陳 泉，吳遠(yuǎn)征，扈進(jìn)冬，王貽蓮，趙曉燕，趙吉興，李 耀，李紀(jì)順

（1.山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東濟(jì)南250014；2.山東中惠生物科技股份有限公司，山東惠民251706）

高產(chǎn)Monacolin K紅曲霉菌種的篩選及液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

陳 泉1，吳遠(yuǎn)征1，扈進(jìn)冬1，王貽蓮1，趙曉燕1，趙吉興2，李 耀2，李紀(jì)順1*

（1.山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東濟(jì)南250014；2.山東中惠生物科技股份有限公司，山東惠民251706）

為了提高紅曲霉（Monascus）液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K的能力，一種新型的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)被應(yīng)用于產(chǎn)Monacolin K紅曲霉菌株的誘變選育工作；同時，通過構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）平板對峙培養(yǎng)的篩選方法，選育獲得較初始紅曲霉菌Monacolin K產(chǎn)量提高60%以上的突變菌株MP60-6。確定發(fā)酵培養(yǎng)基組成為甘油5%，米粉50 g/L，蛋白胨15 g/L，NaNO32 g/L，MgSO41 g/L，ZnSO42 g/L，KH2PO41.5 g/L，并進(jìn)一步確定在發(fā)酵第3、第4天添加0.1%的乙酸和0.2%的檸檬酸，發(fā)酵第8天補加10%的甘油。在上述條件下發(fā)酵17 d后Monacolin K產(chǎn)量可以達(dá)到1 302 mg/L，為出發(fā)菌株產(chǎn)量的2.66倍。

Monacolin K；紅曲霉；誘變；液態(tài)發(fā)酵

Monacolin K是最早由日本學(xué)者遠(yuǎn)騰章在紅色紅曲霉中發(fā)現(xiàn)的一種膽固醇合成抑制劑[1]，其商品名為洛伐他汀（Lovastatin），是一種新型的調(diào)整血脂藥，深受廣大患者的歡迎。Monacolin K具有酸型和內(nèi)酯型兩種存在形式，研究發(fā)現(xiàn)，真正起降脂作用的是酸型Monacolin K。內(nèi)酯型的Monacolin K本身無活性，需要人體內(nèi)羥基水解酶水解后才能發(fā)揮降脂功效，從而增加肝腎負(fù)擔(dān)。天然發(fā)酵的紅曲霉產(chǎn)生的主要是酸型洛伐他汀，并且其發(fā)酵產(chǎn)物中除了含有Monacolin K之外，還有一系列Monacolin結(jié)構(gòu)類似物、不飽和脂肪酸等生理活性物質(zhì)存在，不僅具有協(xié)同調(diào)節(jié)血脂的功效，而且極大地降低了純品Monacolin K的副作用[2-3]。因此，以紅曲霉開發(fā)的保健食品、藥品在國內(nèi)、國際市場上都非常受歡迎。

目前紅曲霉生產(chǎn)洛伐他汀主要采用固態(tài)發(fā)酵的方式。固態(tài)發(fā)酵具有生產(chǎn)過程簡單、投資少、產(chǎn)量高、后處理簡單等優(yōu)點，但固態(tài)發(fā)酵周期較液態(tài)發(fā)酵長、條件不易控制、容易染菌等。在工業(yè)化固態(tài)發(fā)酵時，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對其產(chǎn)量和品質(zhì)的影響很大，獲得的產(chǎn)品品質(zhì)參差不齊，已逐漸失去市場競爭力。液態(tài)發(fā)酵法具有規(guī)模大，自動化程度高，人力成本低，生產(chǎn)過程易控制等顯著優(yōu)點[4-5]。但是，由于受到產(chǎn)量和生產(chǎn)成本的限制，液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K的研究一直停留在實驗室水平，沒有形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模[6]。因此，提高紅曲霉液體發(fā)酵產(chǎn)生Monacolin K的產(chǎn)量成為目前亟待解決的問題。

