姚茹冰 王圓圓 蔡 輝 (南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科/風(fēng)濕免疫?？?，南京 210002)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性、全身性、自身免疫性疾病。近年的研究提示，Toll 樣受體(Toll like receptor，TLR)不僅在固有免疫中具有重要作用，也是聯(lián)系固有免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁，而且從多方面影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在RA 發(fā)病機制中可能有重要的作用。本文就Toll 樣受體與RA 相關(guān)性的研究進展，進行綜述。

1 TLR 信號通路

TLR 蛋白家族最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，是免疫系統(tǒng)中最原始的組成要素之一。TLR 是進化高度保守的跨膜蛋白，目前在人類已鑒定出13 種TLR(TLR1～TLR13)，分布在相關(guān)的免疫細胞及免疫效應(yīng)細胞表面［1］。

TLR 是Ⅰ型膜受體，胞內(nèi)區(qū)(羧基端)約含200個氨基酸殘基，結(jié)構(gòu)保守，胞外區(qū)(氨基端)含18～31 個富含亮氨酸的重復(fù)序列。不同TLR 的胞外區(qū)氨基酸組成的差異較大，決定了它們各自有其特異性的配體。TLR 是一類重要的模式識別受體，每種受體通過特定識別來源于病毒、細菌和真菌等“病原體相關(guān)模式分子”(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，察覺微生物感染的存在，激發(fā)機體免疫反應(yīng)。同時，TLR 識別一些宿主衍生分子降解產(chǎn)物，即“損傷相關(guān)模式分子”(Danger associated molecular patterns，DAMPs)，主要包括細胞壞死后釋放的細胞內(nèi)分子如熱休克蛋白、核高遷移率族1，細胞外基質(zhì)分子如多功能蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、纖維蛋白原和腱糖蛋白-C 等，以及細胞外基質(zhì)的低分子量片段如透明質(zhì)酸、肝素等。不同的TLR 可特異性識別不同的PAMPs 和DAMPs。如TLR4 識別細菌脂多糖(LPS)，TLR5 識別鞭毛，TLR9 識別非甲基化細菌DNA，TLR3、7、8 可分別與病毒核酸結(jié)合。其亞型的定位也與其病原配體相對應(yīng)，TLR1、2、4、5、6 在細胞表面表達，TLR3、7、8、9 主要在細胞內(nèi)涵體內(nèi)。細胞表面TLR 識別蛋白多糖、脂肪酸，內(nèi)涵體TLR 識別內(nèi)源性核酸，在非感染性組織損傷時，DAMPs 可激活TLR，導(dǎo)致下游信號傳導(dǎo)興奮，轉(zhuǎn)錄因子移位至細胞核，促炎介質(zhì)上調(diào)，引起了持續(xù)性炎癥反應(yīng)，形成惡性炎癥循環(huán)。

TLR 的生物學(xué)效應(yīng)主要由髓樣分化反應(yīng)蛋白88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴型和非MyD88 依賴型傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)［2］。MyD88 是一種接頭分子，除了TLR3，MyD88 與其他所有TLR相關(guān)。TLR1、2、4、6 需要額外蛋白(TRIF)來與MyD88 相結(jié)合，而TLR5、7、9 可與MyD88 直接結(jié)合。一般來說，激活MyD88 依賴途徑可引起白介素1 受體相關(guān)激酶(IRAK)、泛素連接酶6(TRAF-6)、TANK 結(jié)合激酶1(TBK1)蛋白、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 等信號介質(zhì)的激活，激活NF-κB 可引起各種促炎癥因子如TNF-α、IL-6、趨化因子等表達增加。刺激MyD88 非依賴TRIF 途徑可引起轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)蛋白和干擾素的活化，募集IRF-3 到各自的DNA 結(jié)合位點啟動轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生干擾素及其協(xié)同刺激分子。

