(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬星狀病毒的病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，姚春陽，王 艷，李 峰

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬星狀病毒（PAstV）是一種嚴(yán)重危害哺乳期仔豬的人獸共患病病原，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。通過對PAstV的病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展作一簡要概述，為科研人員加強(qiáng)對其的深入研究及了解仔豬病毒性腹瀉疫情的整體概況提供參考。

豬星狀病毒；病原學(xué)；檢測；研究進(jìn)展

豬星狀病毒（PAstV）為星狀病毒科成員。星狀病毒（AstV）是一類廣泛存在于人和多種哺乳動物及鳥類的人獸共患病病原，廣泛分布于世界各地。AstV目前已經(jīng)從人、豬、牛、犬、水貂等31種哺乳類動物和雞、火雞、鴨和鴿子等6種禽類中檢出，而且其宿主范圍仍呈現(xiàn)出不斷擴(kuò)大的趨勢[1]。PAstV對哺乳期仔豬侵害較大，常引起腹瀉、脫水和嘔吐等臨床癥狀，導(dǎo)致乳豬生長遲緩，嚴(yán)重者可引起死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失。目前，本病尚無治療藥物和預(yù)防疫苗。本文就PAstV的由來和發(fā)現(xiàn)、病毒的分類地位、流行病學(xué)及檢測方法等研究現(xiàn)狀作一簡要概述，以期為疾病的有效防控提供參考。

1??病毒的由來和發(fā)現(xiàn)

AstV首次于1975年由Appleton和Higgins[2]用電鏡檢測胃腸炎患兒糞便標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于電鏡下病毒粒子呈星形，因此被Madeley和Cosgrove命名為星狀病毒[3]。PAstV首次由Bridger通過電鏡在3周齡的乳豬腹瀉糞樣中觀察到，隨后日本、南非、捷克、哥倫比亞、匈牙利、加拿大、美國及中國等國家均有從豬腹瀉糞樣中檢測到PAstV的報(bào)道。Shimizu等報(bào)道PAstV在豬群中普遍存在，而且常同冠狀病毒、嵌杯狀病毒、輪狀病毒及其他腸道病毒混合感染造成豬急性胃腸炎。有學(xué)者認(rèn)為PAstV是引起近年來仔豬病毒性腹瀉疫情的主要病原之一。

2??病毒的分類地位

星狀病毒科分為哺乳動物星狀病毒屬和禽星狀病毒屬。PAstV屬于哺乳動物星狀病毒屬，還包括人星狀病毒、牛星狀病毒、貓星狀病毒和綿羊星狀病毒等，該屬以人星狀病毒作為代表種。禽星狀病毒屬包括鴨星狀病毒，火雞星狀病毒和禽腎炎病毒，以火雞星狀病毒為代表種[4]。

3??病毒的病原學(xué)特征

3.1 病毒的形態(tài)及理化特性

PAstV為無囊膜的單股線狀RNA病毒[5]，Shimizu等（1990）觀察到病毒粒子呈球形，直徑約30 nm，有許多粒子呈六角或五角的星樣結(jié)構(gòu)，同時(shí)還觀察到一些空殼粒子。PAstV對氯仿和乙醚等有機(jī)溶劑、高濃度的鹽、表面活性劑（1%SDS）、胰蛋白酶及兩性離子消毒劑等穩(wěn)定，但不耐受3M尿素的處理（37 ℃，30 min）。病毒對酸（pH3.0）稍微不穩(wěn)定，對熱處理穩(wěn)定，能抵抗50 ℃1 h，60 ℃5 min[6]。

3.2 病毒的基因組結(jié)構(gòu)及功能

PAstV只有一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白。蘭家暖等[7]在國內(nèi)首次從豬腹瀉糞樣中擴(kuò)增出PAstV衣殼蛋白ORF2基因。劉歡[8]通過采用PCR及RACE技術(shù)，基本實(shí)現(xiàn)了分離病毒PAstV-GXl擴(kuò)增的全基因組序列，所獲得全長為6 342 bp，基因組包含大部分ORFla、完整的0RF2、ORFlb、3'非編碼區(qū)及poly（A）。PAstV目前發(fā)現(xiàn)5個(gè)差異顯著的基因型（PAstVl-PAstV5）。不同地區(qū)存在不同的流行毒株，我國的流行毒株為PAstV1型。

3.3 病毒的培養(yǎng)特性

與其他腸道病毒相似，PAstV在體外培養(yǎng)時(shí)，需要在培養(yǎng)液中額外添加胰酶。Lee等發(fā)現(xiàn)PAstV在沒有胰酶存在的條件下，即使延長病毒的吸附時(shí)間也很難實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中的感染。劉歡（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在添加胰酶時(shí)，病毒的感染性通過觀察細(xì)胞病變（CPE）就可以發(fā)現(xiàn)明顯高于不添加胰酶的病毒。

