張 夢(mèng)，劉迎春，蔣 蔚，陳永軍，張花景，薛俊欣,2，宮楓舉,2，曾 鵬,2，王民燕，王 權(quán)

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095）

·研究論文·

磺胺氯吡嗪鈉單克隆抗體的制備及鑒定

張 夢(mèng)1，劉迎春1，蔣 蔚1，陳永軍1，張花景1，薛俊欣1,2，宮楓舉1,2，曾 鵬1,2，王民燕1，王 權(quán)1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095）

應(yīng)用重氮化方法制備了磺胺氯吡嗪鈉（sulfachloropyrazine sodium, SPZ）完全抗原SPZ-OVA，將成功偶聯(lián)的人工全抗原（SPZ-OVA）免疫BALB/c小鼠，免疫4次后，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，1號(hào)小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)到1 : 6.4×104。取該小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。利用ELISA方法對(duì)融合后的雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株：D9。將細(xì)胞株D9擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)腹腔注射小鼠使其產(chǎn)生腹水。腹水單抗經(jīng)純化后，通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)該單克隆抗體的效價(jià)、半數(shù)抑制濃度以及特異性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，所制備的單克隆抗體效價(jià)為1 : 4×105，半數(shù)抑制濃度為326 ng/mL，特異性良好。

磺胺氯吡嗪鈉；單克隆抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA

磺胺類藥物（sulfonamides，SAs）具有對(duì)氨基苯磺酸結(jié)構(gòu)，該類藥物抗菌譜廣，因其價(jià)格低廉、使用方便在動(dòng)物養(yǎng)殖中被廣泛使用[1]。其中磺胺氯吡嗪鈉 (sulfachloropyrazine sodium，SPZ) 具有在動(dòng)物體內(nèi)作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，且不影響宿主對(duì)球蟲的免疫力等特點(diǎn)，從而被用于治療家禽球蟲病[2]。有研究表明SPZ也可抑制弓形蟲速殖子的繁殖[3]。然而磺胺類藥物作為飼料添加劑，卻往往導(dǎo)致多種細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，威脅人類健康[4]。為此，亞洲和歐美等多個(gè)國(guó)家規(guī)定了動(dòng)物性食品中磺胺類藥物的最高殘留限量（maximum residue limit, MRL）為0.1 mg/ kg[5]，我國(guó)規(guī)定動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物的MRL為0.05～0.1 mg/kg[6]。

目前，磺胺類藥物殘留檢測(cè)常采用氣相色譜法[7,8]、液相色譜法[9,10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等。與理化檢測(cè)方法相比，免疫學(xué)方法具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的特點(diǎn)，因此，本研究擬制備磺胺氯吡嗪鈉的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（indirect copetitive ELISA，ci-ELISA）方法，為該藥殘留檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑BALB/c小鼠，昆明系小鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；磺胺氯吡嗪鈉（含量99.97%，批號(hào)：091001）、磺胺嘧啶鈉（含量99.53%，批號(hào)：091001）、磺胺對(duì)甲氧基嘧啶鈉（含量99.23%，批號(hào)：090803）、磺胺氯噠嗪鈉（含量99.81%，批號(hào)：20091101）、磺胺甲氧噠嗪鈉（含量99.50%，批號(hào)：20091101）和磺胺二甲嘧啶鈉（含量99.55%，批號(hào)：090911）購(gòu)于上海寶山振宗生物工程廠；40%PEG、牛血清蛋白（BSA）和卵白蛋白(OVA) 購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；NaNO2和鹽酸購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 磺胺氯吡嗪鈉（SPZ）免疫原的制備及鑒定

1.2.1 磺胺氯吡嗪鈉（SPZ）完全抗原SPZ-OVA及包被原SPZ-BSA的制備 通過重氮化方法制備其免疫原及包被原。首先對(duì)SPZ進(jìn)行重氮化反應(yīng)：稱取SPZ 10 mg，用少量蒸餾水溶解，在4℃條件下同時(shí)緩慢滴加預(yù)冷的鹽酸（0.1 mol/L）和NaNO2水溶液（10 g/L），并用淀粉碘化鉀試紙實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，試紙剛變藍(lán)時(shí)停止滴加反應(yīng)液，4℃避光反應(yīng)10 min。

