體顯色培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～36 h，挑取可疑菌落(周圍有透明暈環(huán)的藍(lán)色菌落)接種至腦心浸液固體培養(yǎng)基傳代兩次進(jìn)行純化。

1.2.2 菌株鑒定 刮取適量純培養(yǎng)物至100 μL無菌去離子水中振蕩混勻，100 ℃沸水中煮10 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。提取核酸后用李斯特菌屬及單增李斯特菌的種特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增初步鑒定[22]。對擴(kuò)增結(jié)果為陽性的分離菌，采用APIListeria生化鑒定試劑條進(jìn)行單增李斯特菌種水平的鑒定。

PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×Taq Master Mix 10 μL、無菌蒸餾水7 μL、上下游引物(10 μmoL/μL)各1 μL、模板DNA 1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取6～8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于2.0%瓊脂糖凝膠(陽性參考菌株擴(kuò)增產(chǎn)物作為對照)，220 V電泳20 min，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)讀取結(jié)果。

1.2.3 血清型鑒定 對所有分離得到的單增李斯特菌，采用日本Denka Seiken公司的血清抗體，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行血清型鑒定。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳分型(PFGE)分析 根據(jù)美國CDC PulseNet的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程對單增李斯特菌進(jìn)行脈沖場凝膠電泳分型分析。選用限制性核酸內(nèi)切酶AscI對菌株進(jìn)行酶切電泳，PFGE圖像用BioNumerics(Version5.0)軟件根據(jù)UPGMA(Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages)方法進(jìn)行聚類分析。

1.2.5 多位點(diǎn)序列分型(MLST)分析 單增李斯特菌的多位點(diǎn)序列分型分析方法參照法國巴斯德研究所的單增李斯特菌多位點(diǎn)序列分型數(shù)據(jù)庫操作流程(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.html)，選擇7個(gè)管家基因(abcZ,blgA,cat,dapE,dat,ldh,lhkA)部分片段序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[23]。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果分析時(shí)，用SeqMan II(DNAStar Inc., Madison, WI, USA)軟件并結(jié)合菌株等位基因的正反向序列圖譜對等位基因序列進(jìn)行拼接和校正，將整理好的序列與單增李斯特菌MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定每個(gè)管家基因的序列號。7個(gè)管家基因序列號的組合即為該菌株的ST型。采用BioNumerics軟件將本研究分離的21株單增李斯特菌株和其他不同ST型別的中國單增李斯特菌株[24]構(gòu)建最小生成樹,見圖2。

2 結(jié) 果

2.1 菌株分離情況 本實(shí)驗(yàn)采集的340份標(biāo)本共分離到21株單增李斯特菌，陽性率為6.2%。其中8株分離自雞肉，分離率為22.2%；6株分離自牛肉，分離率7.5%；6株分離自豬肉，分離率為5.0%；1株分離自羊肉，分離率為1.1%。不同食品樣品中單增李斯特菌的分離情況詳見表1。

2.2 血清型分型 21株單增李斯特菌分為3種血清型(1/2a，1/2b和1/2c)，主要血清型為 1 /2c和1 /2a，分別有10株(47.6%)和7株(33.3%)，1/2b血清型有4株(19.0%)(表1)。

2.3 PFGE分型 21株單增李斯特菌使用AscI酶切電泳后分為12種PFGE型別(GX6A16.CN0004,GX6A16.CN0009,GX6A16.CN0011,GX6A16.CN0018,GX6A16.CN0019,GX6A16.CN0029,GX6A16.CN0030,GX6A16.CN0046,GX6A16.CN0054,GX6A16.CN0192,GX6A16.CN0254,GX6A16.CN0284)，見圖1。其中GX6A16.CN0004為主要型別(7株)。采用BioNumerics進(jìn)行菌株間聚類分析，可將21株菌的12種PFGE帶型分為3個(gè)群，各群包含菌株數(shù)不等，其中群I菌株數(shù)最多，包括15株菌(5株1/2a型，10株1/2c型)。群II包含4株菌，其中3株為ST87，1株為ST3，血清型皆為1/2b。群III包括2株菌，皆為ST155型，1/2a血清型(圖1)。

