薛小燕 郭小華 李 敏 羅煥敏

(贛州市人民醫(yī)院藥劑科，江西 贛州 341000)

神經(jīng)營養(yǎng)因子研究進展

薛小燕 郭小華1李 敏2羅煥敏3

(贛州市人民醫(yī)院藥劑科，江西 贛州 341000)

神經(jīng)營養(yǎng)因子；受體

神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)在神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞的增殖、存活、死亡方面起重要作用。NTF作為信號分子可能介導大腦的高級活動，例如學習、記憶、行為等。NTF還在神經(jīng)系統(tǒng)中起調節(jié)突觸連接、突觸結構和神經(jīng)遞質的釋放和增強等作用。NTF水平的改變可能會導致阿爾茨海默病(AD)或亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，還會導致抑郁癥、濫用藥物等精神障礙〔1～3〕。本文就NTF研究進展作一綜述。

1 NTF家族

許多多肽因子能影響神經(jīng)系統(tǒng)的存活、生長和分化。NTF包括：神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性NTF(BDNF)、NTF-3和-4等，它們在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布表達。這些NTF前體經(jīng)過酶的切割，變成分子量為12～14 kD的成熟穩(wěn)定的非共價二聚體。它們在腦的表達水平通常很低。NTF前體分子可被胞內外的蛋白酶如弗林蛋白酶、纖維蛋白溶酶、基質金屬蛋白酶(MMP)-3和MMP-7等切割，切割于前NTF高度保守的氨基二羧酸切割位點，釋放出碳端成熟蛋白。這些成熟的蛋白通過與酪氨酸激酶(Trk)家族受體或p75NTF受體(NTFR)結合來調節(jié)神經(jīng)元的存活、分化和突觸可塑性〔3〕。

其中NGF是第1個被發(fā)現(xiàn)的NTF，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，它能促進基底部的膽堿能神經(jīng)元的存活，使其發(fā)揮自己的功能。這些神經(jīng)元投射到海馬區(qū)域，而海馬被認為是與記憶的形成密切相關。AD的其中一個表現(xiàn)就是記憶功能的減退。其他NTF在中樞系統(tǒng)的表達范圍更加廣泛。其中，BDNF及NT-3與多種神經(jīng)元的存活及功能調節(jié)相關的營養(yǎng)因子在皮質和海馬中的表達較多〔3〕。

2 NTFR

NTF只能通過作用于Trk受體和(或)p75NTFR(屬于腫瘤壞死因子家族)起神經(jīng)營養(yǎng)作用。Trk受體含有一個細胞外的結合區(qū)域、一個單個的跨膜區(qū)域和一個胞內的高度保守的酪氨酸激酶區(qū)域。Trk受體有3種不同的亞型：TrkA、TrkB和TrkC。所有的亞型在胞內都存在一個高度保守的催化酪氨酸激酶位點和近膜磷酸化位點。Trk受體也存在許多截斷的亞型。最近有研究表明，TrkA和TrκC能觸發(fā)神經(jīng)元的死亡，但TrkB不能〔4〕。p75NTFR受體含有一個細胞外的結合區(qū)域、一個單個的跨膜區(qū)域和一個胞內蛋白質締合區(qū)域又叫死亡結構域〔5〕。所有的NTF都可以與p75受體結合。