取25 mg的OVA溶于1 mL的碳酸鹽緩沖溶液（pH 9.6，0.2 mol/L）中，離心后取上清，在4℃條件下，逐滴加入NaOH（1 mol/L）和重氮化的SPZ溶液，并持續(xù)攪拌，保證反應(yīng)體系的pH值在10左右。4℃避光反應(yīng)過夜，然后用PBS（pH 7.4）透析，每天更換透析液3次，透析3 d。將制備的SPZ-OVA分裝、標(biāo)記，-20℃保存。

包被抗原（SPZ-BSA）的制備，用BSA替代OVA，其他操作同上。

1.2.2 完全抗原鑒定 把透析好的免疫原SPZ-OVA和載體蛋白OVA用PBS配制成200 ng/mL溶液，將藥物SPZ用PBS配制成50 μg/mL溶液，用紫外分光光度計(jì)分別進(jìn)行紫外掃描，通過比較藥物和偶聯(lián)物的紫外圖譜對(duì)偶聯(lián)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 單克隆抗體制備

1.3.1 小鼠免疫 取8周齡BALB/c小鼠2只，將SPZ-OVA用弗氏完全佐劑乳化后，足墊注射小鼠進(jìn)行首次免疫，劑量為200 μg/只。隨后每2周對(duì)小鼠加強(qiáng)免疫1次，用與首次免疫等劑量抗原和弗氏不完全佐劑乳化后，皮下多點(diǎn)注射免疫。細(xì)胞融合前3 d，小鼠腹腔直接注射SPZ-OVA，250 μg/只，進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫。

1.3.2 細(xì)胞融合及培養(yǎng) 細(xì)胞融合時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）和免疫小鼠的脾細(xì)胞，以10:1的比例混合置于融合管中，在45 s內(nèi)加入1 mL預(yù)熱的PEG，作用90 s后，加入30～40 mL預(yù)熱的不完全DMEM培養(yǎng)基，終止反應(yīng)。在37℃培養(yǎng)箱中靜置10 min后離心，棄上清后用含20% 胎牛血清（FBS）的HAT完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將融合細(xì)胞懸液滴加到鋪有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的96孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后注意觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，融合后d7補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基，觀察融合細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。約10～15 d后，待雜交瘤細(xì)胞布滿孔底約1/5面積時(shí)，吸取細(xì)胞上清供抗體檢測(cè)。1.3.3 雜交瘤細(xì)胞的初步篩選 鏡檢觀察培養(yǎng)孔中細(xì)胞克隆生長(zhǎng)情況，對(duì)孔中細(xì)胞克隆不超過3個(gè)的進(jìn)行標(biāo)記，吸取細(xì)胞上清，然后通過間接ELISA測(cè)定抗體分泌情況。具體步驟：以0.5 μg/mL SPZ-BSA

包被酶標(biāo)板，4℃過夜，用PBST（0.05% Tween-20 PBS溶液）洗滌3～4次，每次3 min，然后加200 μL明膠（10 g/L），37℃ 封閉3 h，同上洗滌。加入待測(cè)細(xì)胞上清10 μL，用抗體稀釋液（含5% 小牛血清的PBST）補(bǔ)液至100 μL，陰性對(duì)照加100 μL抗體稀釋液，37 ℃孵育1.5 h，同上洗滌。每孔加入100 μL 按1:2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1.5 h，同上洗滌。每孔加入100 μL新配制TMP底物顯色液，37℃避光反應(yīng)10～15 min，然后加入50 μL硫酸溶液（2 mol/L）終止反應(yīng)，測(cè)量OD450值，P/N≥2.1為陽(yáng)性。

