占玲俊，唐 軍，秦 川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

PD－1：PD－L1/PD－L2通路在結(jié)核感染中的免疫作用

占玲俊，唐 軍，秦 川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

PD－1：PD－L1/PD－L2通路在腫瘤和某些感染性疾病中發(fā)揮免疫抑制作用，而在結(jié)核病中的免疫作用尚不明確。結(jié)核菌感染后，免疫細(xì)胞上PD－1：PD－L1/PD－L2通路高表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)顯示：用該通路的抗體阻斷后保護(hù)性T細(xì)胞增強(qiáng)，而體內(nèi)免疫作用不明確。PD－1與配體PD－L1結(jié)合后可能發(fā)揮免疫抑制作用，其中 PD－L1表達(dá)受Th1細(xì)胞因子調(diào)控;PD－1與配體PD－L2結(jié)合后可能發(fā)揮免疫保護(hù)作用，其中PD－L2表達(dá)受Th2型細(xì)胞因子調(diào)控。利用Cas9－CRISPR基因敲除方法分別敲除特定免疫細(xì)胞上PD－1、PD－L1和PD－L2，可研究PD－1、PD－L1和PD－L2在結(jié)核感染中免疫作用及機(jī)制，為結(jié)核病的防控提供理論依據(jù)。

PD－1：PD－L1/PD－L2通路 結(jié)核感染 免疫作用

結(jié)核病是免疫相關(guān)的感染性疾病，T細(xì)胞、APC (巨噬細(xì)胞、DC）等是重要的免疫細(xì)胞［1－3］。結(jié)核菌進(jìn)入機(jī)體后，首先被巨噬細(xì)胞吞噬，當(dāng)巨噬細(xì)胞的殺傷力強(qiáng)于結(jié)核菌的毒力時(shí)，結(jié)核菌被清除，反之，結(jié)核菌裂解巨噬細(xì)胞產(chǎn)生病變，繼而感染其他巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致感染播散［2］。此外，結(jié)核菌還經(jīng)APC進(jìn)行抗原加工并提呈給T細(xì)胞，刺激免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，通過(guò)IFN－+CD4+T細(xì)胞和IFN－+CD8+T細(xì)胞［1－2］發(fā)揮免疫保護(hù)作用，通過(guò)分泌 IL－17細(xì)胞因子的Treg細(xì)胞［3］發(fā)揮免疫抑制作用，感染的結(jié)果取決于保護(hù)性免疫和抑制性免疫抗衡的結(jié)果。

1 程序性死亡配體-1(PD-1）通路與免疫

PD－1通路包括PD－1及兩個(gè)配體PD－L1和PDL2。PD－1主要表達(dá)于CD4+T細(xì)胞，PD－L1表達(dá)于T細(xì)胞和APC(單核/巨噬細(xì)胞，DC和B細(xì)胞）表面，PD－L2表達(dá)于炎性巨噬細(xì)胞、DC、B1細(xì)胞表面。在病原或某些抗原蛋白誘導(dǎo)下，PD－L1、PD－L2均可表達(dá)于T細(xì)胞，PD－L1的表達(dá)受Th1細(xì)胞調(diào)控，PD－L2的表達(dá)受Th2細(xì)胞調(diào)控［4］。

在腫瘤、自身免疫病和某些持續(xù)性感染病(包括病毒如HIV、HCV等、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和真菌感染）中，PD－1：PD－L1/PD－L2通路向T細(xì)胞傳遞抑制性第二信號(hào)，導(dǎo)致T細(xì)胞“無(wú)能”或“耗竭”，從而發(fā)病［5］。雖然PD－1：PD－L1/PD－L2通路整體發(fā)揮免疫抑制作用，但其中PD－L1和PD－L2可能發(fā)揮相反的免疫作用。PD－L1能分別與PD－1和B7－1作用，發(fā)揮免疫抑制作用;PD－L2能分別與PD－1和B7－2作用，發(fā)揮免疫保護(hù)作用［6－7］。

2 PD-1：PD-L1/PD-L2通路與結(jié)核感染

在活動(dòng)性結(jié)核病人中，T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞及B細(xì)胞上PD－1、PD－L1和PD－L2的表達(dá)均明顯上升，以PD－L1表達(dá)升高為主要特點(diǎn)。其中T細(xì)胞上以PD－1升高為主;單核巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞以PD－L1為主，PD－1和PD－L2的表達(dá)也升高，表達(dá)水平接近。

