周紅姿，李紀(jì)順，劉 新，吳遠(yuǎn)征，趙吉興，李 耀

（1.山東省科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東濟(jì)南250014；2.山東省科學(xué)院生物所，山東濟(jì)南250014；3.山東中惠生物科技股份有限公司，山東濱州251707)

紅曲霉菌體殘渣酶解條件優(yōu)化研究

周紅姿1，李紀(jì)順1*，劉 新2，吳遠(yuǎn)征1，趙吉興3，李 耀3

（1.山東省科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東濟(jì)南250014；2.山東省科學(xué)院生物所，山東濟(jì)南250014；3.山東中惠生物科技股份有限公司，山東濱州251707)

為提高紅曲霉菌（Monascus purpureus）體殘渣的利用率，采用機(jī)械破壁和酶解結(jié)合方法釋放胞內(nèi)蛋白。細(xì)胞破碎液經(jīng)纖維素酶與復(fù)合酶聯(lián)合處理，通過正交試驗確定最佳的水解條件為紅曲霉菌體殘渣質(zhì)量濃度60 g/L、酸性纖維素酶用量1.0%、復(fù)合酶用量0.5%、水解時間36 h。在此條件下，紅曲霉菌體殘渣的失重率達(dá)到27.86%，總糖含量達(dá)到7.38 g/L，小肽含量達(dá)到83.95 mg/g，游離氨基酸含量達(dá)到22.31 mg/g。

紅曲霉菌；纖維素酶；復(fù)合酶；總糖；小肽；游離氨基酸

紅曲以秈米為原料，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)分離出優(yōu)質(zhì)的紅曲霉菌（Monascus purpureus）經(jīng)液體深層發(fā)酵精制而成，是一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑。采用紅曲霉制備紅曲的歷史悠久，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中能產(chǎn)生大量紅曲色素[1-3]，此外還能產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，如莫納可林K、洛伐他汀、幾丁質(zhì)酶、輔酶Q10等，因此紅曲具有降膽固醇、降血壓、降血糖以及預(yù)防冠心病和治療骨質(zhì)疏松疾病等功能[4-7]。我國很多企業(yè)利用紅曲霉進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)紅曲色素，浸提色素后，形成大量紅曲霉菌體殘渣（以下簡稱菌渣），富含蛋白質(zhì)和活性物質(zhì)，現(xiàn)主要應(yīng)用于生產(chǎn)蛋白飼料，但其中很多大分子活性物質(zhì)不利于人畜吸收，目前對菌渣酶解前后營養(yǎng)成分的變化規(guī)律研究很少，本試驗在前人研究基礎(chǔ)上[8-10]，研究其酶解前后營養(yǎng)成分變化規(guī)律，采用機(jī)械破碎和纖維素酶結(jié)合方法釋放出多糖及菌體內(nèi)蛋白，通過酶解將這些大分子物質(zhì)降解成小分子，提升菌渣的營養(yǎng)品質(zhì)，提高其利用率，為使菌渣得到高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌渣：山東中惠生物科技股份有限公司；酸性纖維素酶（100 000 U/g）：山東隆大生物工程有限公司；諾維信纖維素酶（100 U/g）：諾維信中國投資有限公司；和氏璧纖維素酶（100 000 U/g）、復(fù)合酶（中性蛋白酶60 000 U/g、β-葡聚糖酶2 000 U/g、纖維素酶30 000 U/g）：和氏璧生物技術(shù)有限公司；D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：大連美侖生物技術(shù)有限公司；苯酚（分析純）、三氯乙酸、三氟乙酸（色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸（分析純）：萊陽市鐵塔化工制品廠；甲醇（色譜純）：美國Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-60SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-Q全溫振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；Agilent 1260 Infinity液相色譜儀：美國Agilent公司；KQ-400KDE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；細(xì)胞型1820D Molecular超純水儀：重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司；TU-1810紫外可見光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA1004N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HITACHI CR22GⅢ型離心機(jī)、L-8900氨基酸分析儀：日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 菌渣破碎前處理