從陽(yáng)性克隆中去除其分泌抗體對(duì)蛋白載體有反應(yīng)的克隆，分別以SPZ-OVA、BSA和OVA包被，對(duì)陽(yáng)性克隆再次篩選，將僅對(duì)SPZ-BSA顯色的孔判為陽(yáng)性。

1.3.4 對(duì)細(xì)胞陽(yáng)性克隆進(jìn)行亞克隆及藥物競(jìng)爭(zhēng)抑制篩選 對(duì)上述陽(yáng)性細(xì)胞克隆挑選OD450值高且生長(zhǎng)狀態(tài)好的陽(yáng)性克隆按有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，同時(shí)用ci-ELISA進(jìn)行第三次篩選，步驟如下：以0.025 μg/ mL SPZ-BSA包被過夜，37℃封閉酶標(biāo)板。取陽(yáng)性細(xì)胞上清2 μL用1 mL抗體稀釋液稀釋，稱取一定量SPZ用PBS稀釋成1000、500 、0 ng/mL的SPZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，在反應(yīng)孔中依次加入不同濃度SPZ標(biāo)準(zhǔn)溶液和稀釋的細(xì)胞上清各50 μL，其余操作同間接ELISA，得到各反應(yīng)孔OD450值并計(jì)算抑制率。將篩選出的抑制率高的細(xì)胞株按有限稀釋法繼續(xù)進(jìn)行亞克隆，經(jīng)多次亞克隆，待細(xì)胞上清陽(yáng)性率為100%時(shí)，建株并對(duì)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，液氮保存。

1.3.5 腹水單克隆抗體的制備 取8周齡BALB/c雌性小鼠提前3周腹腔注射石蠟油，每周1次，0.5 mL/只。將擴(kuò)大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞用葡萄糖生理鹽水重懸，于第4周腹腔接種小鼠，約106個(gè)細(xì)胞/只。接種后每天觀察小鼠狀態(tài)，約10 d后可觀察到小鼠精神萎靡，腹部膨大。待小鼠瀕死不動(dòng)時(shí)用針頭收集腹水，離心取上清，－70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單抗型及亞型鑒定用SouthernBiotech亞型鑒定試劑盒鑒定腹水單抗亞型。按試劑盒說明書操作。

1.5 單抗（MAb）特性分析

1.5.1 MAb的IC50的確定 首先用棋盤法篩選出最適包被原濃度（0.01 μg/mL）和抗體稀釋倍數(shù)大致范圍，進(jìn)一步用間接ELISA確定抗體稀釋倍數(shù)，在此基礎(chǔ)上建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（ci-ELISA）。具體步驟：用SPZ-BSA 0.01 μg/mL包被酶標(biāo)板，4℃包被過夜，37℃封閉。用PBS稀釋SPZ標(biāo)準(zhǔn)品，濃度依次為4000、2000、1000、500、200、100、20、0 ng/mL，取上述液體各50 μL，加最適濃度的單抗50 μL，其余步驟同1.3.3。同樣濃度做3個(gè)重復(fù)，取平均值繪制曲線，計(jì)算SPZ半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50。

1.5.2 MAb特異性分析 用ci-ELISA的方法檢測(cè)MAb與其他磺胺藥物的交叉反應(yīng)。稱取一定量的磺胺氯吡嗪鈉（SPZ）、磺胺嘧啶鈉（SD）、磺胺對(duì)甲氧基嘧啶鈉（SMDZ）、磺胺氯噠嗪鈉（SCP）、磺胺甲氧噠嗪鈉（SMX）和磺胺二甲嘧啶鈉（SM2），用PBS稀釋成不同濃度的溶液，進(jìn)行ci-ELISA測(cè)試。根據(jù)擬合線性曲線方程，計(jì)算各藥物IC50，然后計(jì)算藥物交叉反應(yīng)率（CR）。