優(yōu)良菌種的選育是提高紅曲霉中Monacolin K產(chǎn)量的一個較為切實可行的方法。在紅曲霉菌株誘變中常用的方法包括紫外誘變、氯化鋰誘變、超高壓誘變、亞硝酸和硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）誘變以及多種方法聯(lián)用的復(fù)合誘變[7-10]。隨著誘變技術(shù)的進(jìn)步，很多新興的誘變方法也被逐漸用于紅曲霉菌株的選育，比如離子束誘變[11]、激光誘變和空間誘變等[12-13]。

另外，改良紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，尤其是研究發(fā)酵工藝中作為添加劑的碳源、氮源、無機鹽等因素對紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K的影響，也是目前研究的重點和熱點。目前已報道的可有效促進(jìn)紅曲霉合成洛伐他汀的添加劑包括：碳源有甘油、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、乙醇、乙酸；氮源有蛋白胨、玉米漿、大豆粉、NaNO3；無機鹽有MgSO4、ZnSO4[14-17]。

篩選適用于液態(tài)發(fā)酵的紅曲霉Monacolin K高產(chǎn)菌株并優(yōu)化其發(fā)酵條件，是解決當(dāng)前Monacolin K液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量不高的最直接也是最行之有效的方法，對于國內(nèi)紅曲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有一定的推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）ZH01：山東中惠食品有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：米粉30 g，葡萄糖20 g，NaNO32 g，蛋白胨15g，MgSO4·7H2O 1g，KH2PO41.5g，加水至1000mL，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：米粉50 g，甘油50 mL，NaNO32 g，蛋白胨15 g，MgSO4·7H2O 1 g，ZnSO42 g，KH2PO41.5 g，加水至1 000 mL，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加水至1 000 mL，pH自然。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖、乳糖、木糖、蔗糖、甘油、蛋白胨、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、ZnSO4、CaCl2、NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，大豆蛋白粉、酵母粉、豆粕粉和牛肉膏等均為生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種系統(tǒng)：無錫思源清生物科技有限公司；Agilent 1260 Infinity四元液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；HZQ-Q全溫振蕩器、HPS-250生化培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾有限公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 液體培養(yǎng)方法

從PDA平板上刮取紅曲霉菌落接種到種子培養(yǎng)基中，30℃條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d，按照15%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃條件下培養(yǎng)14～21 d。

1.3.2 紅曲霉誘變方法

（1）單孢子懸液的制備

以生理鹽水將孢子從平板或斜面上洗下，制得孢子懸液，接種到小米培養(yǎng)基（8 g小米+10 mL水）中，培養(yǎng)48 h左右，加入生理鹽水制得菌懸液以無菌紗布過濾，以玻璃珠振蕩打散至單孢子懸液，備用。

（2）ARTP等離子流誘變

以時間為可變參數(shù)，功率和氣量為固定參數(shù)（功率為100 W，氣量為10 L/min）。首先，打開紫外燈對操作倉消毒30 min。同時，在超凈臺中取待誘變孢子懸液10 μL均勻涂于載片上，打開無菌風(fēng)吹干；將裝有樣品載片的平板移至ARTP操作倉，用無菌鑷子將載片放于對應(yīng)孔位，調(diào)節(jié)載臺下方旋鈕，使載片位于氣流出口2 mm處，并關(guān)閉倉門；設(shè)置處理時間，點擊“開始”按鈕處理樣品；樣品處理完畢，用無菌鑷子將載片放入裝有1 mL生理鹽水的離心管中，將離心管振蕩1 min洗脫載片上的菌液；對得到的菌懸液適當(dāng)稀釋后涂布PDA平板，28℃培養(yǎng)72 h。

1.3.3 洛伐他汀高產(chǎn)紅曲霉菌株的初篩

構(gòu)巢曲霉對峙培養(yǎng)法：使用平皿打孔器移取相同大小的待篩選紅曲霉菌落接種到PDA平板的一側(cè)，28℃培養(yǎng)5 d后，在平板另一側(cè)對應(yīng)位置接種相同大小的構(gòu)巢曲霉菌落，將平板放于26℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜置培養(yǎng)7 d后，測量構(gòu)巢曲霉的菌落直徑。