4??病毒的致病性

目前PAstV引起腹瀉的機(jī)制仍不完全清楚，可能是病毒侵入機(jī)體后，破壞小腸黏膜及絨毛上皮細(xì)胞，使腸吸收功能受損，分泌增加；也可能是引起小腸上皮細(xì)胞屏障通透性增加，最終導(dǎo)致滲透性腹瀉。Bridger報(bào)道，用含有PAstV、嵌杯狀病毒、非典型輪狀病毒和腸道病毒的糞便過濾液接種新生仔豬后出現(xiàn)厭食、腹瀉和生長受阻，最后死亡。但這種接種方法不能代表PAstV的致病性。Shimizu等用克隆化的PAstV接種4日齡的仔豬后出現(xiàn)溫和性腹瀉，并且在糞便中能檢測到PAstV。PAstV有感染人類或其他物種的可能性，隱性感染豬可作為PAstV的儲存宿主及持續(xù)傳染源而感染人或其他動物。Jonassen等研究發(fā)現(xiàn)人、貓星狀病毒和PAstV遺傳距離最相近，提示星狀病毒在進(jìn)化過程中存在種間交叉?zhèn)鞑?，有可能是豬傳給貓或貓?jiān)賯鹘o人以及可通過中間宿主進(jìn)行傳播。Ulloa等發(fā)現(xiàn)，來自住在同一棟房子的人及豬腹瀉樣品中人星狀病毒和PAstV部分基因出現(xiàn)重組，認(rèn)為星狀病毒可能存在種間交叉?zhèn)鞑ァ?/p>

5 病毒的流行病學(xué)特點(diǎn)

PAstV自然感染多發(fā)生于1日齡至8周齡的仔豬?；钾i腹瀉，呈糊狀乃至黃色水瀉。PAstV感染主要發(fā)生于天氣寒冷及氣溫多變的冬春季節(jié)，具有一定的流行性。蘭加暖等通過檢測帶有腹瀉癥狀的豬群糞便，發(fā)現(xiàn)PAstV的流行率為40.3%，豬場陽性率更是高達(dá)80%以上。綜合國內(nèi)外PAstV流行病學(xué)調(diào)查資料，可知PAstV的流行率在0%～83%之間。

6??病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

6.1 電鏡檢查

直接電鏡檢查在星狀病毒感染的早期研究中發(fā)揮了重要的作用。Appleton等（1975）首次用電鏡發(fā)現(xiàn)了星狀病毒。將糞便樣本用蒸餾水稀釋成20%懸液，離心后取上清液，用1%磷鎢酸鉀液（pH7.0）染色后，電鏡檢查。如果糞便中有星狀病毒存在，根據(jù)其特有的星狀結(jié)構(gòu)、28～30 nm直徑等特征較易檢出。該法價(jià)格昂貴，技術(shù)條件要求高，不適合大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。

6.2 病毒的分離培養(yǎng)

由于星狀病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)比較困難，而且多數(shù)星狀病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中不產(chǎn)生CPE，給病毒分離工作帶來了難度。Lee等研究發(fā)現(xiàn)在添加胰酶的條件下，人星狀病毒可在人胚胎腎細(xì)胞（HEK）、恒河猴腎細(xì)胞（LLC-MK2）及原代狒狒腎細(xì)胞中增殖。Shimizu等用豬胚腎建立的細(xì)胞系首次從患急性胃腸炎的豬中分離到一株能引起CPE的PAstV，該病毒引起的CPE特征表現(xiàn)在能使細(xì)胞增大和在胞漿中有細(xì)小顆粒出現(xiàn)。Willcocks等采用傳代細(xì)胞系人類結(jié)腸癌細(xì)胞直接從糞便標(biāo)本中分離星狀病毒并獲得成功，而無需先在HEK細(xì)胞中進(jìn)行傳代。近年來，國內(nèi)外也有關(guān)于利用PK-15細(xì)胞系成功分離PAstV的報(bào)道。商曉桂[9]通過對上海郊區(qū)某豬場疑似PAstV感染豬的糞樣進(jìn)行病毒分離和純化，獲得一株能在PK-15細(xì)胞上增長繁殖，并使該細(xì)胞產(chǎn)生破碎、脫落等CPE的病毒。蘭家暖等[10]用PK-15細(xì)胞從PAstV廣西流行株中分離到2株具有CPE和致病性的PAstV。劉歡（2014）首次使用TPCK處理過的胰酶，成功實(shí)現(xiàn)了PAstV在PK-15中的穩(wěn)定增殖。對細(xì)胞培養(yǎng)物中分離到的病毒，可用電鏡及免疫熒光試驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定。

