路新利，趙宏儒，王 偉，趙翠英，白廣義，張玉琪，李 巖，王瑩瑩，陳素良

性傳播艾滋病患者抗艾滋病毒治療后的HIV-1pol區(qū)基因突變研究

路新利，趙宏儒，王 偉，趙翠英，白廣義，張玉琪，李 巖，王瑩瑩，陳素良

目的 分析河北省正在參加抗艾滋病毒治療的通過性接觸感染HIV者耐藥性。方法 采集轄區(qū)內(nèi)正在接受抗艾滋病毒治療的性接觸感染HIV者的血漿，進行HIV基因型檢測，分析基因突變。結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn)231例患者中有68例患者發(fā)生了基因突變，對抗艾滋病毒藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性,耐藥發(fā)生率為29.44%(68/231)。逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥發(fā)生率(29.00%,67/231)遠高于蛋白酶抑制劑的耐藥發(fā)生率(0.87%,2/231)。結(jié)論 抗病毒藥物的誘導(dǎo)作用是導(dǎo)致耐藥突變的主要原因，在治療過程中適時進行耐藥監(jiān)測是必要的，可為制定最佳治療方案提供數(shù)據(jù)。

艾滋病病毒;性接觸;高效抗病毒治療；耐藥突變

河北省自1989年發(fā)現(xiàn)首例艾滋病以來，通過性接觸感染艾滋病毒(HIV，human immunodeficiency virus)的HIV/AIDS患者呈現(xiàn)逐年上升趨勢，近幾年來性接觸傳播在所有傳播途徑中占據(jù)第一位[1]。四免一關(guān)懷政策實施以來，經(jīng)過10年的免費抗艾滋病毒治療歷程，改善了艾滋病患者的健康狀況，延長了他們的壽命[2]。但隨之而來的問題也開始出現(xiàn)，HIV RNA開始發(fā)生適應(yīng)抗病毒藥物的位點突變，這些位點突變不同程度地減低了抗病毒藥物的靈敏性，甚至發(fā)生失效[3]。本論文研究了231例因性接觸而感染HIV的HIV/AIDS患者在接受抗病毒治療過程中所發(fā)生的位點突變情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象 231例患者均來自于河北省轄區(qū)內(nèi)，為性接觸感染HIV-1者，正在參加抗病毒治療，病毒載量≥1 000拷貝/mL。采集他們的EDTA抗凝全血10 mL,分離血漿后進行耐藥基因型檢測，并收集他們的治療信息和基本資料進行分析。

1.2 方法

1.2.1 病毒載量測定 用美國Roche公司的COBAS AMPLlCOR(TaqMAN 48)全自動核酸測定儀測定病毒載量，最低檢測限為20拷貝/mL。

1.2.2 HIV-1 RNA的提取 采用德國QIAGEN公司QIAamp( Viral RNA Mini Kit 提取HIV-1 RNA，嚴(yán)格按照說明書進行操作。

1.2.3 引物 第1組引物為HN1，HN2，HN3，HN4，第2組引物為MAW26，RT21，PRO-1，RT20。引物堿基序列分別為：Outer upper-primer ( HN1)：5′-CCT AGG AAA AAG GGC TGT TGG AAA TGT GG-3′：Outer lower-primer (HN2)：5′-AAC TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-3′; Inner upper-primer ( HN3) ：5′-GAG AGA CAG GCT AAT TTT TTA GGG A-3′; Inner lower -primer(HN4) ：5′-CAT TTA TCA GGA TGG AGT TCA TA-3′，MAW26：5′-TTG GAA ATG TGG AAA GGA AGG AC-3，RT21：5′-CTG TAT TTC TGC TAT TAA GTC TTT TGA TGG G-3′， PRO-1：5′-CAG AGC CAA CAG CCC CAC CA-3′， RT20:5′-CTG CCA GTT CTA GCT CTG CTT C-3′。

選用Promega公司的試劑以及該公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，引物為RT21，RNA模板量為10 μL，合成cDNA，具體反應(yīng)體系及操作程序按照試劑說明書進行。

