朱軍莉，趙 進，朱雅霏

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310018；2.中國計量學院生命科學學院，浙江杭州310018；3.浙江蔡小珍農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，浙江建德311600）

自然發(fā)酵蔬菜制品中降解亞硝酸鹽乳酸菌的分離與鑒定

朱軍莉1，趙 進2*，朱雅霏3

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310018；2.中國計量學院生命科學學院，浙江杭州310018；3.浙江蔡小珍農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，浙江建德311600）

以自然發(fā)酵蔬菜為原料，采用平板計數(shù)和鈣溶圈法分離純化菌株，并分析菌株的亞硝酸鹽降解能力。結(jié)果表明，鈣溶圈法分離的產(chǎn)酸能力較強的9株細菌，經(jīng)生理生化鑒定均為乳酸菌。乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中都具有亞硝酸鹽分解能力，其中H12、L7和X1三株乳酸菌亞硝酸鹽降解率高于89%，且降解速度較快，其中X1降解亞硝酸活性最強。乳酸菌X1還表現(xiàn)良好的產(chǎn)酸能力和耐鹽性，經(jīng)16S rDNA鑒定為植物乳桿菌(Lactobcillus plantarum)。

乳酸菌；亞硝酸鹽降解；分離；鑒定

泡菜是以白菜、甘藍、蘿卜等為原料，經(jīng)洗滌、切分處理后，加入一定濃度的食鹽溶液，再經(jīng)乳酸發(fā)酵等制成的一種傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵蔬菜制品。泡菜質(zhì)地脆嫩，形態(tài)飽滿，酸咸適度，清脆爽口，營養(yǎng)豐富，其富含維生素和鈣磷等無機物及乳酸菌活菌對提高健康水平有著積極作用。目前，泡菜制作大都采用自然發(fā)酵法，其缺點是發(fā)酵周期長，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，雜菌污染嚴重，亞硝酸鹽含量超標等。

大量研究證實，泡菜在腌制發(fā)酵過程中形成亞硝酸鹽，其含量超標是一直困擾著蔬菜腌制廠家的難題，也是成為制約泡菜發(fā)展的重要因素之一。具有硝酸還原能力的微生物污染是蔬菜在發(fā)酵過程中產(chǎn)生亞硝酸鹽的根本原因。在腌制和發(fā)酵初期，污染細菌中分泌的硝酸還原酶將蔬菜中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[1]。亞硝酸鹽在酸性條件下，即可形成N-亞硝酸胺類化合物，該類物質(zhì)具有強致癌性[2]。我國食品衛(wèi)生法規(guī)定了腌制品中亞硝酸含量＜30 mg/kg，世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）也規(guī)定亞硝酸的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）值為0.4 mg/kg。

人工接種乳酸菌發(fā)酵泡菜是一種發(fā)酵技術現(xiàn)代化的趨勢，具有縮短生產(chǎn)周期，改善泡菜品質(zhì)，有效抑制雜菌，降低亞硝酸鹽含量的優(yōu)點[3]。研究表明，乳酸菌對亞硝酸鹽具有降解轉(zhuǎn)化能力[3-8]，但是存在菌種及菌株間的差異[9]，因此篩選降亞硝酸能力較好、適合泡菜發(fā)酵的乳酸菌菌種具有重要意義。本研究從自然發(fā)酵的泡菜中篩選和分離乳酸菌，并獲得能有效分解亞硝酸鹽的菌株，為進一步研制泡菜發(fā)酵菌種乳酸菌劑和初步應用奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬黃瓜、腌蘿卜、醬黃花菜、榨菜：購于杭州翠苑一區(qū)菜市場；雪菜樣品：浙江蔡小珍農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。

MRS液體和固體培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術有限公司；生化發(fā)酵管：杭州微生物試劑有限公司；16S rDNA的PCR擴增引物合成和測序均在上海生物工程技術有限公司；亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BI-150A低溫生化培養(yǎng)箱：施都凱儀器設備有限公司；SW-CJ-2D FRESCO 17微量臺式離心機：美國賽默飛世爾科技有限公司；UV-1800型分光光度計：日本島津公司；FE20型pH計：梅特勒-托利多上海有限公司；SW-CJ-2D凈化工作臺：蘇州凈化有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌計數(shù)

無菌條件下各取25 g樣品于225 mL無菌生理鹽水中拍打稀釋，為1∶10稀釋液，并用無菌水制備不同的稀釋度樣品，選取適當?shù)南♂尪?，吸? mL在無菌平板上，用MRS瓊脂傾注法混勻，30℃厭氧培養(yǎng)48h，按照國標GB4789.35—2010《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中的方法計數(shù)。

1.3.2 乳酸菌的分離

同上選取適宜的稀釋度，用含2%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基傾注平板，于30℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取有明顯溶鈣圈的菌落，在MRS平板上劃線純化，經(jīng)革蘭氏染色和接觸酶反應，篩選出革蘭氏陽性、接觸酶陰性菌株，劃線在MRS斜面培養(yǎng)基，于4℃條件下保藏。