交叉反應(yīng)率= （產(chǎn)生50%抑制時(shí)SPZ的濃度/產(chǎn)生50%抑制時(shí)其他藥物的濃度）×100%。

2 結(jié)果

2.1 人工抗原紫外掃描將SPZ-OVA、SPZ和OVA溶液進(jìn)行紫外掃描。SPZ 在256 nm和330 nm處有兩個(gè)吸收峰，OVA在278 nm處有吸收峰，偶聯(lián)物除256 nm和330 nm兩處吸收峰外，在380～400 nm有吸收峰，為新生成的偶氮基團(tuán)的吸收峰，初步證明藥物偶聯(lián)成功。

2.2 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選結(jié)果細(xì)胞融合后，從陽(yáng)性克隆中挑選出分泌抗體僅針對(duì)SPZ-BSA且OD值高的11株雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行2～4次亞克隆，用ci-ELISA進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制篩選，從中篩選抑制率高的5株細(xì)胞（表1）。對(duì)其多次傳代并檢測(cè)，得到3株穩(wěn)定分泌SPZ抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別為F7C10、F10D9和E11C8。將這3株細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)腹腔接種小鼠，收集腹水。對(duì)腹水單抗檢測(cè)，挑選出高特異性的抗體F10D9，簡(jiǎn)稱D9，來(lái)進(jìn)行抗體特性的鑒定。

2.3 MAb亞類分型腹水單抗MAb D9能和羊抗鼠IgM-HRP結(jié)合顯色，所以MAb類型為IgM，輕鏈類型為κ（表2）。

2.4 MAb特性鑒定

2.4.1 MAb IC50的確定

2.4.1.1 MAb最佳稀釋倍數(shù)確定 在最佳包被原濃度下，將腹水單抗梯度稀釋，用間接ELISA確定單抗最佳工作濃度。當(dāng)包被原的濃度為0.01 μg/mL時(shí)，對(duì)應(yīng)的MAb D9工作濃度為1:4×105。

2.4.1.2 ci-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在最佳包被原濃度（0.01 μg/mL）和抗體工作濃度（1:4×105）的基礎(chǔ)上建立ci-ELISA，對(duì)系列濃度稀釋的SPZ用 ci-ELISA進(jìn)行測(cè)定，以SPZ空白對(duì)照孔OD450值為B0，不同濃度的SPZ競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)孔OD450值為B，以B/B0值為縱坐標(biāo)，SPZ質(zhì)量濃度（ng/mL）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。SPZ在20～4000 ng/mL范圍內(nèi)，B/B0值與SPZ濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系，方程為y=-0.3369x+1.347，R2=0.994， IC50=326 ng/ mL。

2.4.2 MAb特異性鑒定 MAb D9與磺胺甲氧噠嗪（SMX）無(wú)交叉反應(yīng)（CR＜0.01%），而與其余供試藥品有較弱交叉反應(yīng)（CR＜10%）（表3）。

3 討論

磺胺類藥物具有抗菌譜廣、價(jià)格低廉、使用方便等特點(diǎn)，因而在畜禽生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，而藥物的不規(guī)范使用或過量使用會(huì)造成動(dòng)物性食品中藥物殘留，引起系列人類健康問題，如產(chǎn)生耐藥性、過敏或毒性反應(yīng)[12]。因此，食源性產(chǎn)品中磺胺藥物殘留的檢測(cè)具有必要性。

目前檢測(cè)磺胺氯吡嗪鈉主要采用儀器聯(lián)用技術(shù)，如液質(zhì)聯(lián)用LC-MS/MS、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法、薄層色譜分析法等，靈敏度可滿足檢測(cè)要求，其中LC-MC 的最低檢測(cè)限（LOD）可達(dá)到650 ng/ kg[12]。與理化分析技術(shù)相比免疫學(xué)檢測(cè)具有高靈敏度和易操作的特點(diǎn)，在藥物殘留檢測(cè)方面具有廣闊應(yīng)用前景。本研究以制備的單抗McAb D9 建立的ELISA方法，線性范圍在20～4000 ng/mL之間。盡管我國(guó)對(duì)磺胺氯吡嗪鈉最大殘留限量沒有具體規(guī)定，但明確規(guī)定磺胺類藥總殘留最大殘留限量為0.1 mg/kg (相當(dāng)于100 ng/mL)。因而，本研究建立的ELISA對(duì)于磺胺氯吡嗪鈉超標(biāo)殘留陽(yáng)性樣本可進(jìn)行有效檢測(cè)，但靈敏度有待提高，可用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(CLIA）建立更高靈敏度的檢測(cè)方法[13]。