2.4 MLST分型 經(jīng)MLST分型分析，21株單增李斯特菌分為7個(gè)ST型，包括10株ST9型、3株ST87型、2株ST155型、2株ST101型、2株ST121型、1株ST8型、1株ST3型，其中ST9型為優(yōu)勢ST型(見表1、圖1)。最小生成樹結(jié)果顯示，本研究中所分離到的單增李斯特菌株皆分布于我國已報(bào)道的單增李斯特菌主要克隆群[24]，且分別屬于家系I和家系II。

注：*將本研究所分離的21株單增李斯特菌使用內(nèi)切酶AscI進(jìn)行PFGE分析，并根據(jù)UPGMA方法進(jìn)行聚類分析。相應(yīng)的菌株名稱、PFGE型別、菌株來源、ST型別以及血清型見圖右側(cè)。

*The 21L.monocytogenesisolates from this study were analyzed by PFGE usingAscI. The dendrogram were constructed using UPGMA. The corresponding isolate, pulse types, source, STs and serotypes were shown alongside the dendrogram on the right.

圖1 21株單增李斯特菌的PFGE聚類圖、ST型和血清型

Fig.1 Dendrogram of PFGE patterns, MLST types and serotypes of 21L.monocytogenesstrains

注：*每個(gè)圓圈中的數(shù)字據(jù)代表一種ST型，圓圈大小代表菌株數(shù)量，圓圈周圍的陰影區(qū)域表示區(qū)域內(nèi)的ST型屬于同一克隆群(Clone complex，CC)。圓圈內(nèi)不同的顏色表示不同L.monocytogenes來源。

* Each circle corresponds to a sequence type. The size of the circle is proportional to the number of the isolates. The shadow zones in different color correspond to different clonal complexes, and the color within the cycles represents the sources of theL.monocytogenes.

圖2 基于MLST型別的遺傳進(jìn)化分析

Fig.2 Genetic relationship of the isolates based on MLST

3 討 論

單增李斯特菌作為李斯特菌屬中對人致病的菌種，可以侵入宿主細(xì)胞，導(dǎo)致李斯特菌病，致死率較高，且在食品中污染較為嚴(yán)重[1,7-8,25]。本次調(diào)查的生肉類食品中單增李斯特的污染率為6.2%，且在生牛肉、生羊肉、生雞肉、生豬肉中均檢出單增李斯特菌，以雞肉的污染率相對較高。顯示生肉類等食品中存在明顯的單增李斯特菌污染現(xiàn)象，因此食品行業(yè)中此類生肉質(zhì)食品加工過程中一定要注意與熟食分開，避免直接食用被單增李斯特菌污染的熟食。本研究中的牛肉、羊肉、豬肉、雞肉中單增李斯特菌的檢出率低于崔京輝等于2004～2006年對北京市西城區(qū)生肉中單增李斯特菌的檢出率[25]，分析可能與本次調(diào)查的采樣時(shí)間為冬春季節(jié)，氣溫較低不利細(xì)菌生存繁殖有關(guān)。

本研究中分離出的21株單增李斯特菌血清型主要為1/2c，其次為1/2a型，而部分西方國家單增李斯特菌則為1/2a型占有絕對優(yōu)勢，1/2c血清型則相對較少[26]。表明我國食源性單增李斯特菌的血清型別組成與其他國家有所差異。PFGE分型分析可以反映出菌株核酸間的相似度，因而可作為暴發(fā)時(shí)菌株溯源的依據(jù)。本研究中所分離的單增李斯特菌株P(guān)FGE型別以GX6A16.CN0004為優(yōu)勢型別，與我國食源性單增李斯特菌的優(yōu)勢型別一致[24]。多位點(diǎn)序列分型分析發(fā)現(xiàn)，本次調(diào)查中所分離的菌株，以ST9型為主，其血清型皆為1/2c。從最小生成樹可以看出這些菌株主要集中在家系I和家系II(圖2)。PFGE結(jié)果聚類分析顯示，群II所含菌株包括ST3和ST87兩個(gè)型別(圖1)，血清型均為1/2b，是引起人類李斯特菌病的常見血清型，這4株菌均從雞肉中分離獲得，應(yīng)對此污染現(xiàn)象加以重視。21株分離株中有6株菌的PFGE、MLST以及血清型結(jié)果均相同，這些菌株分別來自同一地區(qū)豬肉、牛肉、雞肉3種不同的生肉樣本，且采樣時(shí)間為同一天。由于部分標(biāo)本采集的背景信息不完整，無法確定這幾株菌是否是來自于同一超市或者市場(及攤位)的標(biāo)本，推測可能部分市場或者超市的各種生肉食品存在相同的污染來源，或者同一超市或市場生肉食品間存在交叉污染的可能性。因此各超市或者市場中不同生肉食品的分類儲存很有必要。