1.3.3 乳酸菌的生理生化鑒定

取過夜培養(yǎng)的分離株接種在明膠、吲哚、硫化氫、山梨醇、木糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖、七葉苷及淀粉微量生化發(fā)酵管中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。參照《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應的指標進行比對。

1.3.4 亞硝酸鹽含量的測定

亞硝酸鹽含量的測定按照國標GB 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法，根據(jù)不同質(zhì)量濃度的標準NaNO2溶液中分別加入2 mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，放置3～5 min，加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，于波長538 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線。根據(jù)亞硝酸鈉標準曲線回歸方程，計算樣品中亞硝酸鹽含量。

1.3.5 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

初篩：將乳酸菌9個菌株按體積分數(shù)為2%的接種量接種于10 mL含亞硝酸鈉125 mg/L，pH值為6.4的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于30℃培養(yǎng)48 h，以含NaNO2不接種培養(yǎng)基為對照，測定亞硝酸鹽降解率。

復篩：在含NaNO2（125 mg/L）的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株H22、L7和X1，每隔12 h測定亞硝酸鹽降解率。同時，將H22、L7和X1培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液離心取上清液，在上清液中添加NaNO2至125mg/L，混合液置于30℃培養(yǎng)箱中，每隔12h測定亞硝酸鹽含量，以滅菌未培養(yǎng)的MRS中添加NaNO2為對照。亞硝酸鹽降解率計算公式：

1.3.6 菌株生長曲線和產(chǎn)酸特性測定

將乳酸菌菌株X1按體積分數(shù)為2%的接種量接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，每隔2 h按照比濁法于波長600 nm處測定細菌細胞生長量，并測定pH值。以培養(yǎng)時間為橫坐標，對應的吸光度值、pH值為縱坐標繪制菌株X1生長曲線和產(chǎn)酸特性曲線。

1.3.7 16S rDNA鑒定

細菌基因組DNA的抽提，參考朱軍莉等[11]的方法提取。以抽提X1細菌DNA組作為聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增的模板，16S rDNA PCR擴增的通用引物為引物。PCR產(chǎn)物電泳分析及純化后測序。測序得到的序列通過http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上的基本本地隊列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）在GenBank基因庫進行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)酵樣品的乳酸菌數(shù)分析

5種常見自然發(fā)酵泡菜樣品中的乳酸菌總數(shù)如圖1所示。由圖1可知，腌蘿卜和黃花菜樣品中乳酸菌落數(shù)較多，菌落總數(shù)對數(shù)值分別為5.48和5.59，而榨菜中菌落總數(shù)次之，對數(shù)值為4.97，而雪菜和醬黃瓜中菌落總數(shù)較少，對數(shù)值為3.32和2.98。5種自然發(fā)酵樣品中乳酸菌數(shù)存在明顯差異，其中腌蘿卜和黃花菜中乳酸菌含量較高，可能與原料的品種、樣品發(fā)酵階段、貯藏時間均有關系。

2.2 乳酸菌的分離與生理生化鑒定

采用溶鈣圈法，將稀釋樣品在含CaCO3的MRS平板上計數(shù)，培養(yǎng)72h，挑取溶解圈較大、圓形、乳白色、濕潤的45個菌落。經(jīng)革蘭氏染色和接觸酶實驗，初步篩選得到9株菌株，進行生化鑒定，結(jié)果見表1。由表1可知，9株乳酸菌均呈革蘭氏陽性、桿狀，接觸酶陰性，吲哚實驗陰性，不產(chǎn)硫化氫，發(fā)酵木糖、果糖、甘露醇、乳糖、七葉苷，大部分能發(fā)酵山梨醇、葡萄糖、阿拉拍糖、蔗糖和淀粉，其與乳酸菌的特征較一致。

2.3 降解亞硝酸鹽乳酸菌的初篩

將篩選的9株菌按2%接種量接入含125 mg/kg的亞硝酸鹽MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后檢測亞硝酸鹽的含量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，9株乳酸菌均具有分解亞硝酸的能力，其中H12、L7和X1顯示分解亞硝酸鹽的效果較好，降解率達到88%以上。而H11和H22分解能力次之，為73%～82%，H1和L17亞硝酸鹽分解率為62%～64%，H10和L8分解率較低為32%～48%。選擇降解亞硝酸鹽能力強的菌株H12、L7和X1進行復篩。