體外實(shí)驗(yàn)證明：用PD－1、PD－L1和PD－L2的單抗分別阻斷結(jié)核病人外周血T細(xì)胞上PD－1、單核細(xì)胞上 PD－L1/PD－L2、或聯(lián)合阻斷 PD－1和 PD－L1/ PD－L2，均能挽救保護(hù)性的IFN－+－CD3+T細(xì)胞，并且保護(hù)性IFN－分泌增加，提示PD－1：PD－L1/PD－L2通路抑制抗結(jié)核的保護(hù)性免疫［8－9］。

BCG感染小鼠后，PD－1敲除的C57小鼠脾組織荷菌量比C57野生小鼠明顯低，PD－1：PD－L1作用使Th1型細(xì)胞免疫受損，提示：敲除PD－1對(duì)結(jié)核感染產(chǎn)生保護(hù)性免疫。而H37Rv感染PD－1敲除的C57小鼠后，肺組織病變比C57野生鼠重，肺、脾組織荷菌量也比野生小鼠高［10］，提示：PD－1幫助清除小鼠體內(nèi)的H37Rv結(jié)核菌，但不能確定PD－1是否有免疫抑制作用［11］。

深入分析可知：BCG和H37Rv感染后PD－1通路免疫作用不同，可能與PD－L1、PD－L2的表達(dá)差異有關(guān)。BCG感染后，PD－L1高表達(dá)，而PD－L2表達(dá)無(wú)明顯變化。PD－1：PD－L1使Th1型細(xì)胞免疫受損，PD－1敲除后可以拯救Th1型細(xì)胞免疫，表現(xiàn)出免疫保護(hù)作用，即脾組織荷菌量比野生小鼠低［10］。H37Rv感染后，PD－L1和PD－L2均高表達(dá)，PD－1： PD－L1可能發(fā)揮免疫抑制作用，而PD－1：PD－L2可能發(fā)揮免疫保護(hù)作用［11］。

3 結(jié)核感染中PD-1：PD-L1/PD-L2的免疫作用機(jī)制

用抗體阻斷結(jié)核病人外周血淋巴細(xì)胞上PD－1： PD－L1/PD－L2通路后，特異性脫顆粒的CD8+T細(xì)胞和IFN－+－CD3+T細(xì)胞升高，提示結(jié)核急性感染中PD－1：PD－L1/PD－L2通路能抑制效應(yīng)CD8+T細(xì)胞功能［12］和IFN－+－CD3+T細(xì)胞功能。其中PD－1、PDL1和PD－L2的作用機(jī)制各有特點(diǎn)。

(1）結(jié)核中PD－L1、PD－L2的免疫作用機(jī)制：用PD－L1抗體治療敗血癥引起的肝損傷，可逆轉(zhuǎn)因T細(xì)胞耗竭而致的肝損傷［13］。在哮喘、氣道變態(tài)反應(yīng)疾病中研究發(fā)現(xiàn)：PD－L1與PD－1和B7－1結(jié)合后，可抑制T細(xì)胞增殖。用抗體阻斷PD－L1后，IFN－表達(dá)上調(diào);單獨(dú)阻斷PD－L1與B7－1結(jié)合，對(duì)IFN－分泌無(wú)明顯影響，提示PD－1：PD－L1能抑制NKT細(xì)胞產(chǎn)生IFN－。PD－L2主要通過(guò)影響CD4+T細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子或共刺激分子的分泌來(lái)發(fā)揮免疫作用，PD－L2的作用可以不依賴PD－1［6，14］。Treg或NKT細(xì)胞也可參與PD－L2的免疫作用。結(jié)核中PD－L1和PD－L2的免疫作用機(jī)制可能與上述疾病中類似。

(2）PD－L1可能的作用機(jī)制：與潛伏感染相比，活動(dòng)性結(jié)核病人中高表達(dá)PD－L1的嗜中性粒細(xì)胞顯著增加［15］，而嗜中性粒細(xì)胞在小鼠結(jié)核中有病理?yè)p傷作用，提示PD－L1可能介導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞聚集所致的免疫病理?yè)p傷［16］。H37Rv感染人單核細(xì)胞后，PD－L1、PD－L2表達(dá)都明顯增高，PD－L1水平高于PD－L2;用單抗阻斷PD－L1后，IFN－+T細(xì)胞增殖明顯、凋亡減少，提示PD－L1可抑制保護(hù)性T細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。