菌渣粉碎后，過100目篩，獲得菌渣粉備用。

1.3.2 菌渣粉中粗蛋白及氨基酸含量的測定

凱氏定氮法[11]檢測菌渣粉的粗蛋白含量；氨基酸測定儀檢測菌渣粉中氨基酸含量。

1.3.3 菌體細(xì)胞破碎與酶解水解菌渣蛋白

稱量適量菌渣粉，加入蒸餾水在低溫條件下溶脹16 h，膠體磨研磨80 min，并在121℃滅菌30 min，待其涼后按照產(chǎn)品推薦量分別加入1%酸性纖維素酶、1%和氏璧纖維素酶、3%諾維信纖維素酶，混勻，置于37℃、160 r/min條件下酶解24 h，再分別在無菌條件下加入0.5%復(fù)合酶，37℃、160 r/min條件下繼續(xù)酶解24 h后，將水解液6 000×g離心10 min，收集菌渣，烘干至質(zhì)量恒定后測定菌渣失重率，以失重率反映菌渣蛋白水解程度，其計算公式：

1.3.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)前期預(yù)試驗，采用L9（34）正交試驗，選取菌渣質(zhì)量濃度（A）、酸性纖維素酶添加量（B）、復(fù)合酶添加量（C）和水解時間（D）這四個因素作為考察因素，以菌渣失重率為評價指標(biāo)，考察酶解條件對菌渣失重率的影響。每個因素取3個水平。每個處理設(shè)3個重復(fù)。正交試驗因素與水平見表1。

1.3.5 菌渣水解液總糖檢測

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品200.000 mg，加適量水溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，配成質(zhì)量濃度為2.00 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、 0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL至15 mL具塞試管中，加蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，加入5%苯酚溶液0.6 mL，搖勻，再迅速加入3 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴中加熱顯色反應(yīng)15 min，迅速冷卻至室溫。另以蒸餾水1 mL同上操作加苯酚和硫酸進(jìn)行顯色反應(yīng)，作為空白對照。在最大吸收波長489 nm處測定吸光度值，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以吸光度值為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸。

苯酚-硫酸比色法測定菌渣水解液中總糖含量[12]：精密量取菌渣水解液0.2mL，取蒸餾水稀釋并定容至50 mL容量瓶中，精確量取供試液1 mL于具塞試管中，加入5%苯酚溶液0.6mL，搖勻，再迅速加入3mL濃硫酸，搖勻，沸水浴中加熱顯色反應(yīng)15 min，取出后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水作為空白對照，于波長489 nm處測定吸光度值。根據(jù)回歸方程，計算得到葡萄糖含量，以葡萄糖計水解液中總糖含量。

1.3.6 菌渣水解液高效液相色譜檢測小分子化合物

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀檢測小分子化合物。色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm× 5 μm），流動相A為體積分?jǐn)?shù)為1%三氟乙酸水溶液，流動相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～5 min，5%B；5～45 min，5%～100%B；45～55 min，100%B；55～56 min，100%～5%B。檢測器是二極管陣列（diodearraydetector，DAD）檢測器，檢測波長270 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，分析時間58 min；系統(tǒng)平衡色譜柱時間為15 min。

1.3.7 菌渣及菌渣水解液中小肽含量和總游離氨基酸含量檢測

總游離氨基酸含量測定[13]：取5mL樣品上清液于10mL試管中，準(zhǔn)確加入5 mL 5%三氟乙酸溶液，混勻，于4℃7 000×g離心20 min，用0.45 μm的無機(jī)濾膜過濾。吸取濾液20 μL待測液注入L-8900全自動氨基酸分析儀，采用外標(biāo)法定量測定。

取適量菌渣水溶液及水解液，等體積加入10%三氯乙酸，在160 r/min搖床上振蕩30 min，4 000×g離心10 min，各取上清液10 mL于消化管中，按測定粗蛋白質(zhì)方法消化、定容至100 mL。移取10 mL消化液蒸餾，測定菌渣水溶液及水解液中粗蛋白質(zhì)含量。同時以蒸餾水作為空白。

氨基酸態(tài)氮含量[14]：依據(jù)GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的甲醛值法進(jìn)行測定。

