徐建青 (復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508)

人類發(fā)展的歷史是與各種疾病，特別是與由病原微生物引起的傳染病進(jìn)行斗爭(zhēng)的歷史。從中世紀(jì)肆虐于歐洲的黑死病到上世紀(jì)初奪走5000 多萬(wàn)生命的歐洲西班牙大流感，及至八十年代開始的艾滋病的蔓延均注釋著人類繁衍生息所面臨的巨大挑戰(zhàn)。2003 年發(fā)生的席卷全世界的“非典”與2004 年后發(fā)生的禽流感，以及2009 年在美洲爆發(fā)并流行于全球的甲型H1N1 流感病毒與近期個(gè)案報(bào)道的MERS 更為人類敲響了警鐘。

自2013 年3 月以來(lái)，我國(guó)又面臨著一種新型H7N9 流感的嚴(yán)重威脅。該新型流感有如下特點(diǎn):(1)感染后存在4～18 d 潛伏期(上呼吸道)，其后引起嚴(yán)重下呼吸道感染，約83%(76%～90%)的病人病情嚴(yán)重，其中老年人比例偏高，需要進(jìn)ICU 和使用呼吸機(jī)［1，2］;(2)重癥病例抗病毒治療(達(dá)菲)療效差，達(dá)菲治療2 d 即可發(fā)生耐藥逃逸［3］;帕拉米韋的治療效果也有限。(3)有家庭聚簇感染發(fā)生，提示存在有限的人傳人的可能［4］;(4)H7N9 在禽類中致病性低，感染H7N9 的禽類很難被發(fā)現(xiàn)和清除;同時(shí)流感病毒片段基因具有易重組的特性，使H7N9有可能正跟當(dāng)?shù)卦谇蓊愔袕V泛存在的流感病毒進(jìn)一步重組［5，6］。

這些特性表明:H7N9 感染人的風(fēng)險(xiǎn)將持續(xù)存在，且目前治療手段的有效性依然有限，其致病機(jī)制依然不清。研究表明:引起呼吸道臨床重癥的病毒感染均出現(xiàn)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”現(xiàn)象，比如SARS、H5N1、MERS、H7N9 以及重癥的2009 H1N1 等。推測(cè):這些病原體存在共性的致病機(jī)制，能夠誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生而同時(shí)逃逸宿主固有免疫應(yīng)答的攻擊。以H7N9 為模型，解析其逃逸宿主固有免疫應(yīng)答清除作用的機(jī)制，將為了解其他高致病性呼吸道病毒的致病機(jī)制提供可能。

高致病性呼吸道病毒感染誘導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答:SARS 冠狀病毒感染呼吸道纖毛上皮與II 型肺泡上皮細(xì)胞［7，8］，重癥的ARDS 患者肺中常高表達(dá)IL-1、IL-6、IL-8、CXCL-10 及TNF-α［9］，但I(xiàn) 類干擾素與干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)并未同水平上調(diào)［10］，因而，SARS 也被認(rèn)為是固有免疫調(diào)控失衡性疾病。在靈長(zhǎng)類動(dòng)物攻毒前給予IFN-α，可以保護(hù)動(dòng)物免于SARS 的致死性攻擊［11］。目前研究顯示，在SARS 冠狀病毒感染階段，模式識(shí)別受體通過(guò)MyD-88 通路活化的固有免疫應(yīng)答具有保護(hù)作用［12］，下游干擾素受體通路JAK-STAT 通路也同樣不可或缺［13，14］;目前已經(jīng)鑒定出10 種病毒編碼蛋白具有拮抗干擾素通路的功能［15］。

2012 年新發(fā)的MERS 病毒具有極強(qiáng)致病性，死亡率在50%以上［16］;進(jìn)一步研究顯示，MERS 膜蛋白能夠有效感染人不同組織的細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞)，但感染受體與已知的冠狀病毒所使用的受體無(wú)關(guān)［17］，病毒攜帶蛋白具有拮抗IRF3 介導(dǎo)的干擾素抗病毒作用［18］，表明MERS 具備人間傳播能力，且能夠調(diào)控人固有免疫應(yīng)答。

對(duì)于流感的研究結(jié)果與SARS 冠狀病毒具有相似性。高致病性H5N1 或1918 大流感H1N1 的致病性與高炎性因子、低IFN 應(yīng)答有關(guān)，其中NF-κB是高致病性病毒活化的核心信號(hào)通路［19］;小鼠模型中敲除IFN 通路的IFN-γ、MxA 基因均致流感病毒的致病性升高［20，21］。有意思的是，敲除TLR4-TRIF通路能夠保護(hù)小鼠免于H5N1 感染造成的肺損傷感染［22］、而在H5N1 攻擊小鼠前使用LPS 預(yù)先刺激小鼠，可激活TLR4-TRIF 通路，進(jìn)而在H5N1 感染時(shí)上調(diào)TLR3 的表達(dá)，并起到保護(hù)作用［23］;數(shù)據(jù)表明，同樣是TLR4-TRIF 通路，感染前LPS 激活具有保護(hù)作用，而感染中病毒產(chǎn)物激活卻有損傷作用，提示通過(guò)預(yù)先調(diào)控固有免疫應(yīng)答可以有效干預(yù)H5N1 的感染結(jié)局，病毒產(chǎn)物可異常調(diào)控固有免疫應(yīng)答。靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型研究顯示:流感病毒感染可以造成感染早期持續(xù)性的Ⅰ類干擾素、炎性因子與其他固有免疫應(yīng)答基因的上調(diào)，其致病力與對(duì)這些因子上調(diào)的水平成正相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)H5N1 可感染Ⅱ型肺泡上皮，而致病力弱的病毒以感染Ⅰ型上皮為主［24］。由于靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型尚缺少動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，目前我們尚難以了解感染極早期的固有免疫應(yīng)答情況。小鼠模型研究證明:IL7RA 敲除鼠在流感感染中存活率更好、炎性/趨化因子應(yīng)答減弱，但對(duì)病毒載量影響不明顯［25］。