雖然在Trk受體和p75NTR受體都有配體結合區(qū)域和胞質內的區(qū)域，但兩者的序列卻沒有相似的地方〔6〕。

NTF二聚化后與Trk受體結合，使受體二聚化，激活催化酪氨酸蛋白激酶區(qū)域。二聚化后的Trk受體自磷酸化胞內幾個關鍵的信號通道。這些在識別位點識別特定配體后磷酸化的酪氨酸，它們包含了例如Src同源區(qū)域2(SH2)(其主要作用是幫助其他蛋白識別其下游蛋白)等的磷酸酪氨酸結合基序。SH2結合蛋白連接激活Trk受體主要通過2條不同的胞內信號途徑來實現(xiàn)其神經(jīng)營養(yǎng)活性。主要的神經(jīng)元存活通道包括SH2連接Trk受體激活PI3K激酶，增加其磷酸化水平，然后順次激活其下游的在細胞凋亡程序中具有多重功效的Akt〔7〕。另外，Trk受體磷酸化SH2后還能激活Ras/紅裂原活化蛋白激酶(Ras/MAPK)途徑的活性，它們依次作用于環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)等轉錄因子。CREB蛋白在細胞周期、神經(jīng)突起生長、突觸可塑性等方面起多重作用〔8〕。同樣地，磷酯酶Cγ(PLC-γ)被Trk受體激活后，啟動PLCγ水解磷酯酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)產(chǎn)生IP3→Ca2+/DAG→PKC信號通路〔9〕。Trk受體的激活能導致下游多條通路的發(fā)生，改變轉錄因子程序。每種NTF選擇性地與一種特定的Trk受體結合：TrkA與NGF，NTF-3結合；TrkB與BDNF，NTF-3，NTF-4結合；TrkC與NTF-3結合。另一種受體即p75NTFR能與所有的NTF以幾乎同樣的親和力結合，而且p75NTFR能調節(jié)Trk受體的同源配體的親和力。最初Trk受體和p75NTFR受體被認為是高親和力受體和低親和力受體〔10〕，但是最近的研究表明，TrkA和TrkB受體與成熟的NTF結合的親和力為10-9到10-10mol，比高親和力位點(kD=10-11mol)要低。同樣地，NGF的前體表現(xiàn)為與p75NTFR高親和力結合。Trk介導與低濃度NGF的應答性依賴于 p75NTFR與TrkA受體的相對水平和它們形成的高親和力位點〔11〕。受體的比率能決定應答性和最終神經(jīng)元細胞的數(shù)目。雖然Trk受體和p75NTFR受體不直接相連接，但是有證據(jù)表明存在兩者的混合形式，可能兩者的相互作用，增加了配體的選擇性〔12〕。其中一個增加選擇特異性的途徑是增加配體的鑒別能力。例如：BDNF，NTF-3，NTF-4都能與TrkB受體結合，但是當p75NTFR與TrkB受體同時存在時，只有BDNF能與其作出功能性反應〔13〕。同樣地，NGF與NTF-3都能與TrkA受體結合，但是p75NTFR的出現(xiàn)限制了NGF對TrkA受體的信號傳導，卻不能阻止NTF-3對TrkA的作用。因此p75NTR與Trk受體的相互作用，能提高識別不同神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用〔14〕。

3 NTF與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育

脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)特征是由廣泛的程序性細胞死亡而形成的，它在發(fā)育中決定細胞數(shù)目和適當?shù)纳窠?jīng)元分布。NTF在發(fā)育的早期高度表達，而且在不同的發(fā)育時期對于神經(jīng)元的存活和選擇都是必須的。神經(jīng)營養(yǎng)假說為NTF在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中的作用提供了一個功能性的解析。在發(fā)育過程中，神經(jīng)元連接的目標分泌NTF引導神經(jīng)元連接目標〔15〕。通過這樣的方式，神經(jīng)系統(tǒng)塑造自身以維持最有競爭性和恰當性的突觸連接。神經(jīng)元之間競爭由目標細胞產(chǎn)生的少量NTF說明了選擇性的細胞存活。由這種假說可以預見2種情況：第一，在發(fā)育過程中神經(jīng)元存活的數(shù)量是與NTF分泌的總量相關。第二，特定受體在效應細胞中的表達會引發(fā)神經(jīng)元的應答。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，多種NTF受體的重復表達及同源配體可以允許多種不同的連接方式，使神經(jīng)網(wǎng)絡擴展，進入成熟期。此外，現(xiàn)在的研究已經(jīng)表明，神經(jīng)元自身分泌的NTF同樣也可以作用于自身(自分泌傳播)，也可以向下順向轉運至軸突作用于鄰近的神經(jīng)元。同時，神經(jīng)膠質細胞也可以通過旁系分泌的形式分泌NTF作用于神經(jīng)元。在外周神經(jīng)，NTF逆向信號傳遞途徑傳遞的信息必須有效地經(jīng)過長距離傳播，有時甚至超過1 m。NTF能在發(fā)育中促進神經(jīng)元的存活與分化。但是它們同時也可以引導神經(jīng)元的死亡。p75NTFR作為一個前凋亡受體，在細胞發(fā)育中的程序性細胞死亡和神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后細胞死亡的過程中起作用。在細胞凋亡過程中，p75NTFR表達增加。BDNF與p75NTFR結合會促進細胞凋亡和抑制交感神經(jīng)元軸突的生長，NGF與TrkA受體在同樣的神經(jīng)元中結合卻會產(chǎn)生細胞存活信號。在NTF生成的過程中，NTF前體比成熟的NGF更高效地誘導與p75NTFR相關的細胞凋亡。這些結果表明，NTF的生物學效應能被溶蛋白性裂解所調節(jié)，NTF前體更優(yōu)先激活p75NTFR受體介導凋亡，而成熟的NTF更偏好與Trk受體結合，促進神經(jīng)元的存活。

