俞 慧，邢林林，祁晶晶，倪欣濤，姜 盼，孫冰清，崔俊生，歐長(zhǎng)燦，于圣青，胡青海

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

應(yīng)用抑制性差減雜交篩選鴨疫里默氏桿菌強(qiáng)弱菌株基因組的差異片段

俞 慧，邢林林，祁晶晶，倪欣濤，姜 盼，孫冰清，崔俊生，歐長(zhǎng)燦，于圣青，胡青海

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

為了分析鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA）強(qiáng)毒菌株HXb2和弱毒菌株NJ-1基因組之間的差異基因，以HXb2株基因組為待測(cè)菌株，以NJ-1株基因組為驅(qū)動(dòng)菌株，構(gòu)建了兩株細(xì)菌基因組間的抑制性差減文庫(kù)。經(jīng)過(guò)dot-blot雜交和PCR驗(yàn)證，共鑒定到34個(gè)強(qiáng)弱毒株基因組差異片段。測(cè)定的序列經(jīng)BLAST、DNAStar和PSORTb分析，結(jié)果表明有2個(gè)片段所在基因編碼的蛋白為外膜蛋白，有2個(gè)片段所在基因編碼的蛋白為胞質(zhì)膜蛋白如磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，11個(gè)片段所在基因編碼的蛋白為胞內(nèi)蛋白如丙氨酸脫氫酶、β-內(nèi)酰胺酶及一些假定蛋白等，有19個(gè)片段所在基因編碼的蛋白（大部分為假定蛋白）定位未知。這些差異基因編碼的蛋白可能與鴨疫里默氏桿菌的毒力及HXb2株特異蛋白等有關(guān)。本研究為下一步鑒定新的毒力基因及其他特異蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

鴨疫里默氏桿菌；抑制性差減雜交；基因組差異

鴨疫里默氏桿菌感染又稱鴨傳染性漿膜炎，是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA）感染鴨、鵝、火雞等引起的一種高致病性、接觸傳染性疾病。該病呈急性或慢性敗血癥形式，其特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎[1]，可引起病鴨消瘦、胴體淘汰、品質(zhì)下降以及高死亡率，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前報(bào)道的血清型至少有21種[3]，而且不同血清型之間交叉保護(hù)性低[4]。

目前對(duì)鴨疫里默氏桿菌的致病機(jī)制和毒力相關(guān)基因還知之甚少，已經(jīng)確定的毒力相關(guān)因子有外膜蛋白 OmpA[5]、TbdR1[6]、SIP[7]、TonB1和TonB2[8]。另外，還推測(cè)一些因子可能與致病性相關(guān)，如pCFC1 質(zhì)粒中含有兩個(gè)毒力相關(guān)基因 VapD1 和VapD2，以及 CAMP 溶血素等[9]。

鑒定強(qiáng)毒株與弱毒株株基因組差異對(duì)于分析鴨疫里默氏桿菌菌株遺傳分化關(guān)系、毒力變異、分子流行病學(xué)分析等方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。本研究采用抑制性差減雜交（suppression subtractive hybridization, SSH）的方法，構(gòu)建了RA強(qiáng)毒力菌株與弱毒力菌株之間遺傳差異表達(dá)基因文庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和試劑鴨疫里默氏桿菌強(qiáng)毒菌株HXb2和弱毒菌株NJ-1由本實(shí)驗(yàn)室保存，所有RA菌株均用胰酶大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)，或TSA平板置5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)；胰酶大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基購(gòu)自德國(guó)MERCK公司；大腸桿菌（DH5α）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；抑制性差減雜交試劑盒購(gòu)自Clontech公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；地高辛探針標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司；限制性內(nèi)切酶Rsa I、Taq酶購(gòu)自Promega公司。

1.2 細(xì)菌基因組DNA的制備取-80℃凍存的RA菌株HXb2和NJ-1，分別涂布TSA平板，在5% CO2培養(yǎng)箱37℃過(guò)夜培養(yǎng)。用無(wú)菌TSB洗下平板上的細(xì)菌，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根）分別提取2株細(xì)菌的基因組DNA，然后用Nanodrop微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度。