小肽含量=粗蛋白含量－氨基酸態(tài)氮含量

2 結(jié)果與分析

2.1 菌渣粉中氨基酸含量和蛋白測定

凱氏定氮法檢測菌渣粉的蛋白含量為38.41%。菌渣粉中氨基酸含量檢測結(jié)果見表2。

由表2可知，菌渣粉中的蛋白質(zhì)含有17種氨基酸，氨基酸總含量占菌渣的21.90%，其中必需氨基酸占氨基酸總含量的37.20%，說明菌渣粉有較好的營養(yǎng)價值。

2.2 不同纖維素酶水解菌渣蛋白

菌渣溶液滅菌后，分別加入1%酸性纖維素酶、1%和氏璧纖維素酶及3%諾維信纖維素酶，混勻，置于37℃、160r/min條件下酶解24 h，再分別在無菌條件下加入0.5%復(fù)合酶，37℃、160 r/min條件下繼續(xù)酶解24 h后，將水解液6 000×g離心10 min，收集菌渣，烘干至質(zhì)量恒定后測定菌渣失重率，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，經(jīng)纖維素酶、復(fù)合酶處理的樣品，菌渣失重率差異明顯，其中酸性纖維素酶的處理失重率最高，達(dá)16.72%，諾維信纖維素酶處理其次，為15.58%，和氏璧纖維素酶處理最低，為14.42%，因此后續(xù)試驗均采用酸性纖維素酶聯(lián)合復(fù)合酶共同水解菌渣。

2.3 酶解條件優(yōu)化正交試驗

本試驗選取菌渣質(zhì)量濃度（A）、酸性纖維素酶添加量（B）、復(fù)合酶添加量（C）和水解時間（D）為考察因素，以菌渣失重率作為試驗考察指標(biāo)，正交試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

由表3可知，4因素對菌渣失重率的影響作用大小依次為C＞A＞D＞B，即復(fù)合酶添加量＞菌渣質(zhì)量濃度＞水解時間＞酸性纖維素酶添加量。最佳水平組合為A2B3C2D2，即最佳優(yōu)化組合為菌渣質(zhì)量濃度60 g/L、酸性纖維素酶添加量1.0%、復(fù)合酶添加量0.5%、水解時間36 h。在此最佳條件下進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)3次，平均失重率27.86%。

由表4可知，A、C、D因素對結(jié)果影響差異顯著（P＜0.05），B因素對結(jié)果影響差異不顯著（P＜0.05）。

2.4 菌渣水解液總糖檢測

2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在最大吸收波長489 nm處測定吸光度值，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以吸光度值為縱坐標(biāo)（y），繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：y=1.607 5x，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 8。結(jié)果表明，葡萄糖在0～2 mg/mL與吸光度值之間呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 菌渣水解液總糖測定

按照苯酚-硫酸比色法檢測菌渣粗粉碎60 g/L水溶液中總糖（以葡萄糖計）含量為0.73 g/L，在最佳條件下60 g/L菌渣水解液中的總糖（以葡萄糖計）含量為7.38 g/L，酶解后總糖含量提高了10倍。

2.5 液相色譜檢測菌渣水解液小分子化合物組分

取菌渣溶液（作為對照）和最佳條件下水解液的上清液進(jìn)行高效液相色譜檢測，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，最佳條件下菌渣水解液中的小分子化合物組分比對照中的發(fā)生了明顯變化，在保留時間較小的時間范圍內(nèi)，小分子化合物組分種類明顯增多，而在保留時間較大的時間范圍里的種類有所減少，總體上，最佳條件下菌渣水解液中的小分子化合物組分種類明顯增多，說明經(jīng)過水解后菌渣中的組分發(fā)生了明顯變化，其中很多大分子物質(zhì)被降解成更易于吸收的小分子化合物。

2.6 最佳條件下菌渣水解液中小肽含量和總游離氨基酸檢測

在此最佳優(yōu)化組合下進(jìn)行試驗，取水解液進(jìn)行小肽含量檢測，發(fā)現(xiàn)小肽含量達(dá)最大值83.95mg/g干料，而水解前菌渣粉中小肽含量為0.72 mg/g干料，說明菌渣經(jīng)過酶解后，蛋白被降解成小肽，更有益于人畜吸收，提升了菌渣的營養(yǎng)品質(zhì)。

