魯明騫 孔慶志 許新華 盧宏達(dá) 盧忠心 譚 超 徐冰清 郭 蓉

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所＆湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，宜昌 443003)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于我國(guó)南方各省，素有“廣東瘤”(Canton tumor)之稱，世界上80%的鼻咽癌發(fā)生在我國(guó)，占頭頸部惡性腫瘤的首位。各個(gè)年齡組均可發(fā)病，以30～60 歲多見，占75%～90%，男性發(fā)病為女性的(2～3.8)∶1。目前鼻咽癌的治療主要以放射治療為主，化療雖有較高的緩解率，但完全緩解率低，而且有較重的不良反應(yīng)，新輔助化療及輔助化療對(duì)鼻咽癌患者生存率的影響尚無定論。分子靶向治療主要針對(duì)導(dǎo)致細(xì)胞癌變的環(huán)節(jié)，開創(chuàng)了腫瘤內(nèi)科診斷和治療相結(jié)合的新時(shí)代，同時(shí)提高了患者的有效率及生存率。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其信號(hào)傳導(dǎo)存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在其受到刺激后可將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，對(duì)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡、血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移等有一定調(diào)控效應(yīng)［1］。MKK4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4)是MAPK 的激酶，作為MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)通路的構(gòu)成部分，是Ras 癌基因信號(hào)傳導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié)，通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)、外信號(hào)刺激的調(diào)節(jié)作用，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等有一定的調(diào)節(jié)作用［2］。本研究以鼻咽癌患者為研究對(duì)象，測(cè)定MKK4 蛋白的表達(dá)，研究其蛋白表達(dá)水平與鼻咽癌的相關(guān)性，初步探討鼻咽癌MKK 蛋白表達(dá)與生物學(xué)行為、侵襲轉(zhuǎn)移、治療、預(yù)后等的關(guān)系，希望通過本研究有助于對(duì)惡性腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的進(jìn)一步了解，為鼻咽癌的預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2002 年1 月至2009 年12 月鼻咽癌患者的石蠟組織標(biāo)本90 例，其中男性62 例、女性28 例，年齡22～73 歲，平均(45.3±5.2)歲。鼻咽癌分期采用福州92 分期標(biāo)準(zhǔn)，其中低分化鱗癌85 例，未分化癌5 例，全部病人均為初診，行常規(guī)放射治療，中晚期病人輔以DDP+5-FU 誘導(dǎo)方案化療。收集同期病理結(jié)果為鼻咽慢性炎癥組織石蠟標(biāo)本20 例作為對(duì)照組。所收集資料的內(nèi)容主要為年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度等。

1.2 試劑與方法 將石蠟包埋的組織標(biāo)本制備成4 μm 厚的連續(xù)切片，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片，50℃恒溫箱烤片過夜，經(jīng)組織切片脫蠟、水化，滴加適量新鮮配制的3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min 以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水洗3 min×3 次，PBS 緩沖液浸泡5 min。高溫高壓抗原修復(fù):將切片置入0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液(PH6.0)中，高壓鍋加熱至噴汽1 min，自然冷卻后取出切片，蒸餾水洗3 min ×2 次，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，滴加MKK4單克隆抗體(1∶80)，4℃過夜后在37℃復(fù)溫45 min，PBS 洗滌2 min ×3 次，滴加生物素化二抗，37℃20 min，PBS 洗滌2 min×3 次，滴加試劑SABC，37℃20 min，PBS 洗滌5 min×4 次，加DAB 顯色劑，顯色10 min，蘇木素輕度復(fù)染，0.5%鹽酸酒精分色、脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.3 結(jié)果判斷 MKK4 蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于細(xì)胞核，呈棕黃色。在400 倍光鏡下觀察每張切片，選取具有5 個(gè)代表性的不同視野進(jìn)行觀察，根據(jù)MKK4 陽(yáng)性細(xì)胞漿或細(xì)胞核的染色細(xì)胞陽(yáng)性染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合分析評(píng)分:根據(jù)陽(yáng)性染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量積分法判斷，將結(jié)果分為四個(gè)級(jí)別:0(Negative，無染色);1(Weak staining，弱陽(yáng)性);2(Moderately increased staining，黃色);3(Intense staining，棕黃色者)。0 為光鏡下看不到明顯的染色結(jié)果;1 為染色散在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)或者是鱗狀上皮弱的擴(kuò)散染色，染色為淺黃色者;2 為染色呈黃色，陽(yáng)性結(jié)果主要出現(xiàn)在胞漿和/或細(xì)胞核;3 為染色呈棕黃色者，并且大面的出現(xiàn)在病灶部位。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):無陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，計(jì)0 分;陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞≤25%，計(jì)1 分;25%≤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤50%，計(jì)2分;陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＞50%，計(jì)3 分。上述兩種判斷標(biāo)準(zhǔn)得分乘積為最終計(jì)分結(jié)果:0 分為陰性;1、2、3、4、6、9 為陽(yáng)性。最終結(jié)果由染色的總數(shù)和染色強(qiáng)度共同決定，總值0 表示陰性，0～2 為弱陽(yáng)性，3～4 為中等陽(yáng)性，6～9 為強(qiáng)陽(yáng)性，≤2 為低表達(dá)，＞2 為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。陽(yáng)性率之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化的切片均由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師閱片，評(píng)價(jià)主要是基于蛋白質(zhì)表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)分。