(3）PD－L1和PD－1的免疫抑制作用機(jī)制不完全相同：在腫瘤和多種慢性感染中，PD－1：PD－L1作用均被證實(shí)能抑制T細(xì)胞的保護(hù)性免疫［5，13，17］，其免疫抑制作用在結(jié)核的體外實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)［8，18－20］。PD－1表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞和單核細(xì)胞表面，也表達(dá)于“耗竭”的T細(xì)胞表面。PD－1通過(guò)與PD－L1、PD－L2結(jié)合，抑制T細(xì)胞的TCR信號(hào)，下調(diào)免疫激活因子和存活相關(guān)的蛋白表達(dá)，促進(jìn)免疫抑制因子IL－10的表達(dá)。而表達(dá)于APC上的PD－L1是MAPK/細(xì)胞因子/STAT－3依賴模式：在STAT－3調(diào)控下，TLR－APC高表達(dá)IL－ 6和IL－10，抑制STAT－3的活化，從而阻斷PD－L1的表達(dá)［21］。因此，阻斷PD－1和PD－L1后免疫反應(yīng)存在差異。

(4）結(jié)核感染中PD－L1、PD－L2的表達(dá)和調(diào)控：結(jié)核病人中Th1(CD4+T細(xì)胞）和 Th2(CD8+T細(xì)胞）細(xì)胞均發(fā)揮免疫作用。Th1和Th2細(xì)胞在BCG與H37Rv感染的小鼠中表達(dá)有差異：BCG感染中期，發(fā)揮免疫保護(hù)作用的主要是Th1細(xì)胞，Th2細(xì)胞的免疫保護(hù)作用很微弱;而H37Rv感染小鼠后，Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞均發(fā)揮作用。PD－L1和PD－L2的表達(dá)分別由Th1和 Th2細(xì)胞來(lái)調(diào)控，在LPS、Th1型細(xì)胞因子IFN－刺激下，巨噬細(xì)胞上PD－L1的表達(dá)調(diào)控依賴STAT1，而Th2型細(xì)胞因子IL－4刺激炎性巨噬細(xì)胞上 PD－L2表達(dá)，其表達(dá)調(diào)控依賴STAT6［7］。BCG感染DC細(xì)胞后，PD－L2高表達(dá)，其表達(dá)依賴于IL－10，通過(guò)TLR2－p38 MAPK信號(hào)通路來(lái)調(diào)控［22］。

4 結(jié)語(yǔ)

PD－1：PD－L1/PD－L2通路與結(jié)核感染有很大的相關(guān)性，而具體的免疫作用和機(jī)制還未深入進(jìn)行，可以在細(xì)胞和動(dòng)物水平用特異性基因敲除技術(shù)研究PD－L1和PD－L2的免疫作用及相關(guān)的機(jī)制。明確該通路的作用和機(jī)制的同時(shí)，也為結(jié)核的干預(yù)提供指導(dǎo)。

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The immune role of PD-1：PD-L1/PD-L2 pathway in Mycobacterium tuberculosis infection

ZHAN Ling－jun，TANG Jun，QIN Chuan
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，Pan Jia Yuan Nan Li No．5，Chao Yang District，Beijing 100021，China）

PD－1：PD－L1/PD－L2 pathway played negative immune role in most tumor and several infectious diseases，but the immune role in tuberculosis(TB）was not explicited．Since the high expression of PD－1：PD－L1/PD－L2 pathway was correlated with MTB infection both in vitro and in vivo，the in vitro negative immune role was indicated by inhibited T cell protective immune function，while the in vivo immune role was not clear．The binding of PD－1 and PD－L1 played an immunosuppression role，the expression of PD－L1 was regulated by Th1－type cytokines．The binding of PD－1 and PD－L2 played protective immune role，and the expression was regulated by Th1－type cytokines．The immune role and mechanism of PD－1，PD－L1 and PD－L2 would be investigated by Cas9－CRISPR technique，which would provide theoretical basis for the tuberculosis prevention and control．

PD－1：PD－L1/PD－L2 pathway;Mycobacterium tuberculosis infection;Immune role

R－332

A

1671－7856(2015）07－0074－03

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．016

“十二五－艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”國(guó)家科技重大專項(xiàng)子課題(2012ZX10004501）。

占玲俊，博士，副研究員，研究方向：結(jié)核病與結(jié)核動(dòng)物模型研究。

秦川，教授，博士生導(dǎo)師。E－mail：chuanqin@vip．sina．com。

2015－06－24