2 TLR 生物學(xué)功能

TLR 在固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均發(fā)揮重要作用。固有免疫中，TLR 在識別病原微生物的基礎(chǔ)上直接觸發(fā)胞內(nèi)殺菌機制或者誘導(dǎo)免疫炎性因子產(chǎn)生以擴大非特異性防御。適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，TLR 能誘導(dǎo)樹突狀細胞成熟，激活其分泌細胞因子及趨化因子，并誘導(dǎo)其表達共刺激分子;TLR 對Th1和Th2 細胞的分化和功能平衡有顯著的影響;TLR可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細胞的活化。此外，TLR 還參與幼稚B 細胞的激活，影響記憶T 細胞反應(yīng)的強度和質(zhì)量，啟動CD8+T 細胞對抗可溶性蛋白抗原的反應(yīng)等等，TLR 廣泛參與特異性免疫反應(yīng)的各種途徑，參與慢性免疫性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展。

3 TLR 在RA 的表達及作用

研究提示，RA 患者外周血單個核細胞、滑膜組織、滑液、滑膜巨噬細胞及滑膜成纖維細胞均存在TLRs 表達增加，且TLR2、3、4、5、7、8 及9 等可能不同程度參與了RA 發(fā)病。

李通等［3］研究顯示活動期RA 患者外周血單核細胞TLR2 表達增高，且TLR2 的表達與疾病活動指標(biāo)如DAS、血清C 反應(yīng)蛋白及血沉密切相關(guān)?；顒悠赗A 患者存在著固有免疫系統(tǒng)的活化，TLR2 的高表達可能促進了外周血單核細胞的活化。RA 患者血單核細胞TLR2 的表達與胰島素抵抗有密切的關(guān)系［4］。阻斷TLR2 可阻止RA 體外滑膜移植培養(yǎng)物自發(fā)的細胞因子釋放，提示靶向TLR2 在治療RA 中可能有重要作用［5］。TLR3 通過上調(diào)RA 患者滑膜成纖維細胞核因子κB 受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表達促進破骨細胞形成［6］。激活TLR3 誘導(dǎo)RA 滑膜成纖維細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子和IL-8，這個過程被NF-κB 信號途徑中介，靶向TLR3 路徑可能是一個有前景的預(yù)防RA 病理性血管生成的方法［7］。錢雷等［8］的研究提示RA 患者外周血單核細胞的TLR4 表達及對脂多糖刺激的反應(yīng)性增加，且該細胞具有較強的誘導(dǎo)Th17 細胞分化能力。Th17 細胞及其分泌的IL-17 等細胞因子在RA 的滑膜炎、軟骨破壞及骨侵蝕骨破壞中有重要的作用。郭慧芳等［9］研究顯示，RA 患者外周血單核細胞具有合成和分泌高遷移率族蛋白(HMGB)1 蛋白的功能，并部分通過與TLR4 結(jié)合激活炎癥反應(yīng)，加重骨質(zhì)破壞。任敏等［10］研究顯示，TLR4 在RA 患者外周血CD14+單核細胞表面表達上調(diào)且與血清IL-18 的水平呈正相關(guān)，而與DAS28 呈負相關(guān)，提示TLR4 可能間接參與RA 的發(fā)病過程。RA 的滑膜巨噬細胞和外周血單核細胞TLR5 表達增加，RA 單核細胞中的TLR5 對RA 滑液中的TNF-α 有重要的調(diào)節(jié)作用，且其表達與RA 疾病的活動性及TNF-α 水平高度相關(guān)［11］。TLR5 可能通過直接吸引內(nèi)皮細胞或間接促進Th17 細胞生長調(diào)節(jié)RA 的血管增生，在血管發(fā)生中有新奇的作用，可能是RA 一個有希望的新靶標(biāo)［12］。RA 滑膜組織有TLR7 及TLR8 表達，且TLR7 在RA 單核細胞表達與DAS28 評分和TNF-α水平密切相關(guān)，RA 滑液中的ssRNA 可以作為TLR7的內(nèi)源性配體介導(dǎo)TNF-α 轉(zhuǎn)錄［13］。有研究提示TLR9 可能參與了骨髓B 細胞的直接激活和增殖，在RA 的發(fā)病中發(fā)揮作用［14］。

4 RA 的TLRs 配體

4.1 微生物配體 早期的研究顯示，在RA 患者關(guān)節(jié)中發(fā)現(xiàn)細菌及病毒DNA，推測PAMPs 激活TLRs可能引起疾病的發(fā)生。TLR2 配體細菌肽多糖，誘導(dǎo)RA 滑液成纖維細胞表達IL-6 及CXCL8。TLR3 配體polyI:C 誘導(dǎo)滑液成纖維細胞表達IL-1βmRNA。RA 外周血單核細胞對TLR4 配體LPS 反應(yīng)增強。從RA 患者滑液分離的巨噬細胞，對肽聚糖和LPS反應(yīng)增強，TLR2 及TLR4 表達增加。