1.3 抑制性差減雜交（SSH）以RA菌株HXb2為待測(cè)菌株（tester），以NJ-1為驅(qū)動(dòng)菌株(driver)，將其基因組DNA分別用RsaⅠ酶進(jìn)行消化。待測(cè)菌株HXb2 的DNA分為兩部分，分別連接不同接頭，按照Clontech公司差減雜交試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接效率分析。利用接頭外側(cè)序列引物、23S rRNA正向引物及23S rRNA反向引物分別對(duì)大腸桿菌23S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。確定連接效率以后，進(jìn)行差減雜交。第1次雜交中，將酶切后的過(guò)量驅(qū)動(dòng)菌株NJ-1 DNA分別加至兩種接頭連接后的待測(cè)菌株HXb2 DNA樣品中，樣品變性后在63℃雜交1.5 h。第2次雜交中，將以上兩個(gè)雜交樣品混合，加入新的變性驅(qū)動(dòng)菌株NJ-1 DNA，63℃雜交過(guò)夜。雜交后的產(chǎn)物加入根據(jù)連接接頭設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，所得的PCR產(chǎn)物即為差減后的基因組片段。PCR產(chǎn)物純化后與pGEM-T Easy載體相連接，轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板篩選陽(yáng)性克隆，建立抑制性差減雜交文庫(kù)。

1.4 斑點(diǎn)雜交用地高辛分別標(biāo)記的HXb2株和NJ-1株基因組DNA經(jīng)RsaⅠ酶切后的產(chǎn)物作為探針，標(biāo)記方法按地高辛標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。再將用PCR擴(kuò)增白斑單克隆菌中T載體中插入的片段，在尼龍膜上進(jìn)行點(diǎn)雜交，以鑒定差減片段的特異性。

1.5 測(cè)序根據(jù)斑點(diǎn)雜交的結(jié)果，將對(duì)應(yīng)的含陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的細(xì)菌克隆挑出，送上海英濰捷基公司完成測(cè)序工作。用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）和DNAStar 軟件（DNAStar Inc., Madison, WI, USA）進(jìn)行序列同源性等分析。

1.6 差異片段的PCR鑒定根據(jù)SSH后得到的差異片段序列設(shè)計(jì)引物，分別以RA菌HXb2株和NJ-1株為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增[10]，鑒定該差異片段是否僅存在于HXb2株基因組中，NJ-1株基因組中沒(méi)有。

2 結(jié)果

2.1 基因組提取、酶切結(jié)果分析提取的RA HXb2和

NJ-1的基因組經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，其OD260/OD280均為1.87，濃度分別為312.4 μg/μL和296.1 μg/ μL，證明基因組中蛋白質(zhì)和RNA污染較少，基因組純度較高。瓊脂糖凝膠電泳顯示基因組條帶完整清晰，無(wú)降解。RsaⅠ酶切后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在0.1～2 kb之間呈拖帶狀（見(jiàn)圖1），可見(jiàn)酶切完全。

2.2 差異片段的多樣性鑒定差減后的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化后挑選陽(yáng)性克隆用SSH試劑盒中的巢式PCR引物1/引物2R進(jìn)行菌落PCR鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增的產(chǎn)物大小分布不一，呈現(xiàn)多樣性，大小在0.25～1.1 kb之間（圖2），可見(jiàn)構(gòu)建出來(lái)的差減文庫(kù)具有良好的多樣性。

2.3 強(qiáng)弱菌株差異片段的篩選斑點(diǎn)雜交結(jié)果見(jiàn)圖3，根據(jù)雜交信號(hào)初步篩選到60個(gè)可能的強(qiáng)弱菌株差異基因片段。根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)一步常規(guī)PCR驗(yàn)證其在HXb2中的特異性。結(jié)果篩選到了34個(gè)HXb2與NJ-1株的差異基因組片段。

2.4 差異基因片段的序列分析將獲得的34個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序并將測(cè)序結(jié)果遞交GenBank 進(jìn)行同源性分析(表1)。用PSORTb Subcellular Localization Prediction Tool（http://www.psort.org/psortb/）在線軟件分析差異基因編碼蛋白的定位。

3 討論

SSH由Diatchenko等[11]1996年首次報(bào)道，是抑制PCR與差減雜交技術(shù)相結(jié)合的更簡(jiǎn)單更快速的分離差異基因的方法。它應(yīng)用抑制性PCR原理，利用兩種接頭，選擇性擴(kuò)增差異表達(dá)的靶片段，抑制非靶片段的擴(kuò)增。該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于差異基因的快速篩選，為微生物基因功能研究提供有力手段。Akopyants等[12]首次證實(shí)SSH可用來(lái)篩選細(xì)菌特異性序列。本研究采用SSH方法來(lái)篩選RA強(qiáng)毒