上述研究表明，這些病原的感染可誘發(fā)固有免疫應(yīng)答，呼吸道內(nèi)的失衡型固有免疫應(yīng)答(高炎癥因子、低干擾素)與致病性有關(guān)，免疫干預(yù)調(diào)控固有免疫應(yīng)答能夠改變病程。

H7N9 感染誘導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答:研究也證明H7N9 病人發(fā)生了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”［26-29］，H7N9 所引起的細(xì)胞因子水平總體上跟H5N1 相當(dāng)或者稍弱，但H7N9 可以誘導(dǎo)比H5N1 更多的MCP-1、MIP-1β、IL-6 和IL-8［27］。我們課題組比較了死亡組和幸存組病人入院早期的細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-8、MIP-1β 的水平與病人的預(yù)后相關(guān)，細(xì)胞因子水平越高，預(yù)后越差;同時(shí)感染者血及肺盥洗液中IFN 水平極低［29］。同時(shí)，我們對(duì)病人干擾素誘導(dǎo)穿膜蛋白3 (Interferon induced transmembrane protein 3，IFITM3)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs12252 的分析表明，相對(duì)于rs12252 T/T 病人組，rs12252-C/C病人病毒復(fù)制水平較高，細(xì)胞因子水平較高而且預(yù)后很差，2/3 的rs12252-C/C 病人使用了呼吸機(jī)或者ECMO［29］。上述數(shù)據(jù)表明:H7N9 的致病性可能與高水平炎癥因子、干擾素通路抑制病毒作用低下有關(guān)。

高致病性流感逃逸宿主固有免疫應(yīng)答的機(jī)制:上述研究表明，重癥流感發(fā)生的機(jī)制是由于病毒上調(diào)炎癥因子分泌而抑制干擾素通路，從而突破宿主固有免疫系統(tǒng)的防御機(jī)制，導(dǎo)致肺內(nèi)炎癥應(yīng)答不斷加劇而致肺實(shí)變，出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征。目前已有的研究表明，重癥流感可能在以下幾個(gè)環(huán)節(jié)中均可逃逸固有免疫系統(tǒng)的抑制作用:

(1)重癥流感病毒分路調(diào)控炎癥因子與干擾素:流感病毒可以通過(guò)NF-kB 通路激活炎癥因子的應(yīng)答，但并不同時(shí)上調(diào)IFN 通路，尚不清楚流感病毒如何實(shí)現(xiàn)這種分別調(diào)控的。但這一調(diào)控模式可能是重癥流感逃逸宿主固有免疫應(yīng)答的最重要機(jī)制。

(2)突破IFITM3 的限制作用:流感病毒通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入內(nèi)體，內(nèi)體進(jìn)入胞漿之后病毒包膜與細(xì)胞膜融合釋放出包含的病毒RNA(vRNA)進(jìn)入胞漿，這一過(guò)程可以被IFITM3(IFN-inducible trans-membrane protein 3)分子介導(dǎo)的作用滯留而阻斷釋放［30］。但是，流感病毒均有能力突破這一限制而進(jìn)入胞漿，其機(jī)制尚未闡明。

(3)抑制RIG 通路:進(jìn)入胞漿的vRNA 可以被RIG-I 受體識(shí)別，從而激活RIG-I，導(dǎo)致RIG-I 被TRIM25 泛素化修飾，這一修飾是RIG-I 與下游的MAVS 結(jié)合所必需的過(guò)程［31］。流感病毒可以通過(guò)NS1(非結(jié)構(gòu)蛋白1)抑制TRIM25，從而阻斷RIG-I通路的活化。

(4)上調(diào)SOCS3 抑制干擾素通路:通過(guò)上調(diào)SOCS3 分子以抑制干擾素通路是流感逃逸宿主固有免疫應(yīng)答作用的重要機(jī)制［32］。SOCS(Suppressors of cytokine signaling)家族有8 個(gè)成員，通過(guò)分子SH2結(jié)構(gòu)域與靶分子結(jié)合，將靶分子導(dǎo)向泛素化并降解，不同的病毒上調(diào)的SOCS 成員并不相同，其中流感病毒主要上調(diào)SOCS3，我們的研究表明:SOCS 家族的其他成員也參與到流感逃逸的機(jī)制中。

(5)逃逸MxA 等ISG 基因的抑制作用:干擾素通路激活后，宿主眾多的ISG 分子對(duì)病毒均有抑制作用。MxA 基因可通過(guò)使病毒RNP 多聚化成環(huán)，從而阻斷病毒RNP 入核復(fù)制［33］。流感病毒可以通過(guò)突變自身NP 而逃逸MxA 的限制作用［34］。

尚未闡明的問(wèn)題:回答以下四個(gè)問(wèn)題將有助于進(jìn)一步闡明重癥流感病毒逃逸宿主固有免疫應(yīng)答的機(jī)制:①重癥流感病毒分路調(diào)控炎癥因子與干擾素是如何實(shí)現(xiàn)的?②病毒是如何逃逸IFITM3 限制的?③病毒逃逸干擾素通路抑制作用是通過(guò)哪些SOCS家族成員實(shí)現(xiàn)的?是如何實(shí)現(xiàn)的?④應(yīng)急應(yīng)答與表觀調(diào)控在流感病毒逃逸宿主固有免疫應(yīng)答中的作用?

上述問(wèn)題的闡明將對(duì)新藥研發(fā)以及臨床的免疫干預(yù)奠定理論基礎(chǔ)。

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