NTF與Trk受體結合介導神經(jīng)元存活，而與p75NTFR結合介導神經(jīng)元凋亡，是什么原因使NTF能找到適當?shù)氖荏w結合？NTF可能使用一個死亡受體來減低發(fā)育過程中的細胞死亡的效率。如果神經(jīng)元突觸不能正確地連接到適當?shù)哪繕?，那么它們就可能會凋亡。通過這樣的方式，NTF可能不但不能激活Trk受體，而且還會激活p75NTFR，啟動了神經(jīng)元死亡的程序〔16〕。例如：BDNF能在缺乏TrkB受體的交感神經(jīng)元中與p75NTFR結合，引導細胞死亡。同樣地NTF-4能與BDNF依賴性三叉神經(jīng)元中的p75NTFR結合，介導細胞死亡，其推測的原因可能是與TrkB受體相比，NT-3更優(yōu)先與p75NTFR結合〔17〕。因此，在同一細胞中，激活Trk或p75NTFR能表現(xiàn)出不同的結果。由p75NTFR介導的細胞死亡可能在發(fā)育中改進適當?shù)纳窠?jīng)元分布是十分重要的。

4 NTF與突觸可塑性

最近研究〔18〕表明，NTF在成人大腦的突觸可塑性中扮演極其重要的角色。許多神經(jīng)元群落不單單依賴那些使它們存活的NTF，還依賴于調節(jié)神經(jīng)元活性的NTF。在皮質第4層的視覺優(yōu)勢柱的結構能被如BDNF等外源性NTF所強烈影響，這說明了NTF在視覺系統(tǒng)的突觸可塑性的發(fā)育調節(jié)〔19〕。此外，在視覺系統(tǒng)中使用封閉抗體(同時也是NTF阻斷劑)，結果表明改變內源性NTF水平能劇烈地改變其效果。BDNF能使突觸興奮性后電位增強，術語叫長時程增強(LTP)。在海馬切片中，當加入阻斷劑如TrkB-IgG融合蛋白能阻斷BDNF誘導的LTP。而且，在制片中海馬切片帶有很小量的或沒有BDNF會引發(fā)LTP的減弱，這種情況暗示BDNF需要一個最低限度的劑量才能調節(jié)這種LTP。接著在這些切片中加入外源性的BDNF或使BDNF表達增加后，LTP又會恢復。

此外，NTF還能引起其他形式的突觸傳遞。外源性BDNF與NT-3能增強海馬和神經(jīng)肌肉接頭的誘發(fā)反應。因此，NTF除了能增加神經(jīng)細胞的存活、促進軸突樹突的生長外，還能調節(jié)LTP和神經(jīng)傳遞〔20，21〕。

5 其他NTF

幾個顯著的NTF家族能實現(xiàn)與NTF相似的功能。膠質細胞衍生的NTF(GDNF)是一個18 kD的蛋白，最初來源于星形膠質細胞株，隨后研究〔22〕表明在多種神經(jīng)元中都有產(chǎn)生。它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的多巴胺能區(qū)域，在腹側蒼白球、嗅結節(jié)及梨狀區(qū)等接受多巴胺能神經(jīng)元支配的區(qū)域均有表達，在非多巴胺能神經(jīng)元支配的區(qū)域如胚胎小腦原基、丘腦、海馬、基底前腦、脊髓背柱等的原代培養(yǎng)物中都可檢測到GDNF mRNA 的表達。它是多巴胺能神經(jīng)元中最重要的一種NTF。在體內體外的實驗中都表明GDNF能維持中腦多巴胺能神經(jīng)元存活〔23〕。由于它在多巴胺能神經(jīng)元中的神經(jīng)營養(yǎng)作用，GDNF已經(jīng)被考慮作為一種可能的治療帕金森病的方法。GDNF與膠質細胞源性NTFRα(GFRα1)結合，GFRα1利用其C-端的糖磷脂酰肌醇(GPI)錨定在細胞膜表面。它的其他配體artemin，neurturin和persephin也被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。這些配體-受體結合物能連同與Trk受體相似的受體酪氨酸激酶Ret，經(jīng)過二聚作用后具有催化活力。磷酸酪氨酸與調節(jié)蛋白如：Shc，結合后再與Ret受體結合，介導下游的信號通道，如MAPK通道〔24，25〕。先天性巨結腸病被認為與Ret和GFRα受體的突變相關〔26〕。