菌株HXb2和弱毒菌株NJ-1基因組的差異片段。

通過(guò)PCR驗(yàn)證，在60個(gè)片段中鑒定到34個(gè)HXb2特異性差異片段。依據(jù)其所在基因編碼蛋白的定位可進(jìn)行如下分類：（1）片段所在的基因編碼細(xì)胞外膜蛋白。17#為氯高鐵血紅素受體的基因片段，氯高鐵血紅素受體能與血紅素特異性的結(jié)合，使細(xì)菌能從外部環(huán)境中攝取鐵元素。鐵是細(xì)菌生命活動(dòng)必須的營(yíng)養(yǎng)元素，在生物代謝過(guò)程中起著非常重要的作用，雖然宿主體中含鐵元素豐富，但絕大部分與轉(zhuǎn)鐵蛋白（主要是血紅素）和乳鐵蛋白結(jié)合在一起。有研究表明細(xì)菌在宿主體內(nèi)能否獲取充分的鐵是決定病原菌能否突破宿主天然免疫系統(tǒng)，造成感染的重要原因[14]。片段9#與patatin樣磷脂酶（patatinlike phospholipase, PNPLA）具有同源性，PNPLA家族的蛋白都具有patatin結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包括絲氨酸-天冬氨酸催化三聯(lián)體的酶活性部位和底物結(jié)合區(qū)域兩個(gè)重要組成部分[15]，并可通過(guò)不同方式分泌至胞外并發(fā)揮表面抗原功能。2003年Sato等[16]在銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）中發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有磷脂酶活性的毒力因子ExoU，與patatin存在較高的同源性，其是否與RA毒力相關(guān)有待進(jìn)一步研究。另外，片段1#編碼的是與硫胺素合成有關(guān)的膜連脂蛋白，與片段5#編碼的ApbE樣蛋白有很高的同源性。ApbE是鼠傷寒沙門(mén)氏菌的一種脂蛋白，與硫胺素的合成有關(guān)[17]。（2）差異片段所在的基因編碼一些酶類和蛋白：33#編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，而糖基轉(zhuǎn)移酶是糖基化過(guò)程的關(guān)鍵酶，根據(jù)功能預(yù)測(cè)可能與脂多糖（LPS）合成有關(guān)，LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜中的組成成分，是內(nèi)毒素和重要群特異性抗原，它能在細(xì)菌周?chē)纬梢粚颖Ｗo(hù)屏障以逃避抗生素的作用，并作用于宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)IL、TNF等細(xì)胞因子的釋放，在革蘭陰性細(xì)菌致病過(guò)程中起重要作用；片段6#編碼蛋白屬于核酸甲基轉(zhuǎn)移酶，其功能與核糖體代謝相關(guān)；片段18#和21#編碼的丙氨酸脫氫酶和谷氨酰胺酰-tRNA合成酶參與細(xì)胞代謝和蛋白質(zhì)的合成，20#編碼的蛋白二硫鍵還原酶和30#編碼的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于胞質(zhì)膜蛋白，磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是普遍存在于細(xì)菌中參與磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的一個(gè)重要家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。（3）一些差異片段所在的基因編碼假設(shè)蛋白或功能未知的蛋白，其表達(dá)的蛋白及功能有待進(jìn)一步分析。（4）差異片段中還有一些是基因組中的可移動(dòng)成分。如27#和29#是IS4插入序列轉(zhuǎn)座酶，31#是IS1插入序列部分片段，可能參與外源基因或片段的水平轉(zhuǎn)移。

另外，根據(jù)差異片段在CH-2基因組中的位置的對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)1個(gè)分布相對(duì)集中的區(qū)域，長(zhǎng)度為304 kb左右，片段數(shù)為15個(gè)。其中有1個(gè)片段編碼的是與硫胺素合成有關(guān)的膜連脂蛋白；另1個(gè)片段編碼β-內(nèi)酰胺酶，與細(xì)菌的耐藥性有關(guān)，β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是革蘭陰性細(xì)菌對(duì)青霉素、頭孢霉素等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制之一；另2個(gè)片段編碼為丙氨酸脫氫酶和ATP酶；其他還包括插入因子insA、代謝蛋白、DNA修飾限制系統(tǒng)特異位點(diǎn)I型以及若干假定蛋白。推測(cè)該集中區(qū)域可能為HXb2株外源基因插入的熱點(diǎn)區(qū)域，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究成功構(gòu)建了HXb2和NJ-1株基因組的的差減文庫(kù)，為進(jìn)一步鑒定鴨疫里默氏桿菌的毒力相關(guān)基因、探索強(qiáng)毒株和弱毒株之間差異的分子基礎(chǔ)等奠定了重要基礎(chǔ)。

[1] Segers P, Mannhein W, Vancaneyt M, et al. Riemerella anatipestifer gen. nov., camb. nov., the causative agent of septicemia anserum exsudative, and its phylogenetic affiliation within the Flavobacterium-Cytophga rRNA homology group [J]. Int J Syst Bacteriol, 1993, 43(4): 768-776.