藥物小分子沒有免疫原性，SPZ通過和載體蛋白偶聯(lián)形成完全抗原，才能激發(fā)宿主產(chǎn)生相應(yīng)抗體。本研究制備的SPZ-OVA免疫小鼠后，小鼠可產(chǎn)生特異性抗體，其效價(jià)可達(dá)到1:6.4×104，證明合成的人工抗原具有良好的免疫原性。McAb D9對(duì)SPZ IC50值為326 ng/mL，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的SPZ單克隆抗體的IC50類似。由McAb D9的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)可知，所制備的抗體對(duì)SPZ的特異性比較強(qiáng)，與其他磺胺藥有較弱或無(wú)交叉反應(yīng)。本研究對(duì)磺胺母核的氨基用重氮化方法以-N=N-與OVA相聯(lián)，因氨基可能是磺胺母核的重要抗原表位，以SPZ的氨基為偶聯(lián)基團(tuán)的抗原制備的抗體，因失去重要表位而對(duì)具有磺胺母核的其他磺胺藥幾乎沒有交叉反應(yīng)，也可能因?yàn)镾PZ以磺胺母核端與蛋白載體相連，不能在抗原分子表面突出磺胺母核而被免疫活性細(xì)胞最大限度地識(shí)別所致。為此，若研制檢測(cè)磺胺類藥的試劑盒，可考慮以磺胺母核為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)半抗原，并設(shè)法突出于抗原表面，研制類特異性抗體，這種研究思路已有研究表明是可行的[15]。

本研究采用有限稀釋法[16]進(jìn)行融合細(xì)胞的亞克隆化，即將待克隆的細(xì)胞團(tuán)在顯微鏡下標(biāo)記，用移液槍將細(xì)胞吸出，置于96孔細(xì)胞板中稀釋，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，選取細(xì)胞數(shù)約為100個(gè)/孔，將該孔細(xì)胞加至10 mL培養(yǎng)基中，充分混勻后加至鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。采用這種方法單克隆率比較高，同時(shí)縮短了亞克隆的周期，簡(jiǎn)單有效。本研究通過對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選后得到的單克隆抗體的效價(jià)和特異性對(duì)比免疫血清多抗都有了很大提高。

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GENERATION OF A MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST SULFACHLOROPYRAZINE SODIUM

ZHANG Meng1, LIU Ying-chun1, JIANG Wei1, CHEN Yong-jun1, ZHANG Hua-jing1, XUE Jun-xin1,2, GONG Feng-ju1,2, ZENG Peng1,2, WANG Min-yan1, WANG Quan1
(1.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this study, sulfachloropyrazine sodium (SPZ) was conjugated with ovalbumin (OVA) for preparation of immune antigen through diazotization method. The artif cial antigen (SPZ-OVA) was used to immunize BALB/c mice. After fourth immunization, mouse serum samples were collected and antibodies were titrated to be 1:6.4×104in indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The mouse with higher titer was sacrif ced and spleen was collected for hybridoma production. The hybridoma cells were screened for antibody production in ELISA. One positive hybridomas D9 was obtained and subcloned by limited dilution. A stable antibody-producing clone was then identif ed and propagated. The mouse ascites containing monoclonal antibodies were produced and tested for ELISA titer and half inhibition concentration (IC50). As a fact, the MAb D9 had ELISA titer at 1:4×105and half inhibition concentration (IC50) at 326 ng/mL.

Sulfachloropyrazine sodium; monoclonal antibody; indirect competitive ELISA

S859.795

A

1674-6422（2015）03-0036-06

2015-03-23

上海市技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)專項(xiàng) (13DZ0502701)

張夢(mèng)，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

王權(quán)，E-mail：wangquan@shvri.ac.cn