2.4 降解亞硝酸鹽乳酸菌的復篩

菌株H12、L7和X1降解亞硝酸鹽的復篩結(jié)果見圖3。由圖3a可知，H12、L7和X1降解亞硝酸鹽速度較快，經(jīng)過36 h的培養(yǎng)，亞硝酸鹽降解率達到80%以上，72 h亞硝酸鹽降解率分別為89.2%、90.7%和95.6%，其中X1表現(xiàn)最強的降解亞硝酸能力，且降解速度較快。上清液分解亞硝酸鹽的能力結(jié)果見圖3b。由圖3b可知，上清液中亞硝酸的分解率明顯低于共培養(yǎng)條件，在處理24 h后降解速度緩慢，經(jīng)72 h處理后H12、L7和X1上清液中亞硝酸鹽的降解率分別為44.2%，42.7%和50.7%，表明上清液也具有亞硝酸鹽降解作用。

研究表明，乳酸菌對亞硝酸鹽的降解作用有酶降和酸降兩種方式，在pH值＞4.5時乳酸菌對亞硝酸的降解以亞硝酸鹽還原酶作用為主[2]，可能是pH≤4.5能夠抑制該酶的活性。而發(fā)酵后期較低的pH能夠快速降解亞硝酸鹽[7]。研究表明，植物乳酸菌能分泌亞硝酸還原酶，應碧等[12-13]分析了亞硝酸鹽還原酶的相關基因及酶學特點。復篩結(jié)果表明，X1表現(xiàn)很強的亞硝酸鹽降解能力，其速度很快。發(fā)酵后上清液也具有亞硝酸鹽分解作用，表明亞硝酸鹽的降解是酶催化和有機酸分解共同作用的結(jié)果。

2.5 乳酸菌X1產(chǎn)酸能力

菌株X1生長曲線和產(chǎn)酸特性曲線見圖4。由圖4可知，菌株X1菌株在4 h開始進入對數(shù)生長期，在18 h進入生長穩(wěn)定期。菌液的pH值隨著菌株的生長逐步下降，其產(chǎn)酸速率和菌體的生長速度成正相關趨勢，進入穩(wěn)定期后，溶液中的pH值也趨向于平穩(wěn)，最低pH值為3.85。結(jié)果表明，該菌有較強的產(chǎn)酸能力，培養(yǎng)24 h后低pH可能參與亞硝酸鹽的降解。

2.6 16SrDNA鑒定

抽提對數(shù)生長末期菌株X1的DNA，以乳酸菌16SrDNA通用引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，獲得了特異的、大小約為1.5 kb的擴增條帶。獲得特異片段經(jīng)純化和測序后，通過BLAST與GenBank核酸序列庫中的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)X1與植物乳桿菌的相似性都超過99%。結(jié)合生理生化的鑒定結(jié)果，X1鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。杜曉華等[5]也報道從四川泡菜中分離降解亞硝酸鹽是植物乳桿菌，韓新峰等[14]也發(fā)現(xiàn)植物乳酸菌純種半固體發(fā)酵制作泡菜亞硝酸鹽含量較低，且品質(zhì)優(yōu)于純種液態(tài)發(fā)酵和自然發(fā)酵泡菜。李欣等[15]從大慶自然發(fā)酵酸菜中分離的14株耐酸乳酸菌中5株為植物乳桿菌。

3 結(jié)論

本研究對傳統(tǒng)5種泡菜乳酸菌計數(shù)，并從45株乳酸菌中篩選出9株具有較大溶鈣圈的菌株。生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)9個分離株均為乳酸菌，并具有亞硝酸鹽降解活性，其中X1、H12和L7在MRS培養(yǎng)基中降解亞硝酸鹽活性高于89%，而3株菌48 h發(fā)酵后上清液也具有亞硝酸鹽分解作用，表明乳酸菌降解亞硝酸鹽是酶解和酸解共同參與。乳酸菌X1具有良好的產(chǎn)酸能力，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），此研究為發(fā)酵泡菜優(yōu)良乳酸菌菌種的篩選和應用奠定了良好基礎。

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Isolation and identification of nitrite-degrading lactic acid bacteria from natural fermented vegetable

ZHU Junli1,ZHAO Jin2*,ZHU Yafei3
(1.College of Food Science and Biotechnology Engineering,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310038,China; 2.College of Life Science,China Jiliang University,Hangzhou 310018,China; 3.Zhejiang Caixiaozhen Agricultural Development Company,Jiande 311600,China)

Bacteria with high nitrite degradation ability were isolated from natural fermented vegetable by plate count method and calcium dissolved ring method.Nine strains with strong acid production ability were screened and identified as lactic acid bacteria by physiological and biochemical identification.The nitrite degradation ability in MRS liquid medium differed among nine strains,strain H12,L7 and X1 exhibited rapid nitrite degradation rate of higher than 89%.Strain X1 showed the strongest ability for nitrite degradation,and it also showed strong ability of acid production and salt resistance,which was identified asLactobcillus plantarumby 16S rDNA sequencing.

lactic acid bacteria;nitrite degeneration;isolation;identification

TS255.54

A

0254-5071（2015）06-0039-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.009

2015-05-20

杭州市科技局項目（30130432B104）

朱軍莉（1979-），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物。

*通訊作者：趙進（1977-），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。