單增李斯特菌作為重要的食源性病原菌之一，得到了WHO 和各國的高度重視。美國將單核細(xì)胞增生李斯特菌列為7種主要食源性致死病原菌之一，由此菌引起的李斯特菌癥病例呈上升趨勢[19]。我國自2000年建立全國食源性致病菌監(jiān)測網(wǎng)以來，對單增李斯特菌的監(jiān)測力度逐年加大。本次研究結(jié)果顯示，單增李斯特菌在生禽畜肉類食品中存在不同程度的污染，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對生肉類食品的生產(chǎn)及銷售環(huán)節(jié)的病原學(xué)監(jiān)測，以預(yù)防食源性李斯特菌病的發(fā)生，降低暴發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)。

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Molecular epidemiological characteristics ofListeriamonocytogenesisolated from raw meat samples in some regions of Beijing, China

MA Ai-jing1,WANG Yan1,WANG Yi1,LI Dong-xun2,XU Hua-qing3,YUAN Xue-jiao1,LIU Kai1,YE Chang-yun1

(1.State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;2.Department of Microbiology, Medical College of Guiyang, Guiyang 550004, China;3.Department of Dermatology, the Sixth People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450000, China)

Listeriamonocytogenes(L.monocytogenes) is one of the most significant human pathogenic bacteria, as it causes serious invasive illnesses and is mainly transmitted through the food chain. Thus, an epidemiologic study, which investigates the prevalence and molecular characteristics of this pathogen involving raw materials contamination, is extremely required to ensure food safety, evaluate the potential health risk, and provide the control strategies. A total of 340 raw meat samples, including pork, beef, lamb, chicken and duck products, were collected from several local markets in Beijing, and theNMKLNo. 136 method was selected for the isolation ofL.monocytogenesfrom various raw meat samples. Then, the serological classification, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis and multi-locus sequence typing (MLST) were performed to provide the valuable strain discrimination. Among 21 strains ofL.monocytogenesisolated, accounting for 6.2% (21/340) contamination rate, three serotypes were detected and distinguished, including serovars 1/2a (7), 1/2b (4) and 1/2c (10), and the serotype 1/2c accounted for 47.6% of all isolates. The PFGE typing byAscIdivided the 21 isolates into 12 pulse types (PTs) that were assigned to 3 clusters. The result of MLST showed 7 different sequence types and the predominant STs was ST9 (10). Accordingly, the food sources contaminated byL.monocytogeneswas confirmed in Beijing by our study, and serotype 1/2c, GX6A16.CN0004 and ST9 were the predominant serotype, pulse type and sequence type, respectively. The result of molecular subtypes indicated that common serotypes, PTs and STs in Beijing had the similar prevalent trends as that in rest of China.

Listeriamonocytogenes; serotype; PFGE; MLST

Ye Chang-yun, Email: yechangyun@icdc.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.05.003

國家重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)(No.2011ZX10004-001,No.2013ZX10004-101)聯(lián)合資助

葉長蕓，Email：yechangyun@icdc.cn

1.傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206； 2.貴陽醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，貴陽 550004； 3.鄭州市第六人民醫(yī)院皮膚性病科，鄭州 450000

R378

A

1002-2694(2015)05-0403-05

2015-01-05；

2015-03-16

Supported by the National Major Science and Technology Project of Prevention and Control in Significant Infectious Disease (Nos. 2011ZX10004-001 & 2013ZX10004-101)