4.2 內(nèi)源性配體 內(nèi)源性配體的存在表明即使沒有感染存在，受損處及處于應(yīng)激狀態(tài)的細胞發(fā)出的信號也可以引發(fā)免疫應(yīng)答，參與免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。許多研究顯示，RA 關(guān)節(jié)組織中存在內(nèi)源性TLRs 配體，主要是TLR4 和TLR2 激動因子，這些因子包括熱休克蛋白、纖維蛋白原、纖維連接蛋白EDA 等，提示TLR 通過識別某些PAMPs 參與了慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。有研究提示，壞死的滑液細胞依賴TLR3 途徑增加了CXCL10、CCL5和IL-6 的表達，壞死的滑液細胞釋放的RNA 可能作為TLR3 的內(nèi)源性配體刺激滑膜成纖維細胞促炎癥反應(yīng)基因的表達。TLR4 拮抗劑可抑制體內(nèi)滑膜組織培養(yǎng)物自發(fā)分泌TNF-α 和IL-1β;當(dāng)抑制MyD88 和Mal/TIRAP 時，可抑制RA 滑膜組織自發(fā)分泌炎性細胞因子，均提示RA 滑膜組織有內(nèi)源性TLR 配體。研究顯示，壓力反應(yīng)蛋白gp96 主要通過TLR2 激活正常巨噬細胞，而且，gp96 激活RA 滑膜巨噬細胞明顯高于對照的巨噬細胞。gp96 誘導(dǎo)巨噬細胞TLR2 表達，支持gp96 作為一個內(nèi)源性TLR配體在RA 發(fā)病機制中發(fā)揮作用［15］。HMGB1 通過上調(diào)RA 患者CD14+單核細胞TLR2 和IL-23 表達，促進Th17 細胞分化［16］。Snapin 作為RA 中TLR2一個新的內(nèi)源性配體，在RA 滑膜高表達［17］。

5 干預(yù)TLRs 靶向治療RA

TLRs 在RA 發(fā)病機制中起重要作用，為RA 的治療提供了新的靶點。如可溶性假性受體和中和抗體可阻斷受體/配體結(jié)合，從而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生;抑制內(nèi)源性因子釋放和阻斷TLRs 表達也均是RA 的治療手段;受體二聚化是TLRs 激活的前提條件，因此阻斷其二聚化也是一種治療策略;TLRs 信號下游的信號介導(dǎo)蛋白質(zhì)分子也可是治療靶點。

Opsona 公司開發(fā)了抗TLR2 抗體，一種是OPN-305，阻止細胞因子的釋放，另一種是OPN-301，它可有效地抑制人RA 體外培養(yǎng)物自發(fā)性分泌細胞因子，并可作為TNF-α 抗體［18］。NovImmune 公司開發(fā)的單克隆抗體NI0101/α 能夠抑制TLR4 的激活。小分子如米安色林和咪喹莫特可抑制人類RA 滑膜組織分泌TNF-α，前者抑制TLR3、7、8、9，后者抑制TLR8［19］。蘿卜硫素、OSL07 及烷酮衍生物可防止TLR4 二聚化并抑制TLR4 下游信號的激活［20］。

6 展望

綜上所述，TLR 在RA 的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用，但是對于其具體的作用機制仍有待進一步研究。如同一種TLR 活化后對不同效應(yīng)細胞的作用，多種TLR 共同激活的效應(yīng)及TLR 多態(tài)性對疾病的影響等還不十分清楚，明確這些內(nèi)容，不僅可從新的角度認(rèn)識RA 等自身免疫性疾病，更重要的是為尋找新的預(yù)防和治療RA 的方法提供理論基礎(chǔ)。

［1］Akira S，Uematsu S，Takeuchi O.Pathogen recognition and innate immunity［J］.Cell，2006，124(4):783-801.

［2］Kawai T，Akira S.Toll-like receptor downstream signaling［J］.Arthritis Res Ther，2005，7(1):12-19.