1.3.4 洛伐他汀的檢測方法

發(fā)酵液樣品處理：取250 μL發(fā)酵液與750 μL甲醇一起加到1.5mL的離心管中，超聲波振蕩處理60min，經(jīng)0.22μm的薄膜過濾后，樣品中的洛伐他汀含量進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定。

HPLC檢測條件：色譜柱250 mm×4.6 mm C18柱；紫外檢測器；檢測波長238 nm；流動相：甲醇∶水∶磷酸=385∶115∶0.14（V/V）；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 對峙培養(yǎng)實驗中構(gòu)巢曲霉菌落直徑與紅曲霉合成洛伐他汀能力的關(guān)系

紅曲霉產(chǎn)生的洛伐他汀對構(gòu)巢曲霉的生長具有一定的抑制作用。因此，將紅曲霉與構(gòu)巢曲霉進(jìn)行對峙培養(yǎng)，從理論上來說，紅曲霉合成Monacolin K的能力越強，其對應(yīng)的構(gòu)巢曲霉的菌落直徑就越小。為了驗證這一推論，隨機挑取ARTP等離子體誘變得到的誘變株與構(gòu)巢曲霉進(jìn)行對峙培養(yǎng)，同時將這些誘變株進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)14 d，利用HPLC檢測其Monacolin K的產(chǎn)量，從而分析在對峙培養(yǎng)實驗中構(gòu)巢曲霉菌落直徑與紅曲霉合成Monacolin K能力的關(guān)系，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著構(gòu)巢曲霉菌落直徑的增大，其對應(yīng)紅曲霉Monacolin K的產(chǎn)量出現(xiàn)逐漸減少的趨勢。因此，構(gòu)巢曲霉的菌落直徑可以作為衡量對峙培養(yǎng)的紅曲霉合成Monacolin K能力的一個指標(biāo)。采用構(gòu)巢曲霉對峙培養(yǎng)實驗對產(chǎn)MonacolinK紅曲霉進(jìn)行初篩具有通量高，準(zhǔn)確性相對較高的優(yōu)點。

2.2 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

通過構(gòu)巢曲霉對峙培養(yǎng)初篩以及液體搖瓶培養(yǎng)后HPLC檢測復(fù)篩，共得到4株（MP60-3、MP60-6、MP45-1、MP45-11）Monacolin K產(chǎn)量較出發(fā)菌株有明顯提高的誘變株。相對于出發(fā)菌株489.34 mg/L的Monacolin K產(chǎn)量，篩選得到的這4株菌Monacolin K的產(chǎn)量提高了1.4～1.7倍不等。為了驗證得到的4株菌產(chǎn)生Monacolin K的遺傳穩(wěn)定性，將這4株紅曲霉菌株傳代5代，分別檢測其洛伐他汀產(chǎn)量的變化，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，MP60-3、MP45-1和MP45-11的Monacolin K產(chǎn)量從第3代開始迅速下降，經(jīng)五代培養(yǎng)后其產(chǎn)量都有大幅減低，不具有工業(yè)化大生產(chǎn)的優(yōu)越性。菌株MP60-6的Monacolin K產(chǎn)量較穩(wěn)定，說明其遺傳性狀穩(wěn)定，具有應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)的潛力，成為進(jìn)一步的研究對象。

2.3 最佳碳源的選擇

碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基中最重要的成分之一，對微生物生長代謝的作用主要為提供細(xì)胞的碳架，提供細(xì)胞生命活動所需的能量，提供合成產(chǎn)物的碳架。紅曲霉的液體發(fā)酵一般需要速效碳源和遲效碳源兩種。培養(yǎng)基中的速效碳源在發(fā)酵的前期，對紅曲霉的快速生長繁殖有最直接的影響。為確定紅曲霉MP60-6生產(chǎn)Monacolin K的最佳速效碳源，比較了其分別利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油和木糖，初始濃度均為5%發(fā)酵Monacolin K的產(chǎn)量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在選定的5種速效碳源中，甘油為速效碳源時發(fā)酵液Monacolin K最高可達(dá)1 011 mg/L，明顯優(yōu)于其他速效碳源。此外甘油來源豐富、組成簡單、價格便宜，故選定甘油為最佳速效碳源，而其遲效碳源通常都是使用大米粉，其有利于紅曲霉生長后期次級代謝產(chǎn)物的形成。故采用5%甘油+50 g/L米粉作為紅曲霉發(fā)酵的初始碳源。