氨基酸本身呈現(xiàn)出酸、甜、苦、鮮等各種味道，甜味類氨基酸有甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸，鮮味類氨基酸有谷氨酸和天冬氨酸，呈苦味氨基酸有酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸[15]。由表5可知，從水解液中共檢出16種游離氨基酸，總游離氨基酸含量最高達(dá)到22.31 mg/g干料，占菌渣水解液氨基酸組成的10.19%，其中必需氨基酸量達(dá)到13.28 mg/g干料，占菌渣水解液氨基酸組成6.06%。呈鮮味的天門冬氨酸占總游離氨基酸量的0.67%，呈甜味的氨基酸（絲氨酸、脯氨酸）占總游離氨基酸含量的1.43%，使水解液散發(fā)出香甜味，有助于提高人的食欲。

3 結(jié)論

紅曲菌體殘渣是生產(chǎn)紅曲色素形成的下腳料，其中含有大量的纖維素等大分子化合物，蛋白含量高達(dá)38.41%，目前主要用于生產(chǎn)動物的蛋白飼料，但其中蛋白質(zhì)分子較大，大部分為胞內(nèi)蛋白，殘渣中游離氨基酸的含量極低，不易于被人畜充分吸收。通過細(xì)胞破碎結(jié)合纖維素酶水解，可將殘渣中的纖維素等大分子化合物降解為人畜易消化利用的養(yǎng)分，同時釋放胞內(nèi)蛋白，并在復(fù)合酶作用下，菌渣的大分子蛋白被降解為小分子蛋白、小肽及游離氨基酸。結(jié)果表明，菌渣質(zhì)量濃度、復(fù)合酶添加量、反應(yīng)時間均對蛋白水解有顯著影響，最佳酶解條件為菌渣質(zhì)量濃度為60g/L、酸性纖維素酶添加量為1.0%、復(fù)合酶添加量為0.5%、水解時間為36h。在此最佳條件下，菌渣蛋白的失重率可達(dá)27.86%，總糖含量達(dá)到7.38 g/L，通過高效液相色譜檢測，發(fā)現(xiàn)水解液中的小分子化合物組成明顯增多，水解液小肽含量達(dá)到83.95 mg/g，游離氨基酸含量達(dá)到22.31 mg/g。

菌渣經(jīng)過處理后，大分子物質(zhì)含量降低，可溶性蛋白、小肽、游離氨基酸及可溶性總糖含量大大提高，有利于人畜的吸收，提高消化吸收率，改善適口性，使其品質(zhì)得到一定程度的提升，提高了菌渣的綜合利用率，為將其開發(fā)成高營養(yǎng)價值的保健產(chǎn)品提供了理論參考。

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Optimization of enzymatic hydrolysis of the residue fromMonascus purpureus

ZHOU Hongzi1,LI Jishun1*,LIU Xin2,WU Yuanzheng1,ZHAO Jixing3,LI Yao3
(1.Biotechnology Center of Shandong Academy of Sciences,Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Jinan 250014,China;2.Biology Institute of Shandong Academy of Sciences,Jinan 250014,China; 3.Shandong Zhonghui Biotechnology Co.,Ltd.,Binzhou 251707,China)

In order to improve the utilization rate of the residue fromMonascus purpureus,mechanical wall-breaking method combined with cellulase was used to release the intracellular protein.The wall-breaking liquid was treated by acid cellulase and compound enzymes.Through orthogonal test, the optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows:M.purpureusresidue concentration 60 g/L,acid cellulase 1.0%,compound enzyme 0.5%,and reaction time 36 h.Under these conditions,the weight-loss rate of the residue was 27.86%,the total sugar content was up to 7.38 g/L,the peptide content was up to 83.95 mg/g,and the free amino acid content was up to 22.31 mg/g.

Monascus purpureus;cellulase;compound enzyme;total sugar;peptide;free amino acid

TQ920.1

A

0254-5071（2015）06-0048-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.011

2015-05-04

山東省科技發(fā)展計劃（2014GSF121035）

周紅姿（1976-），女，副研究員，碩士，研究方向為應(yīng)用微生物。

*通訊作者：李紀(jì)順（1971-），男，高級工程師，本科，研究方向為應(yīng)用微生物。