（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究進(jìn)展

范巖巖，張廷榮

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種高度接觸性傳染病，尤其是對(duì)母豬，該病毒嚴(yán)重影響其繁殖性能。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以其快速、可靠的診斷技術(shù)，為檢測和診斷PRRSV開辟了新方法。文內(nèi)對(duì)國內(nèi)外實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在PRRSV研究中的應(yīng)用作了綜述。

實(shí)時(shí)定量PCR；檢測；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；鑒別診斷

實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR（Realtime PCR）技術(shù) 在1996年 由美國Applied Biosystems公司推出。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，其與常規(guī)PCR相比，它具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、能夠解決PCR污染問題等特點(diǎn)，目前已在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。

1??實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)原理

Real-time PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成3個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、熒光背景信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。

1.1 工作原理

在PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅熒光基團(tuán)吸收；剛開始時(shí)， 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，只有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的量形成完全同步[1]。

1.2 定量原理

在Real-time PCR反應(yīng)的指數(shù)擴(kuò)增階段，首先設(shè)定一定的熒光信號(hào)的域值，一般這個(gè)域值是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，若測到熒光信號(hào)超過域值，就被認(rèn)為是真正的信號(hào)，可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)Ct。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由于本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)參數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)[2-4]。

1.3 熒光標(biāo)記探針

目前國內(nèi)外已經(jīng)研究出幾種相關(guān)的技術(shù)，總體上可分為水解探針和雜交探針2類。水解探針有TaqManTM、TaqMan MGB、Universal probe library LNA等； 雜 交 探 針 有Scorpions TM/Amplifluor TM、Dual-oligo FRET pairs、Molecular Beacons、LUX等[5]。

2??實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在PRRSV上的定量檢測及診斷

2.1 PRRSV定量檢測

PRRS被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)最為重要的傳染病之一，是由于受到PRRSV感染。2006年我國多個(gè)省份的養(yǎng)豬場出現(xiàn)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫情，使養(yǎng)豬業(yè)蒙受了重大的經(jīng)濟(jì)損失。國外對(duì)此病毒作了較多的研究，如公豬感染PRRSV后，發(fā)現(xiàn)其精液品質(zhì)下降，影響公豬繁殖性能[6-8]。因此如能在早期診斷中加以鑒別，采取相應(yīng)的預(yù)防治療措施，對(duì)動(dòng)物群體疫病的防治具有重要意義，但常規(guī)診斷方法由于其自身的缺陷很難滿足實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中的需要。常規(guī)PCR存在自身的缺點(diǎn)，其實(shí)驗(yàn)周期長、成本高且容易發(fā)生交叉感染，導(dǎo)致無法對(duì)PRRSV準(zhǔn)確定量，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)PRRSV的定性，而且還實(shí)現(xiàn)了對(duì)PRRSV的定量檢測。

國外學(xué)者E.Christoph[9]等報(bào)道了一種基于TaqMan技術(shù)的實(shí)時(shí)PCR，對(duì)PRRSV最低檢測量為1TCID50。黃娟等[10]在TaqMan技術(shù)基礎(chǔ)上建立了快速定量檢測PRRSV的Real-Time PCR方法，并用該方法檢測患病豬的肺臟等樣品，具有較高的特異性和重復(fù)性，設(shè)定PRRSV細(xì)胞培養(yǎng)物的檢測下限為0.01TCID50，比常規(guī)RT-PCR的敏感性高100倍，對(duì)10份PRRS疑似豬肺臟樣品檢測出5份為陽性，與病毒分離的陽性符合率為100%。建立的PRRSV實(shí)時(shí)PCR方法敏感性高，特異性強(qiáng)，操作方便快速，而且不容易造成分子生物學(xué)方面的污染，可為PRRSV診斷、感染和監(jiān)測、進(jìn)出口肉品安全檢測及PRRSV致病機(jī)理等基礎(chǔ)研究提供了有效手段。

對(duì)于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）的檢測，2008年Xiao等[11]建立了專門針對(duì)HPPRRSV的熒光定量RT-PCR方法，該方法敏感性可達(dá)到1個(gè)TCID50/ mL。但該方法不能檢測到經(jīng)典美洲型PRRSV，也不能判定樣品是否有經(jīng)典毒株和高致病毒株。楊宗照等[12]根據(jù)GenBank中的HP-PRRSV基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立一種基于SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)PCR檢測HPPRRSV的方法。結(jié)果表明，該方法能夠檢測到HP-PRRSV的存在，不與其他豬源病毒發(fā)生非特異性反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍覆蓋了 1×102～1×1011拷貝 /2 μL。與常規(guī)PCR方法相比，兩者的符合率100%。該方法具有快速、簡便、敏感等優(yōu)點(diǎn)，具有重要的實(shí)用價(jià)值。

牛偉等[13]針對(duì) PRRSV ORF5 結(jié)構(gòu)蛋白基因設(shè)計(jì)了引物，應(yīng)用 Realtime PCR 技術(shù)對(duì)不同疑似發(fā)病豬場采集的病料進(jìn)行了檢測，對(duì)反應(yīng)條件優(yōu)化、繪制出 SYBR GreenⅠ熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)其特異性、重復(fù)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度較好，PCR 的擴(kuò)增效率也比較好，可見 Real-time PCR 檢測方法具有較高的可重復(fù)性，從而保證了不同樣品間檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品 PRRSV分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析表明，所建立的Real-time PCR 在組間和組內(nèi)都具有良好的重復(fù)性(P＞0.05)，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。陰性對(duì)照沒有出現(xiàn)特性擴(kuò)增。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及其變異株不僅特異性好、靈敏度高，且快速簡便。