1.2.4 目的基因片段的擴增[4]首先，使用HN1、HN2進行第一輪擴增HIV-1pol區(qū)基因(反應(yīng)程序：94 ℃ 1 min，60 ℃ 1min，72 ℃ 90 s，3個循環(huán)，然后94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min)，以第一輪產(chǎn)物為模板，以HN3、HN4為引物進行第二輪擴增，反應(yīng)程序同第一輪。使用第二組引物時，利用RT21為特異性引物合成的cDNA為模板，以MAW26為第一輪反應(yīng)引物進行第一輪擴增,反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;然后94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃ 150 s ,30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，然后以第一輪產(chǎn)物為模板，以PRO21、RT20為引物，進行第二輪擴增，反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.5 擴增產(chǎn)物的鑒定及序列測定 利用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，并以DNA Marker (DL2000)作為電泳參照物。陽性結(jié)果交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定。使用Contig Express軟件做序列拼接處理原始核苷酸序列，參照測序圖譜進行基因序列修訂后，直接進入web站http://hivdb.stanford.edu進行耐藥性分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件對所得到的研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)描述和卡方檢驗分析。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥發(fā)生率 231例研究對象中有68例患者發(fā)生了位點突變，導(dǎo)致了耐藥性，耐藥發(fā)生率為29.44%(68/231)，其中蛋白酶編碼區(qū)基因位點突變發(fā)生率為0.87%(2/231)，逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)突變發(fā)生率為29.00%(67/231)。

2.2 耐藥位點及耐藥圖譜 2例蛋白酶編碼區(qū)發(fā)生突變的患者中有1例患者不僅在蛋白酶編碼區(qū)位點46處發(fā)生了M46L，導(dǎo)致蛋白酶抑制劑(PIs，Protease inhibitor)ATV/r、FPV/r、IDV/r、LPV/r潛在低度耐藥和NFV低度耐藥，而且在逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)184位點出發(fā)生了M184V突變，造成逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(RIs，Reverse Transcriptase Inhibitor)3TC和FTC高度耐藥，另1例患者只發(fā)生了Q58E突變，該突變可使TPV/r和NFV靈敏性降低。

在逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)，針對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs，Nucleoside reverse transcriptase inhibitors)和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs，Non nucleoside reverse transcriptase inhibitors)的突變位點較多，例如184、75、41、215、65、181、103、108、179等位點，這些位點突變可導(dǎo)致抗病毒藥物靈敏性不同程度地降低或失效。在231例患者中突變頻率最高的是M184V(19.91%)。見表1、2。

2.3 耐藥影響因素 231例研究對象中男女性別比為1.7∶1。平均年齡為(39.28±19.71)歲；均為性接觸傳播，包括同性性傳播和異性性傳播，治療時間平均為(26.91±15.07)月；CD4細胞絕對數(shù)平均為123±11.66，病毒載量的lg平均值為3.98±0.85。治療方案主要以一線方案為主。卡方檢驗結(jié)果顯示在表1的各項因素中，基因亞型、治療時間、CD4細胞數(shù)和病毒載量是HIV-1 RNA發(fā)生耐藥性突變的無統(tǒng)計學(xué)意義影響因素(P<0.05)。而患者的性別、性行為和治療方案的選擇對耐藥突變的影響無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Note: S--Susceptible; P--Potential low-level resistance; L--Low-level resistance; H--High-level resistance; M--Intermediate resistance.

Note: S--Susceptible; P--Potential low-level resistance; L--Low-level resistance; H--High-level resistance; M--Intermediate resistance.

3 討 論

有研究顯示本研究對患者的性別、HIV-1亞型、CD4數(shù)、治療時間、病毒載量等基本信息和臨床資料進行了卡方檢驗統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示CRF01_AE與B亞型、治療時間的長短可顯著影響HIV-1 RNA位點突變(P<0.05)，同時作為評估抗病毒療效的重要實驗室參數(shù)，CD4細胞數(shù)的高低和病毒載量的多少都具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，治療時間越長，CD4細胞數(shù)越低，病毒載量越高，耐藥發(fā)生率越高。提示長期使用某一種藥物或某一種治療方案易誘發(fā)基因突變，增強患者對藥物的耐受性[5]。

本次研究發(fā)現(xiàn)與PIs相關(guān)的位點突變包括次要突變Q58E(1例)和主要突變M46IM(1例)，這兩個位點突變導(dǎo)致NFV、LPV/r等部分蛋白酶抑制劑低度耐藥。產(chǎn)生Q58E的患者沒有使用蛋白酶抑制劑，可能有交叉耐藥產(chǎn)生，而出現(xiàn)M46L突變的患者在治療方案中加入了克力芝(LPV/r)，推測認(rèn)為是其誘發(fā)了HIV-1 RNA的適應(yīng)性突變。

在逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)發(fā)生突變位點主要處于41-219區(qū)段(核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū))和101-190區(qū)段(非核苷類逆轉(zhuǎn)酶編碼區(qū))。這些突變導(dǎo)致3種治療方案中所有使用的RTs(表1)藥效不同程度地降低，甚至失效，產(chǎn)生耐藥性，而且隨著這些藥物治療時間的延長，耐藥發(fā)生頻率趨于升高(表1)，提示長時間使用一種藥物或一種治療方案容易誘發(fā)HIV-1 RNA發(fā)生適應(yīng)這些藥物的突變，降低病毒抑制效果，與李彥媚[6]等的報道基本一致。

與NRTIs相關(guān)的突變中，M184V(19.91%)突變頻率最高，其次是T215F(9.52%)、D67N (7.79%)、K65R(7.79%)、L210W(6.49%)、V75I/T(6.49%)、M41L(4.76%)等(表2)。針對NNRTIs的耐藥基因突變中，耐藥發(fā)生頻率最高的突變位點是K103N和Y181C，均為9.96%，其次是V108I(4.76%)等(表3)。與Joao等的報道相比[7]，逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)位點突變相似，但位點突變頻率低。有23.81%(55/231)的患者出現(xiàn)了3TC和FTC高度、中度或低度耐藥，低于李彥媚的89%的報道[6]，這是M184V、K65R和T69D突變的作用結(jié)果。有20.35%(47/231)的患者在210、215位點發(fā)生突變，導(dǎo)致ABC、AZT、D4T、DDI和TDF中度或低度耐藥，明顯高于黃丹關(guān)于男男性接觸者耐藥監(jiān)測結(jié)果[8]。非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)的突變可造成EFV、 ETR、NVP、RPV發(fā)生高度、中度或低度耐藥，其中Y181C引起其高、中度耐藥，有11.69%(27/231)患者的K103N、Y188L或G190S突變使EFV、NVP高度耐藥，ETR潛在低度耐藥。在同一突變位點，突變氨基酸類型不同，耐藥種類和耐藥程度也不同，例如K103N與K103S、G190A與G190S、V179E與V179D等。逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)的位點突變足以導(dǎo)致臨床常用藥物的病毒學(xué)治療失敗[3]。本次研究顯示治療方案中沒有使用的逆轉(zhuǎn)酶抑制劑TDF、ETR、RPV出現(xiàn)了中低度耐藥和蛋白酶抑制劑ATV/r、FPV/r、IDV/r潛在低度耐藥，提示我們藥物誘發(fā)突變是抗病毒治療失敗的主要原因，同時推測交叉耐藥和某些自然突變也可導(dǎo)致藥物靈敏性降低。本次研究證明蛋白酶抑制劑對我們的研究對象還具有一定抑制作用。

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HIV-1 RNApolgene mutation among patients infected with HIV through sex behaviour after antiretroviral therapy

LU Xin-li,ZHAO Hong-ru,WANG Wei,ZHAO Cui-ying,BAI Guang-yi,ZHANG Yu-qi,LI Yan,WANG Ying-ying,CHEN Su-liang

(CenterforDiseasePreventionandControlofHebeiProvince,Shijiazhuang050021,China)

In this study, we investigated the prevalence of HIV-1 drug resistance among patients infected with HIV through sex behaviour who were receiving highly active anti-retroviral therapy (HAART) in Hebei Province. Plasma samples were collected from patients who were infected with HIV through sex behaviour. Then the detection of HIV-1 genotype was implemented, and HIV drug-resistance mutations were analyzed. Results indicated that 68 of 231 patients, infected with HIV-1 by sex transmission, occurred drug-resistance mutation. The rate of the drug resistance was 29.44% (68/231). The rate of resistance to RTs (29.00%, 67/231) was much higher than that of PIs (0.87%, 2/231). Therefore, the main causation which resulted in therapic failure was drug-induced mutation. The detection of HIV drug resistance throughout HAART was useful so that we could make the better plan of highly active anti-retroviral therapy (HAART).

HIV; sexual contact; highly active anti-retroviral therapy; drug-resistance mutation

Chen Su-liang, Email: hebeicdc2013@sina.com

陳素良，Email：hebeicdc2013@sina.com

河北省疾病預(yù)防控制中心，石家莊 050021

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.012

R511

A

1002-2694(2015)01-0053-04

2014-05-13；

2014-10-29

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(20120256)

Supported by the Medical Science Research Plan of Hebei Province (No. 20120256)