［3］李 通，左曉霞，肖獻忠，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細胞Toll 樣受體2 的表達及意義［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006，10(7):398-401.

［4］Wang SW，Lin TM，Wang CH，et al.Increased toll-like receptor 2 expression in peptidoglycan-treated blood monocytes is associated with insulin resistance in patients with nondiabetic rheumatoid arthritis［J］.Mediators Inflamm，2012，2012:690525.

［5］Ultaigh SN，Saber TP，McCormick J，et al.Blockade of Toll-like receptor 2 prevents spontaneous cytokine release from rheumatoid arthritis ex vivo synovial explant cultures［J］.Arthritis Res Ther，2011，13(1):R33.

［6］Kim KW，Cho ML，Oh HJ，et al.TLR-3 enhances osteoclastogenesis through upregulation of RANKL expression from fibroblast-like synoviocytes in patients with rheumatoid arthritis［J］.Immunol Lett，2009，124(1):9-17.

［7］Moon SJ，Park MK，Oh HJ，et al.Engagement of toll-like receptor 3 induces vascular endothelial growth factor and interleukin-8 in human rheumatoid synovial fibroblasts［J］.Korean J Intern Med，2010，25(4):429-435.

［8］錢 雷，呂麗君，徐 敏，等.活化的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞Toll 樣受體4 誘導(dǎo)Th17 細胞分化［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2011，15(12):816-820.

［9］郭惠芳，劉淑霞，劉曉雷，等.高遷移率族蛋白1 及Toll 樣受體4 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清和外周血單個核細胞中的表達及意義［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2009，13(5):333-336.

［10］任 敏，武加標(biāo)，湯 麗，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細胞Toll 樣受體4 的表達及其與血清白介素-18 水平變化的相關(guān)性［J］.中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2013，7(1):22-26，后插2.

［11］Chamberlain ND，Vila OM，Volin MV，et al.TLR5，a novel and unidentified inflammatory mediator in rheumatoid arthritis that correlates with disease activity score and joint TNF-alpha levels［J］.J Immunol，2012，189(1):475-483.

［12］Kim SJ，Chen Z，Chamberlain ND，et al.Angiogenesis in rheumatoid arthritis is fostered directly by toll-like receptor 5 ligation and indirectly through interleukin-17 induction［J］.Arthritis Rheum，2013，65(8):2024-2036.

［13］Chamberlain ND，Kim SJ，Vila OM，et al.Ligation of TLR7 by rheumatoid arthritis synovial fluid single strand RNA induces transcription of TNFalpha in monocytes［J］.Ann Rheum Dis，2013，72(3):418-426.

［14］Rudnicka W，Burakowski T，Warnawin E，et al.Functional TLR9 modulates bone marrow B cells from rheumatoid arthritis patients［J］.Eur J Immunol，2009，39(5):1211-1220.

［15］Huang QQ，Pope RM.The role of glycoprotein 96 in the persistent inflammation of rheumatoid arthritis［J］.Arch Biochem Biophys，2013，530(1):1-6.

［16］He Z，Shotorbani SS，Jiao Z，et al.HMGB1 promotes the differentiation of Th17 via up-regulating TLR2 and IL-23 of CD14+monocytes from patients with rheumatoid arthritis［J］.Scand J Immunol，2012，76(5):483-490.

［17］Shi B，Huang Q，Tak PP，et al.SNAPIN:an endogenous Toll-like receptor ligand in rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2012，71(8):1411-1417.

［18］Reilly M，Miller RM，Thomson MH，et al.Randomized，doubleblind，placebo-controlled，dose-escalating phase I，healthy subjects study of intravenous OPN-305，a humanized anti-TLR2 antibody［J］.Clin Pharmacol Ther，2013，94(5):593-600.

［19］Sacre SM，Lo A，Gregory B，et al.Inhibitors of TLR8 reduce TNF production from human rheumatoid synovial membrane cultures.J Immunol，2008，181(11):8002-8009.

［20］Park SJ，Kang SH，Kang YK，et al.Inhibition of homodimerization of toll-like receptor 4 by 4-oxo-4-(2-oxo-oxazolidin-3-yl)-but-2-enoic acid ethyl ester［J］.Int Immunopharmacol，2011，11(1):19-22.