2.4 最佳氮源的選擇

氮源是構(gòu)成菌體細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的主要成分，也是合成各種含氮代謝產(chǎn)物的重要原料，對微生物的生長和目標(biāo)產(chǎn)物的積累有重要的影響。培養(yǎng)基中使用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。在培養(yǎng)基中合理地加入不同氮源，有利于縮短紅曲霉生長時間，提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量。實驗比較的有機氮源包括酵母粉、大豆蛋白粉、牛肉膏、蛋白胨和豆粕粉，其初始濃度均為15g/L，無機氮源包括NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3和NaNO3，其初始濃度均為2g/L。不同氮源對紅曲霉MP60-6產(chǎn)Monacolin K的影響結(jié)果見圖3。

由圖3可知，有機氮源中蛋白胨發(fā)酵Monacolin K產(chǎn)量最高，無機氮源中NaNO3發(fā)酵Monacolin K產(chǎn)量最高。故發(fā)酵培養(yǎng)基中分別選用15 g/L蛋白胨和2 g/L NaNO3分別作為有機和無機氮源。

2.5 無機鹽對紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的影響

培養(yǎng)基中的無機鹽在微生物生長和代謝產(chǎn)物合成中也具有舉足輕重的作用。本實驗比較了不同質(zhì)量濃度（1 g/L、2 g/L、4 g/L）的MgSO4、ZnSO4和CaCl2對紅曲霉MP60-6產(chǎn)Monacolin K的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，MgSO4、ZnSO4在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對于紅曲霉MP60-6產(chǎn)生Monacolin K都具有一定的促進(jìn)作用，其中以MgSO4的促進(jìn)作用更為明顯，而CaCl2的作用則微乎其微。結(jié)果表明，MgSO4質(zhì)量濃度在1 g/L時對Monacolin K的產(chǎn)量提高效果最顯著，MgSO4質(zhì)量濃度＞1 g/L時Monacolin K的產(chǎn)量反而有所下降；同樣，ZnSO4質(zhì)量濃度在達(dá)到2 g/L時Monacolin K的產(chǎn)量達(dá)到最高。因此，選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1 g/L MgSO4和2 g/L ZnSO4。

2.6 添加乙酸和檸檬酸對紅曲霉產(chǎn)生Monacolin K的影響

大量文獻(xiàn)報道，在紅曲霉發(fā)酵過程中添加乙酸或檸檬酸有利于提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量[2，17-18]。在發(fā)酵開始的第3、第4天每天分兩次分別添加0.1%、0.2%和0.3%的乙酸或檸檬酸，然后比較其Monacolin K的產(chǎn)量，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，添加乙酸和檸檬酸都能夠從不同程度上促進(jìn)Monacolin K的產(chǎn)生，并且乙酸對紅曲霉MP60-6的促進(jìn)作用比檸檬酸更顯著。每次添加0.1%的乙酸和0.2%的檸檬酸能夠達(dá)到提高M(jìn)onacolin K的最佳效果。這種促進(jìn)作用的原因可能是：乙酸和檸檬酸都是紅曲霉代謝中產(chǎn)生乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）的直接前體物質(zhì)，而根據(jù)已知的Monacolin K的合成途徑，胞內(nèi)的乙酰CoA含量是決定Monacolin K產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。因此，在發(fā)酵過程的第3、第4天每天兩次添加0.1%乙酸和0.2%檸檬酸有利于胞內(nèi)乙酰CoA的積累，從而提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量。