2.2 PRRSV的鑒別及其診斷

該病自1987年首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)于美國以來，現(xiàn)已遍及世界各主要養(yǎng)豬國家和地區(qū)。PRRSV可分為歐洲型和美洲型，二者基因組序列差異相對(duì)較大，分別以1991年荷蘭分離的LV和1992年美國分離的VR-2332為代表毒株。該病在我國呈蔓延趨勢(shì)，流行毒株為美洲型。國外學(xué)者M(jìn) Spagnuolo-Weaver等[14]在2000年首先建立了檢測SYBR GreenⅠ熒光信號(hào)的歐洲型和美洲型PRRSV的熒光定量PCR方法來鑒別這2種抗原型。傳統(tǒng)診斷方法費(fèi)時(shí)、準(zhǔn)確性低，而多重 PCR 不僅保留了普通 PCR 特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)且可在同一體系中擴(kuò)增多個(gè)病原的基因片段，具有節(jié)約時(shí)間、節(jié)省人力物力等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)膊∽龅娇焖?、?zhǔn)確的診斷，適合大量臨床樣品，特別是混合感染樣品中多種病原體的快速檢測[15-16]。

2006年春季以來，豬“高熱綜合征”在我國南方大部分地區(qū)流行，該病流行范圍廣、傳播速度快、持續(xù)時(shí)間長，蔓延到全國大部分地區(qū)。經(jīng)查明導(dǎo)致該疫情的病原是HP-PRRSV。

Bernhard Z等 研 究 得 到HPPRRSV在Nsp2固定區(qū)域缺失90個(gè)核苷酸，這為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法鑒別HP-PRRSV提供了理想位點(diǎn)。徐引弟等[17]參考PRRSV的Nsp2基因序列，在Nsp2大缺失區(qū)下游的保守區(qū)設(shè)計(jì)了1條下游引物，在小缺失區(qū)設(shè)計(jì)1條上游引物，用于變異株的擴(kuò)增。在大缺失區(qū)內(nèi)部設(shè)計(jì)1條上游引物，與變異株共用下游引物，用于普通株的擴(kuò)增，建立了PRRSV變異株與普通株二重RT-PCR鑒別方法。建立的RT-PCR方法用于臨床病料的檢測，部分陽性結(jié)果測序，變異株序列與報(bào)道的序列同源性在97%以上。結(jié)果表明，該方法特異、快速、簡便，可以用于PRRSV變異株和普通株的鑒別。張文利等[18]在PPRSV的Nsp2基因和ORF7基因區(qū)域分別設(shè)計(jì)不同熒光標(biāo)記的MGB探針及特異性引物。這2種探針能夠分別特異結(jié)合GDrl80疫苗株、GD野毒株。該方法一次檢測就能夠同時(shí)區(qū)別GDrl80株與其他病毒株，對(duì)疫苗的純凈性檢測、田間使用后的跟蹤及與野毒感染的鑒別檢測均具有重要作用。

2.3 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測

Wernike K等[19]建立了一種鑒別PRSSV變異型、美洲型和歐洲型的多重Real-time PCR，該方法敏感性高，能夠從樣品中檢測出少于200拷貝/ μL歐洲型PRRSV以及20拷貝/μL的美洲型和變異型PRRSV。施開創(chuàng)等[20]首次利用2對(duì)引物和3條探針，研究建立區(qū)分野毒株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan熒光定量RT-PCR，為PRRSV美洲型野毒株、疫苗株的快速鑒別檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)手段。 曲哲會(huì)等[21]根據(jù)GenBank中登陸的PRRSV經(jīng)典株、HP-PRRS株和CSFV（豬瘟病毒）基因組全系列，分別設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，可同時(shí)對(duì)PRRSV和CSFV進(jìn)行檢測，同時(shí)可以鑒別PRRSV經(jīng)典株和HP-PRRSV株，為2種疫病的鑒別和混合感染的診斷提供了一種病原快速檢測的方法。該方法特異性的檢測PRRSV經(jīng)典株、HPPRRS株和CSFV，具有良好的特異性。

3??存在的問題

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)很多，但是在Real-time PCR技術(shù)中，無論是相對(duì)量還是標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法都存在著一些問題：

1）在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，標(biāo)準(zhǔn)品的制備是一個(gè)必不可少的過程，目前由于無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品不相同，致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性；

2）Real-time PCR用 于 研 究mRNA時(shí)，受到不同RNA樣本和不同逆轉(zhuǎn)錄效率的限制；

3）運(yùn)用封閉式的檢測，減少了擴(kuò)增后電泳的檢測步驟，無法確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大?。?/p>

4）由于熒光素種類以及檢測光源的局限性，從而相對(duì)地限制了Realtime PCR檢測應(yīng)用能力；

5）自動(dòng)化儀器和試劑成本比較高。

4??發(fā)展前景

隨著技術(shù)不斷改進(jìn)和發(fā)展，目前實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已成為科研的主要工具，一方面實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合使定量極微量的基因表達(dá)或DNA拷貝數(shù)成為可能。此外， Real-time PCR技術(shù)在動(dòng)物檢疫和環(huán)境監(jiān)測等方面也得到了廣泛的應(yīng)用，該技術(shù)未來的應(yīng)用前景是令人鼓舞的。

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的發(fā)展使得研究人員又多了一種比較簡單且自動(dòng)化的手段去研究許多重要的基礎(chǔ)課題。雖然此技術(shù)仍存在一些不足需要改進(jìn)，但是它為實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在常規(guī)診斷檢測中的運(yùn)用打下了良好的基礎(chǔ)，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)將成為未來分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的研究工具。它為研究PRRSV 提出了新思路，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PRRSV進(jìn)行較準(zhǔn)確的定量，也為PRRSV與其混合感染的診斷提供了一種新途徑。

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