[2] Pathanasophon P, Sawada T, Tanticharoenyos T. New serotypes of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thailand [J]. Avian Pathol, 1995, 24(1): 195-199.

[3] Sandhu T S. Immuization of white Pekin duck lings against Pasteurella anatipestifer infection [J]. Avian Dis, 1979, 23: 662-669.

[4] Akopyants N S, Fradkov A, Diatchenko L, et al. PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacter pylori [J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1998, 95(22):13108-13113.

[5] Hu Q, Han X, Zhou X, et al. OmpA is a virulence factor of Riemerella anatipestifer [J]. Vet Microbiol, 2011,

150(3-4): 278-283.

[6] Lu F, Miao S, Tu J, et al. The role of TonB-dependent receptor TbdR1 in Riemerella anatipestifer in iron acquisition and virulence [J]. Vet Microbiol, 2013, 167(3-4): 713-718.

[7] Tu J, Lu F, Miao S, et al. The Siderophore-interacting protein is involved in iron acquisition and virulence of Riemerella anatipestifer strain CH3 [J]. Vet Microbiol, 2014, 168(2-4): 395-402.

[8] Hu Q, Ding C, Tu J, et al. Immunoproteomics analysis of whole cell bacterial proteins of Riemerella anatipestifer [J]. Vet Microbiol, 2012, 157(3-4): 428-438.

[9] Chang C F,Hung P E,Chang Y F. Molecular characterization of a plasmid isolated from Riemerella anatipestifer [J]. Avian Pathol, 1998, 27(4): 339-345.

[10] Parsons Y N, Panagea S, Smart C H, et al. Use of subtractive hybridizationto identify a diagnostic probe for a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(12): 4607-4611.

[11] Diatchenko L, Lau Y F, Campbell A P, et al. Suppression subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93(12): 6025-6030.

[12] Akopyants N S, Fradkov A, Diatchenko L, et al. PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacterpylori [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(22): 13108-13113.

[13] Janke B, Dobrindt U, Hacker J, et al. A subtractive hybridization analysis of genomic diffetences between the uropathogenic E.coli strain 536 and the E.coli K-12 strain MG 1655 [J]. FEMS Microbiol Lett, 2001, 199(1): 61-66.

[14] Weinberg E D. Iron availability and infection[J]. Biochim Biophys Acta, 2009, 1790(7): 600-605.

[15] Wilson P A, Gardner S D, Lambie N M, et al. Characterization of the human patatin-like phospholipase family [J]. J Lipid Res, 2006, 47(9): 1940-1949.

[16] Sato H, Frank D W, Hillard C J, et al. The mechanism of action of the Pseudomonas aeruginosa-encoded type III cytotoxin, ExoU [J]. EMBO J, 2003, 22(12): 2959-2969.

[17] Beck B J, Downs D M.The apbE gene encodes a lipoprotein involved in thiamine synthesis in Salmonella typhimurium [J]. J Bacteriol, 1998, 180(4): 885-891.

IDENTIFICATION OF GENOMIC DIFFERENCES BETWEEN VIRULENT AND ATTENUATED RIEMERELLA ANATIPESTIFER STRAINS USING SUPPRESSION SUBSTRACTIVE HYBRIDIZATION

YU Hui, XING Lin-lin, QI Jing-jing, NI Xin-tao, JIANG Pan, SUN Bing-qing, CUI Jun-sheng, OU Chang-can, YU Sheng-qing, HU Qing-hai
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

To analyze the genomic differences between highly pathogenic strain HXb2 and low pathogenic strain NJ-1 of Riemerella anatipestifer, suppression subtractive hybridization (SSH) was performed using HXb2 genome as tester and NJ-1 genome as driver. After examination in the dot-blot and PCR, 34 differential fragments were identified. Sequence analysis with softwares BLAST, DNAStar and PSORTb showed that 2 differential genes coding for membrane protein, 2 genes for cytoplasmic membrane protein such as phosphate transporter and 9 genes for intracellular proteins such as alanine dehydrogenase, beta-lactamase and some hypothetical protein. In addition, the locations of proteins (mostly hypothetical proteins) encoded by other 19 differential genes were unknown. The proteins encoded by these differential genes might be related to the virulence of HXb2, or HXb2-specif c proteins, etc. This study laid the groundwork for further identifying new virulence factors and studying the functions of the HXb2- specif c proteins.

Riemerella anatipestifer; suppression subtractive hybridization (SSH); genomic differences

S852.612

A

1674-6422（2015）03-0024-06

2014-12-31

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272590, 31472224)

俞慧，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

胡青海，E-mail: hqh@shvri.ac.cn