睫狀NTF(CNTF)屬于一個包括白血病抑制因子(LIP)和白細胞介素(IL)-6的細胞活素類家族。該家族能維持睫狀神經(jīng)元作為運動神經(jīng)元的功能。CNTF最初是從雞胚中分離出來的具有神經(jīng)保護作用的細胞因子，它是一種分子量為20 kD的酸性蛋白。由于CNTF能恢復體外動物模型中由于軸索顯微外科術造成的損傷，CNTF正被研究作為治療肌萎縮側索硬化(ALS)等運動神經(jīng)元疾病的治療手段。這些因子利用一個包括：胞質-胞膜結合的CNTF結合蛋白(CNTF)α，糖蛋白(gp130)和白細胞抑制因子受體(LIFR)的復合受體來調控信號傳導。在這個受體的下游，有一個叫Janus激酶的可溶性酪氨酸激酶，被激活后能磷酸化信號傳導及轉錄激活因子特異家族(STATs)，STAT被磷酸化后，發(fā)生聚合成為活化的轉錄激活因子形式，進入胞核內與靶基因結合，促進其轉錄〔27～29〕。

NGF，CNTF，GDNF及他們家族的其他成員，能磷酸化胞內的酪氨酸激酶位點，介導神經(jīng)細胞的存活。CNTF作用于含有CNTF受體、gp130和LIFR亞基的復合物來調節(jié)下游的JAK/SATA信號通道。而GDNF受體包括c-Ret受體酪氨酸激酶和一個單獨的α結合蛋白〔30〕。

6 利用非多肽小分子治療神經(jīng)退行性疾病的可能性

最近的臨床試驗〔31〕證明，直接利用NTF治療神經(jīng)退行性疾病和精神病的治療策略效果有限。第一，在體內傳遞足夠的NTF到目標神經(jīng)元是一個主要的障礙。因為NTF作為一種大分子的蛋白質，很難穿過血腦屏障。但是能快速穿過血腦屏障且具有激活NTF受體或者作用類似于NTF的小分子物質，能達到替代外源性NTF的一種方法。第二，NTF在體內具有多種神經(jīng)效應，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，如果加入大量無差別的NTF會導致不可預計的副作用，例如會導致癲癇等。此外，在臨床試驗中，未經(jīng)調節(jié)地使用BDNF會下調TrκB受體的活性，最終導致治療效果的下降。新的治療策略應該是有針對性地使用NTF。例如通過可調節(jié)的病毒載體趨向性地注入NTF。這種方法已經(jīng)在治療AD中使用，先是確定特定的神經(jīng)元，例如是基部的NGF依賴性神經(jīng)元發(fā)生神經(jīng)退行，再把外源性的NGF注入到該部位，以阻止其惡化。

但是由于外源性NTF具有很多缺點：半衰期短，藥效動力學不理想；容易被蛋白酶水解導致不能口服；分子量大，不易通過血腦屏障；可能會引發(fā)一些免疫反應等副反應。雖然經(jīng)過人工修飾的NT能通過血腦屏障，但是其成本高昂，且大量制備比較困難。而發(fā)展非多肽類的具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的小分子化合物能解決上述問題。其分子質量小，生物利用度高，可透過血腦屏障，易于合成，毒副作用小，可望成為治療神經(jīng)退行性疾病的新藥。

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〔2013-07-27修回〕

(編輯 杜 娟)

贛州市指導性科技項目(No.GZ2014ZSF199)

羅煥敏(1960-)，男，教授，主要從事神經(jīng)藥理學研究。

薛小燕(1986-)，女，碩士，主要從事藥學研究。

E830

A

1005-9202(2015)12-3463-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.134

1 贛南醫(yī)學院藥學院 2 江西省醫(yī)藥學校藥劑系 3 暨南大學醫(yī)學院藥理學系