2.1 MKK4 蛋白在鼻咽癌組織和鼻咽慢性炎癥組織的表達(dá) 免疫組化結(jié)果表明，MKK4 蛋白在鼻咽癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為75.6%(68/90)，鼻咽慢性炎癥組織中陽(yáng)性表達(dá)率為95.5%(19/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，且鼻咽癌組的MKK4 蛋白的陰性細(xì)胞數(shù)(-)22 人，占24.4%，(+)為14 人，占15.6%，(++)為31 人，占34.4%，(+++)為23 人，占25.6%;對(duì)照組的MKK4 的陰性細(xì)胞數(shù)(-)1 人，占5.0%，(+)為3 人，占15.0%，(++)為6 人，占30.0%，(+++)為10 人，占50.0%，見表1。

表1 MKK4 在鼻咽癌及鼻咽慢性炎癥組織中的表達(dá)Tab.1 MKK4 expression in NPC and chronic nasopharyngitis tissues

2.2 鼻咽癌組織中MKK4 蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 MKK4 蛋白在低分化癌與未分化癌中的高陽(yáng)性表達(dá)率分別為67.5%和0%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，T1-T2 鼻咽癌組織陽(yáng)性高表達(dá)為51.3%(20/39)，在T3-T4 鼻咽癌組織中的陽(yáng)性高表達(dá)為66.7%(34/51)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P ＞0.05)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中細(xì)胞陽(yáng)性高表達(dá)為76.7%(46/60)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中細(xì)胞陽(yáng)性高表達(dá)為26.7%(8/30)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，在臨床Ⅰ-Ⅱ期的陽(yáng)性高表達(dá)為73.6%(39/53)，臨床Ⅲ-Ⅳ期的陽(yáng)性高表達(dá)為40.5%(15/37)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。MKK4 蛋白在男性鼻咽癌組織中高表達(dá)為53.2%(25/47)，在女性鼻咽癌組織中的高表達(dá)為67.4%(29/43)，年齡≥50 歲陽(yáng)性高表達(dá)為64.5%(40/62)，年齡＜50歲陽(yáng)性高表達(dá)50.0%(14/28)，病灶在咽隱窩陽(yáng)性高表達(dá)為67.1%(47/70)，發(fā)生在頂后壁為35.0%(7/20)，結(jié)果顯示不同年齡、性別、原發(fā)部位、T 分期鼻咽癌組織中MKK4 高表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(見表2)。

表2 MKK4 蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationship MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma and clinicopathological features

2.3 MKK4 蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 復(fù)發(fā)時(shí)間≤5年患者共28 例，MKK4 陽(yáng)性高表達(dá)13 例(46.4%)，復(fù)發(fā)時(shí)間＞5 年共30 例，陽(yáng)性高表達(dá)22 例(73.3%)(P ＜0.05)，提示MKK4 蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)越高，TTP(5 年至疾病進(jìn)展時(shí)間)越長(zhǎng)。

3 討論

鼻咽癌是頭部最常見的惡性腫瘤，近年來鼻咽癌的發(fā)病呈逐漸上升趨勢(shì)，尤其是在我國(guó)的南方地區(qū)比較普遍，因此越來越受到人們的關(guān)注。面對(duì)常規(guī)的高強(qiáng)度治療效果不理想且副作用大的難題，針對(duì)細(xì)胞信號(hào)途徑的分子靶向藥物開創(chuàng)了腫瘤治療的新時(shí)代。