2.7 甘油補加的時機對紅曲霉產(chǎn)生洛伐他汀的影響

按照1.3.1所述的培養(yǎng)條件，在初始碳源為50 g/L的米粉培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)的第2、5、8、10天向不同的搖瓶中補加10%的甘油，并定時取樣，檢測其Monacolin K合成的情況，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，第8天和第10天開始補加甘油的搖瓶中紅曲霉產(chǎn)生Monacolin K的產(chǎn)量明顯高于其他搖瓶的產(chǎn)量，并且以第8天補加的效果最佳。同時，第2天和第5天補加甘油Monacolin K的產(chǎn)量比不補加甘油的對照產(chǎn)量還要低。這說明作為次級代謝產(chǎn)物的Monacolin K是在菌體生長后期開始大量積累，前期生長過快反而不利于其產(chǎn)生；從Monacolin K的合成曲線上看，發(fā)酵中Monacolin K的大量積累集中在第12～17天，這一階段的積累速度呈指數(shù)增長。而從補加碳源上來看，在第8天補加甘油后，到了第12天Monacolin K才開始大量積累，這說明Monacolin K的積累需要一定的“準(zhǔn)備期”。因此，在發(fā)酵的第8天補加10%的甘油對于提高M(jìn)onacolin K產(chǎn)量效果最佳。

3 結(jié)論

利用ARTP等離子流誘變技術(shù)對紅曲霉ZH01進(jìn)行誘變處理，并建立構(gòu)巢曲霉對峙培養(yǎng)快速篩選方法，獲得4株Monacolin K產(chǎn)量顯著提高的紅曲霉菌株。經(jīng)遺傳穩(wěn)定性實驗分析后，最終選擇MP60-6作為生產(chǎn)菌株，該菌Monacolin K產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了60%以上。

該文考察了紅曲霉MP60-6發(fā)酵中碳源、氮源、無機鹽以及添加乙酸、檸檬酸和甘油等對其Monacolin K產(chǎn)量的影響，確定甘油為最佳速效碳源；蛋白胨和NaNO3分別為最佳有機和無機氮源；MgSO4和ZnSO4有利于促進(jìn)Monacolin K的產(chǎn)生，而CaCl2的影響不明顯；添加乙酸和檸檬酸都能提高M(jìn)onacolin K產(chǎn)量，最佳濃度添加量分別為0.1%和0.2%；Monacolin K在發(fā)酵后期開始大量積累，在發(fā)酵的第8天補加甘油能顯著提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量。經(jīng)過初步優(yōu)化培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件，紅曲霉MP60-6液態(tài)發(fā)酵Monacolin K的最終產(chǎn)量可達(dá)到1 302 mg/L，為出發(fā)菌株ZH01產(chǎn)量（489.3 mg/L）的2.66倍。

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Screening ofMonascuswith high Monacolin K yield and optimization of its liquid-state fermentation condition

CHEN Quan1,WU Yuanzheng1,HU Jindong1,WANG Yilian1,ZHAO Xiaoyan1,ZHAO Jixing2,LI Yao2,LI Jishun1*
(1.Shandong Provincial Key Laboratory for Applied Microorganism,Biotechnology Center of Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014,China;2.Shandong Zhonghui Biotechnology Co.,Ltd.,Huimin 251706,China)

In order to improve the production of Monacolin K byMonascus,a novel method based on the Atmospheric and Room Temperature Plasma(ARTP)was applied to screen theMonascusstrain with higher Monacolin K yield.A mutant strain MP60-6 was obtained through the screening method of plate confrontation culture ofAspergillus nidulans,and the yield of Monacolin K by MP60-6 was 60%higher than that of the initial strain. The optimal medium compositions were obtained as follows:glycerol 5%,rice powder 50 g/L,peptone 15 g/L,NaNO32 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L, ZnSO42 g/L,KH2PO41.5 g/L.And 0.1%acetate and 0.2%citrate were added at the 3thand 4thdays,10%glycerol was added at the 8thday in the liquid-state fermentation of MP60-6.After cultivation for 17 d under the optimized condition,the Monacolin K yield was 1 302 mg/L,which was 2.66 times of the original strain.

Monacolin K;Monascus;mutation;liquid-state fermentation

Q939.9

A

0254-5071（2015）06-0043-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.010

2015-05-04

山東省科學(xué)院青年基金項目資助（2013QN018）；山東省自主創(chuàng)新專項項目（2013CXC20605）

陳泉（1981-），男，助理研究員，博士，研究方向為微生物代謝。

*通訊作者：李紀(jì)順（1971-），男，高級工程師，本科，研究方向為應(yīng)用微生物。