吳升偉，胡國順，王正蓉，包懷恩

PRU株弓形蟲感染小鼠后腦組織免疫病理的研究

吳升偉1，胡國順2，王正蓉2，包懷恩2

目的 了解弓形蟲PRU株感染小鼠后腦內(nèi)局部細(xì)胞因子對腦組織的免疫病理作用。方法 51只ICR小鼠分為感染組(33只)和對照組(18只)，感染組經(jīng)腹腔注射弓形蟲PRU株10個包囊/鼠，對照組腹腔注射同等量的PBS。于感染后第5 d、10 d、15 d、20 d、30 d和90 d，剖殺感染組小鼠5只和對照組小鼠3只，取腦組織，部分作病理切片；部分提取其RNA，檢測IFN-γ、IL-4、IL-6和TNF-α mRNA；部分獲取腦組織上清液，用ELISA法測定上述細(xì)胞因子。結(jié)果 相對于正常對照組，感染小鼠腦組織中IFN-γ于感染后第5 d 開始升高，第10 d時下降達(dá)到最低，之后開始上升；TNF-α在感染第10 d或15 d時明顯降低，接著上升并于第30 d時達(dá)到高峰；IL-6在感染第5 d時開始升高，感染第10 d時降至最低，之后緩慢上升，并于第30 d后達(dá)到高峰；IL-4未見明顯變化。結(jié)論 弓形蟲PRU感染ICR小鼠的過程中，腦組織中IFN-γ、IL-6和TNF-α細(xì)胞因子在感染第10 d或15 d的低表達(dá)有利于弓形蟲逃避宿主的免疫殺傷作用，導(dǎo)致速殖子在腦組織中存活；同時細(xì)胞因子的分泌不平衡，導(dǎo)致小鼠腦組織中出現(xiàn)弓形蟲包囊與病理變化共存的隱性感染狀態(tài)。

弓形蟲PRU株; 免疫病理；細(xì)胞因子

弓形蟲病是由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)感染引起的嚴(yán)重危害健康的一種人獸共患性疾病。弓形蟲是重要的專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會性致病原蟲，且具有親神經(jīng)性的特點(diǎn)，腦組織是弓形蟲最易侵犯的部位之一[1]。

以往的研究顯示，強(qiáng)毒株弓形蟲急性感染小鼠時，在宿主體內(nèi)會出現(xiàn)細(xì)胞因子Th1/Th2亞群比例的變化，表現(xiàn)為兩類細(xì)胞因子水平從Th1占優(yōu)勢轉(zhuǎn)向Th2的偏移，這對于疾病的發(fā)展和預(yù)后具有重要意義[2]。此外，還發(fā)現(xiàn)弱毒株弓形蟲(例如PRU株)感染小鼠后，可在腦組織中形成包囊，并持續(xù)存在[3]。然而在此過程中，腦內(nèi)局部細(xì)胞因子是否發(fā)生了變化，以及它們對腦組織的病變及包囊形成的影響尚未闡明。

本實(shí)驗(yàn)以弓形蟲PRU株感染ICR小鼠，觀察腦組織病理變化，并分別從基因水平和蛋白水平檢測小鼠腦組織部分細(xì)胞因子的變化，探討弓形蟲感染后細(xì)胞因子介導(dǎo)的腦組織的免疫病理損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6～8周齡SPF級ICR雌性小鼠，體重20～25 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(小鼠許可證編號SCXK(京)2006-0009)。