MAPK 是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中常見的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其所涉及的4 條通路對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理過程，尤其是細(xì)胞分裂和凋亡，具有重要的生物學(xué)意義［3］。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的平衡被打破時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生甚至無限制生長(zhǎng)。MKK4 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)分布于細(xì)胞核。MKK4 作為MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要組成部分，是癌基因Ras 信號(hào)傳導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用［4］，能同時(shí)磷酸化并激活2 條MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)通路，即JNK 通路和p38 通路，能將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)。本研究的結(jié)果表明，鼻咽癌患者中MKK4 蛋白的高表達(dá)率明顯低于鼻咽慢性炎癥組織中MKK4 蛋白高表達(dá)率，由此推測(cè)腫瘤細(xì)胞中可能存在MKK4 受體過度表達(dá)，通過信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使得細(xì)胞MKK4 生長(zhǎng)受到抑制，出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞失控性生長(zhǎng)，證明MKK4 蛋白的高表達(dá)在一定程度上抑制了鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展。與對(duì)照組相比，鼻咽癌組的MKK4 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率下調(diào)，隨著鼻咽癌的惡化，MKK4 蛋白的表達(dá)減少，且均與對(duì)照組有差異，但僅Ⅰ期、Ⅱ期與Ⅲ期、Ⅳ期有顯著性差異，而Ⅰ期、Ⅱ期的MKK4 蛋白表達(dá)水平最高，在鼻咽癌發(fā)展的過程中，MKK4 的表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且Ⅲ期、Ⅳ期的表達(dá)水平最低。以上結(jié)果表明MKK4 蛋白的表達(dá)水平與鼻咽癌分期呈負(fù)相關(guān)。MKK4 蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度較差的組織中的高表達(dá)率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度相對(duì)較好的組織，但不同年齡、性別、原發(fā)部位、T 分期并不影響MKK4 蛋白的陽(yáng)性高表達(dá)率，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

MKK4 基因在腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要調(diào)節(jié)作用，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中是具有正性還是負(fù)性調(diào)節(jié)作用目前還存在較大爭(zhēng)議。在本研究中，我們通過免疫組化方法測(cè)定鼻咽癌及鼻咽慢性炎癥組織中的MKK4 蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示MKK4 蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)量明顯低于鼻咽慢性炎癥組織中的表達(dá)量，其原因可能是由于細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生變化產(chǎn)生應(yīng)激而使得MKK4-JNK 或/和MKK4-P38通路被激活。MKK4 蛋白在鼻咽癌組織中的高表達(dá)率明顯降低，說明MKK4 蛋白表達(dá)率下調(diào)可能是鼻咽癌發(fā)生的早期分子事件，甚至可能是始動(dòng)因素之一，與劉斌等［5］研究結(jié)果一致。本研究顯示復(fù)發(fā)時(shí)間≤5 年患者M(jìn)KK4 蛋白陽(yáng)性高表達(dá)率明顯低于生存期＞5 年患者陽(yáng)性表達(dá)率(P ＜0.05)，提示MKK4蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)越高，5 年至疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)越長(zhǎng)，與患者的預(yù)后有一定關(guān)系。Teng等［6］研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞株、乳腺癌細(xì)胞株、結(jié)腸癌細(xì)胞株和睪丸癌細(xì)胞株的MKK4 突變率約為3%，這些發(fā)現(xiàn)表明在某些癌細(xì)胞類型中MKK4 基因可能具有抑癌作用。Cunningham 等［7］發(fā)現(xiàn)胃癌患者手術(shù)切除胃腺癌標(biāo)本中缺乏MKK4 蛋白表達(dá)的生存期較短，多變量研究分析顯示原發(fā)胃腺癌標(biāo)本中MKK4 陰性的患者死亡危險(xiǎn)性增加5 倍。Stark等［8］運(yùn)用RT-PCR、免疫組化技術(shù)檢測(cè)乳腺導(dǎo)管癌及其腦部轉(zhuǎn)移灶中MKK4 基因及其蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶相比，MKK4 的表達(dá)下降達(dá)10倍，證明了MKK4 與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的負(fù)相關(guān)性。

但也有研究相反的結(jié)果，Wang 等［9］將缺乏內(nèi)源性MKK4 的乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染使其分別表達(dá)MKK4 基因，結(jié)果顯示癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力得到提高。然而，通過RNA 干擾技術(shù)敲除MKK4 陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 的MKK4基因后，結(jié)果導(dǎo)致癌細(xì)胞非停泊性生長(zhǎng)速度下降。Wu 等［10］用免疫組化方法分析發(fā)現(xiàn)在胃腺癌組織中表達(dá)MKK4 蛋白的患者和胃腺癌組織中不表達(dá)MKK4 蛋白的患者相比，前者有較差的無復(fù)發(fā)生存率和總的生存期。此外，最近還有學(xué)者報(bào)道MKK4能通過激活核因子κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)而抑制細(xì)胞凋亡，但具體MKK4 是如何激活NF-κB 來抑制細(xì)胞凋亡的，其機(jī)制尚不清楚［11，12］。