6.3 血清學(xué)檢測技術(shù)

星狀病毒在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的大量增殖，可用于制備不同血清型的單克隆和多克隆抗體，從而促進(jìn)了星狀病毒免疫學(xué)檢測方法（如ELISA、免疫熒光等）的發(fā)展。ELISA的優(yōu)點(diǎn)是抗原抗體均可檢測，便利、快速、特異性強(qiáng)，并可用于分型研究，缺點(diǎn)是敏感性略低于電鏡，且無法分辨是野毒感染還是疫苗免疫結(jié)果。免疫熒光試驗(yàn)主要用于對細(xì)胞培養(yǎng)物或組織切片中星狀病毒的檢測，還可檢測病毒在細(xì)胞中的增殖特性和規(guī)律，但被檢病料來源有一定的局限性，用于死亡動物的檢測。目前國內(nèi)外尚沒有商品化的PAstV血清學(xué)檢測試劑盒。

6.4 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

RT-PCR在檢測星狀病毒方面，比ELISA具有更高的靈敏性及特異性，已成為臨床上檢測星狀病毒最主要的手段。商曉桂應(yīng)用PK15細(xì)胞從上海某疑似PAstV感染豬場分離到的PAstV，經(jīng)RT-PCR檢測到PAstV目的條帶，表明該豬場患病豬為星狀病毒感染。蘭家暖等采用套式RT-PCR技術(shù)，對2008—2010年從廣西7個(gè)市縣29個(gè)不同規(guī)模化豬場采集的315份不同階段豬腹瀉糞樣進(jìn)行PAstV分子流行病學(xué)調(diào)查及基因型分析，表明PAstV在廣西地區(qū)豬群中已普遍存在。商曉桂等[11]建立了檢測PAstV的SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，其方法靈敏度可達(dá)10個(gè)拷貝，是普通RT-PCR的100倍，特異性和重復(fù)性較好，可用于PAstV的檢測，這為PAstV感染的調(diào)查及診斷提供了重要的技術(shù)支持。

7??小結(jié)

PAstV在豬群中普遍存在，而且常與其他腸道病毒混合感染導(dǎo)致仔豬腹瀉，每年都會給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對PAstV研究的逐步深入，人們逐步認(rèn)識到PAstV的感染率和發(fā)病率均高出預(yù)期[12]。雖然PAstV致病機(jī)制還有待于進(jìn)一步的體內(nèi)和體外研究，但星狀病毒的多宿主性、基因差異性及其重組現(xiàn)象和跨種間傳播及適應(yīng)新宿主的能力，使得星狀病毒成為潛在的新興人畜共患病原并具有重要的公共衛(wèi)生意義。

[1] 廖勤豐.新發(fā)現(xiàn)的水禽星狀病毒、微RNA病毒和嵌杯病毒的分子檢測與鑒定[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[2] Appleton H，Higgins PG. Viruses and gastroenteritis in infants[J].The Lancet，1975，305（7919）：1297.

[3] 朱愛玲.犬星狀病毒（Canineastrovirus，CaAstv）半巢式RT-PCR檢測方法的建立及基因序列分析[D].上海：上海交通大學(xué)， 2012：1-10.

[4] 郭翠平.鴨星狀病毒1型WF1202株全基因組序列的測定與單因子血清的制備[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014：1-5.

[5] 艾佛德.廣西牛星狀病毒分子流行病學(xué)調(diào)查與全基因克隆及序列分析[D].南寧：廣西大學(xué)，2014：1-3.

[6] 蘭家暖.豬星狀病毒分離鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查及生物學(xué)特性研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2011：1-10.

[7] 蘭家暖，劉磊，郭旋，等.豬星狀病毒ORF2基因的克隆及序列分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48（12）：27-31.

[8] 劉歡.豬星狀病毒分離鑒定及其全基因組序列分析和衣殼蛋白原核表達(dá)[D].南寧 廣西大學(xué)，2014：79.

[9] 商曉桂. 豬星狀病毒的分離鑒定和熒光定量PCR檢測方法的建立[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：30-40.

[10] 蘭家暖，郭旋，劉磊，等. 豬星狀病毒的分離鑒定及其致病性研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（7）：199-203.

[11] 商曉桂，郭偉，楊蓮茹，等. 豬星狀病毒SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（8）：1049-1053.

[12] 楊文宇，周遠(yuǎn)成，韓燕，等. 豬A群輪狀病毒和C群輪狀病毒以及豬星狀病毒多重RT-PCR同時(shí)檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2014，44（4）：394-400.

2015-05-15）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-06-022-15）

莊金秋（1978-），女，獸醫(yī)碩士，副研究員，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動物用病毒疫苗研制。