1.2 蟲株 弓形蟲PRU株由蚌埠醫(yī)學(xué)院孫新教授惠贈，本室在昆明小鼠體內(nèi)傳代保種。

1.3 主要試劑 TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司， sample protector樣品穩(wěn)定劑、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司，IFN-γ、IL-4、IL-6和TNF-α ELISA KITS 購自cusabio生物公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物感染及樣本的保存 51只ICR雌性小鼠分為感染組(33只)和對照組(18只)，感染組小鼠經(jīng)腹腔注射弓形蟲PRU株10個包囊/鼠(于試管內(nèi)用無菌PBS調(diào)整至0.5 mL)，對照組小鼠腹腔注射同等量的PBS，每籠5～6只鼠，分別分籠飼養(yǎng)，正常取食及飲水。試驗(yàn)期間每天觀察和記錄小鼠發(fā)病情況，并于感染后第5 d、10 d、15 d、20 d、30 d和90 d，處死感染組小鼠5只和對照組小鼠3只，剖解小鼠，取腦組織，其中部分腦組織于10%中性甲醛溶液固定24 h，按常規(guī)方法進(jìn)行脫水、石蠟包埋，制作4 μm切片，作HE染色；部分腦組織保存于sample protector樣品穩(wěn)定劑中，-20 ℃保存，用于細(xì)胞因子的Real time PCR檢測；部分凍存于-80 ℃，用于ELISA法測定腦組織上清液中細(xì)胞因子的含量。

1.5 腦組織RNA的提取 用TRIzol法進(jìn)行提取，并用Gene Quant核酸定量儀進(jìn)行純度和濃度的測量，確保RNA的A260/280在1.8～2.0之間。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR的檢測

1.6.1 引物的設(shè)計(jì)和合成 采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)IFN-γ、IL-4、IL-6和TNF-α細(xì)胞因子引物，見表1。

1.6.2 Real Time PCR反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)前先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real Time PCR反應(yīng)體系為SYBR PremixEx Taq(2×) 10 μL，10 μm PCR primer 1.6 μL，ROX Refernce DYE(50×) 0.4 μL，cDNA模板5 μL，滅菌ddH2O 3 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，95 ℃15 s，60 ℃ 15 s。每個細(xì)胞因子檢測3個生物樣本，每個生物樣本重復(fù)3次。

1.6.3 結(jié)果與計(jì)算 各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算兩組之間基因的差異表達(dá)倍數(shù)，即兩組間基因表達(dá)拷貝差異為2-ΔΔCt倍，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

1.7 ELISA法測定

1.7.1 腦組織上清液的獲取 將保存于-80 ℃冰箱的腦組織取出解凍，按0.1 g腦組織加入1 mL PBS充分勻漿， -20 ℃兩次凍融以破壞細(xì)胞膜，后以4 ℃ 12 000 r/min離心20 min收集上清，分裝于-20 ℃以用于檢測。

1.7.2 ELISA法檢測腦組織中細(xì)胞因子 采用雙抗體夾心ELISA法檢測組織上清中細(xì)胞因子水平，最后用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔OD值，然后以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為X軸，濃度為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ mL)。

1.7.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)組和對照組的顯著性檢驗(yàn)采用SPSS16統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，多組樣本均數(shù)比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 感染鼠發(fā)病及腦組織病理學(xué)改變 感染鼠從第6 d開始出現(xiàn)食欲減退、聳毛、怠惰、抖動、腹瀉及死亡等臨床癥狀，第20 d后癥狀開始減輕。HE染色鏡下第10 d起見明顯的神經(jīng)元變性、衛(wèi)星現(xiàn)象及噬神經(jīng)現(xiàn)象，第15 d起見神經(jīng)膠質(zhì)結(jié)節(jié)及較小的弓形蟲包囊，第20 d起珠網(wǎng)膜下腔見炎癥細(xì)胞浸潤，第90 d時珠網(wǎng)膜下腔見肉芽組織。具體參考文獻(xiàn)[4]。

2.2 感染鼠腦組織細(xì)胞因子實(shí)時熒光定量PCR檢測 與正常對照比較，感染弓形蟲PRU株小鼠腦組織中IFN-γ、TNF-α和IL-6 mRNA均明顯上升。IFN-γ于感染第10 d時下降，之后開始上升，于第20 d時達(dá)到高峰；TNF-α于感染第5 d時降至較低，第10 d時開始升高，第15 d時又明顯降低，接著上升并于第30 d時達(dá)到高峰；IL-6在感染第5 d時是比較高的，第10 d時降至最低，之后緩慢上升，并于第30 d達(dá)到高峰；4種細(xì)胞因子中IL-4的mRNA表達(dá)量是最低的，并且包括陰性對照在內(nèi)的幾個時間點(diǎn)均沒有檢測出該細(xì)胞因子的mRNA。各試驗(yàn)組與正常對照組分別進(jìn)行比較，IFN-γ、TNF-α和IL-6細(xì)胞因子的CT值變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.377P<0.001；F=450.042P<0.001；F=176.953P<0.001 )。參見圖1。