為什么會(huì)存在這些自相矛盾的結(jié)果呢?主要原因可能為實(shí)驗(yàn)時(shí)所采用的不同組織、細(xì)胞類型以及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶禺愋运隆２煌哪[瘤組織、相同腫瘤組織不同的發(fā)展階段，MKK4 的表達(dá)水平及其所誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)可能都具有組織特異性，從而導(dǎo)致了矛盾結(jié)果的出現(xiàn)。而且，在實(shí)驗(yàn)時(shí)敲除細(xì)胞的MKK4 基因和細(xì)胞自然發(fā)生MKK4 基因丟失是不同的，實(shí)驗(yàn)時(shí)MKK4 基因的丟失是實(shí)驗(yàn)者強(qiáng)加于細(xì)胞的，而細(xì)胞自然發(fā)生的MKK4 基因丟失是基于細(xì)胞周圍自然環(huán)境選擇的結(jié)果。還有可能在不同的環(huán)境中檢測(cè)MKK4 的腫瘤抑制能力時(shí)，由于存在一些與轉(zhuǎn)移能力無關(guān)的影響因素，這些都可導(dǎo)致不同的結(jié)果［13］。

綜上所述，MKK4 蛋白的異常表達(dá)可能在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用?？捎肕KK4 蛋白的表達(dá)水平來預(yù)測(cè)患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此，MKK4 可以作為一個(gè)潛在的判斷鼻咽癌發(fā)病與轉(zhuǎn)移的觀測(cè)指標(biāo)，并可能為鼻咽癌的臨床治療提供新靶點(diǎn)。

［1］Lin A，Minden A，Martinetto H，et al.Identification of a dual specificity kinase that activates the Jun kinases and p38-Mpk2［J］.Science，1995，268(5208):286-290.

［2］魯明騫，孔慶志.絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路在惡性腫瘤中的研究現(xiàn)狀［J］.實(shí)用癌癥雜志，2013，28(3):320-321.

［3］Hickson JA，Huo D，Vander Griend DJ，et al.The p38 kinases MKK4 and MKK6 suppress metastatic colonization in human ovarian carcinoma［J］.Cancer Res，2006，66(4):2264-2270.

［4］Whitmarsh AJ，Davis RJ.Role of mitogen-activated protein kinase kinase 4 in cancer［J］.Oncogene，2007，26(22):3172-3184.

［5］劉 斌，黃斌芳，楊 磊，等.EB 病毒-MKK4 基因遺傳變異的交互作用與鼻咽癌危險(xiǎn)性研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28(2):175-177.

［6］Teng DH，Perry lii WL，Hogan JK，et al.Human mitogen-activated protein kinase kinase 4 as a candidate tumor suppressor［J］.Cancer Res，1997，57(19):4177-4182.

［7］Cunningham SC，Kamangar F，Kim MP，et al.MKK4 status predicts survival after resection of gastric adenocarcinoma［J］.Arch Surg，2006，141(11):1095-1099.

［8］Stark AM，Tongers K，Maass N，et al.Reduced metastasis-suppressor gene mRNA-expression in breast cancer brain metastases［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2005，131(3):191-198.

［9］Wang L，Pan Y，Dai JL.Evidence of MKK4 pro-oncogenic activity in breast and pancreatic tumors［J］.Oncogene，2004，23(35):5978-5985.

［10］Wu CW，Li AF，Chi CW，et al.Human gastric cancer kinase profile and prognostic significance ofMKK4 kinase［J］.Am J Pathol，2000，56(6):2007-2015.

［11］Sethi G，Ahn Ks，Xia D，et al.Targeted deletion of MKK4 gene potentiates TNF-induced apoptosis through the down-regulation of NF-kappa B activation and NF-kappa B-regulated antiapoptotic gene products［J］.J Immunol，2007，179(3):1926-1933

［12］Xia D，Srinivas H，Ahn Yh，et al.Mitogen-activated protein kinase kinase-4 promotes cell survival by decreasing PTEN expression through an NF kappa B-dependent pathway［J］.J Biol Chem，2007，282(6):3507-3519.

［13］Cunningham SC，Gallmeier E，Hucl T，et al.Targeted deletion of MKK4 in cancer cells:a detrimental phenotype manifests as decreased experimental metastasis and suggests a counterweight to the evolution of tumor-suppressor loss［J］.Cancer Res，2006，66(11):5560-5564.