2.3 感染鼠腦組織上清中細(xì)胞因子的ELISA法檢測 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對于正常對照組，感染組小鼠腦組織上清中IFN-γ、TNF-α和IL-6明顯升高。IFN-γ于感染后第5 d開始升高，第10 d時降至低于正常對照組濃度，達(dá)到最低，接著開始一直升高直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；TNF-α在感染第5 d時開始升高，第10 d時明顯降低，接著開始明顯升高，到第30 d時達(dá)到最高峰；IL-6在感染第5～15 d時與正常對照組比較變化不大，在經(jīng)過感染第10 d時的最低峰后，感染第15 d后開始上升，直至感染第90 d均保持在一個高值；IL-4是4個細(xì)胞因子中變化幅度最小，幾乎都圍繞陰性對照值上下波動。各試驗(yàn)組與正常對照組分別進(jìn)行比較，IFN-γ、TNF-α和IL-6細(xì)胞因子的濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.815P=0.025；F=9.620,P=0.000；F=3.124,P=0.015 )，而IL-4濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的(F=1.687,P=0.154)。參見圖2，圖3。

圖1 感染小鼠腦組織中IFN-γ、TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)

Fig.1 The mRNA express of IFN-γ, TNF-α and IL-6 in brain of infected mice

Fig.2 Kinetic change of IFN-γ and TNF-α in the brain tissue supernatant

Fig.3 Kinetic change of IL-4 and IL-6 in the brain tissue supernatant

3 討 論

現(xiàn)已明確，以表達(dá)IFN-γ和IL-2為代表的Th1 亞群細(xì)胞具有增強(qiáng)殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)介導(dǎo)的機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答；而以表達(dá)IL-6 和IL-4 為主的Th2 型細(xì)胞則主要是促進(jìn)抗體產(chǎn)生，介導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染弓形蟲PRU株第10 d至15 d時，小鼠出現(xiàn)食欲減退、聳毛、腹瀉及死亡等癥狀，鏡下腦組織出現(xiàn)變性及壞死等變質(zhì)病理改變，此時腦組織細(xì)胞因子檢測發(fā)現(xiàn)IFN-γ和TNF-α在基因水平和蛋白水平表達(dá)均較低，即Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答處于較低狀態(tài)，感染小鼠細(xì)胞免疫功能低下，小鼠出現(xiàn)死亡等癥狀。隨后IFN-γ和TNF-α表達(dá)開始升高，特別是IFN-γ的升高明顯，小鼠度過急性期，逐漸進(jìn)入恢復(fù)，鏡下見弓形蟲包囊、膠質(zhì)結(jié)節(jié)及肉芽組織等增生病理改變。除外Th1亞群細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子量的變化，Th2亞群細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子也發(fā)生了改變：IL-4未見明顯變化，IL-6在感染第10 d至15 d表達(dá)最低，之后開始上升。IL-6可作為一種重要的炎性介質(zhì)與其他細(xì)胞因子協(xié)同作用，加重弓形蟲感染后的免疫病理損害[6]。

正常情況下, 機(jī)體的Th1/ Th2 細(xì)胞處于動態(tài)平衡。在特異性抗原刺激下，這種動態(tài)平衡將被打破，發(fā)生了Th1/ Th2 細(xì)胞亞群間的飄移，這種變化影響機(jī)體的免疫功能，并與感染狀態(tài)及病程等密切相關(guān)，最終使弓形蟲逃避了宿主的免疫殺傷作用，并在腦組織中存活下來。資料顯示，弓形蟲感染宿主后，優(yōu)先侵犯宿主腦組織，并能通過細(xì)胞和體液免疫誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答，產(chǎn)生致炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致宿主-寄生蟲的關(guān)系失衡[7]。若小鼠度過急性期后存活下來，則Th1/Th2基本恢復(fù)平衡，小鼠進(jìn)入隱性感染狀態(tài)，同時出現(xiàn)弓形蟲包囊與腦組織病理改變共存的現(xiàn)象，即抗感染免疫與弓形蟲感染處于平衡狀態(tài)。

大腦是常見的弓形蟲包囊潛伏部位，其特殊的解剖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致腦組織局部細(xì)胞因子變化與外周不同。Hunter[8-9]等用PCR法檢測腦組織中細(xì)胞因子的變化，發(fā)現(xiàn)所有的感染弓形蟲的腦炎小鼠均能檢測到TNF-α、IL-1α、IL-1、IFN-γ和CD4標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄物，而IL-2和IL-4轉(zhuǎn)錄卻不能被檢測到。這些細(xì)胞因子能引起腦膜的炎癥，并可能在弓形蟲腦炎的免疫病理中起重要作用，這與本研究所觀察的結(jié)果類似。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，細(xì)胞因子激活小膠質(zhì)細(xì)胞在宿主防御弓形蟲播散方面起到非常重要的作用[10]。資料顯示，IFN-γ與TNF-α在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞殺死弓形蟲的過程中起到了重要的作用，它們能夠激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來阻止弓形蟲的復(fù)制以及引起細(xì)胞毒性T細(xì)胞溶解受感染的細(xì)胞。Benedetto等[11]研究了重組腫瘤壞死因子(rTNF-α)和催乳素(PRL)對鼠弓形蟲感染小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。發(fā)現(xiàn)TNF-α和PRL通過小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)了抗-細(xì)胞間粘附分子-1 (Anti-ICAM-1)的表達(dá)和內(nèi)源性IL-3和IL-6的生成，它們可誘導(dǎo)抗寄生蟲的功能，抵抗腦中鼠弓形蟲感染。本實(shí)驗(yàn)中觀察到IFN-γ與TNF-α升高，這些升高的細(xì)胞因子可能能夠激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來阻止弓形蟲的復(fù)制以及引起細(xì)胞毒性T細(xì)胞溶解受感染的細(xì)胞。

通過對感染弓形蟲小鼠腦組織細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測，可能通過局部產(chǎn)生的細(xì)胞因子量的變化來反映了細(xì)胞因子涉及到感染的免疫發(fā)病機(jī)制及間接抗弓形蟲活性，這將有助于進(jìn)一步全面揭示弓形蟲腦炎的免疫機(jī)制。

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Cerebral immunopathogenesis of mice infected withToxoplasmagondiiPRU strain

WU Sheng-wei1,HU Guo-shun2,WANG Zheng-rong2,BAO Huai-en2

(1.GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,China;2.DepartmentofParasitology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China)

To learn the brain immunopathogenesis in mice infected withToxoplasmagondiiPRU strain with the cytokines in the tissue, 51 mice were grouped into the infected and the control. Thirty-three ICR mice were infected intraperitoneally with cysts, and 10 cysts in each, 18 mice were injected with PBS as control. Five mice from the infected and three from the control were sacrificed under anesthesia on 5 d, 10 d, 15 d, 20 d, 30 d, and 90 d post-infection (p.i.), and the brain tissues were collected for hematoxylin-eosin (HE) staining and RNA extraction followed by examination of IFN-γ, IL-4, IL-6, and TNF-α with real-time PCR. The rest of the tissues were subjected to ELISA for the cytokines detection. Comparing with the control, IFN-γ in the infected mice began to rise on 5 d, decreased to the lowest on 10 d, and then began to raise again p.i. TNF-α began to decrease obviously from 10 d to 15 d p.i, and reached its highest level on 30 d p.i. IL-6 increased on 5 d p.i, and then decreased to the lowest on 10 d p.i, then rose slightly and reached the highest on 30 d p.i. No remarkable alteration of IL-4 was noted. ICR mice infected withT.gondiiPRU strain presented an obviously down-regulated expression of IFN-γ, IL-6 and TNF-α from 10 d to 15 d p.i, which might help the parasites survive from the host immune challenge. Additionally, the timing phase of cytokines expression may be responsible for the cyst formation and latentT.gondiiinfection.

ToxoplasmagondiiPRU strain; immunopathogenesis; cytokines

Bao Huai-en, Email: bhe@gmc.edu.cn

包懷恩，Email: bhe@gmc.edu.cn

1.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽 550004； 2.貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室，貴陽 550004

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.011

R531.8

A

1002-2694(2015)01-0049-04

2014-03-20；

2014-10-20