胡久平，趙 輝，周禮紅，劉 敏，陳發(fā)貴，戚珊珊，熊 燕

（1.西藏月王生物技術(shù)有限公司，西藏拉薩850000；2.青藏高原微生物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，西藏拉薩850000；3.拉薩市青稞發(fā)酵工程研究技術(shù)中心；西藏拉薩850000；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所，貴州貴陽(yáng)550025）

不同添加物對(duì)青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量的影響

胡久平1，2，3，趙 輝1，2，3*，周禮紅2，4，劉 敏1，2，3，陳發(fā)貴1，2，3，戚珊珊1，2，3，熊 燕1，2，3

（1.西藏月王生物技術(shù)有限公司，西藏拉薩850000；2.青藏高原微生物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，西藏拉薩850000；3.拉薩市青稞發(fā)酵工程研究技術(shù)中心；西藏拉薩850000；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所，貴州貴陽(yáng)550025）

研究不同物質(zhì)及添加量對(duì)青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量的影響，并對(duì)影響蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，蔗糖、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、鏈霉素分別作為碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子有利于青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體蟲(chóng)草菌素的合成、累積，且作用顯著。通過(guò)正交試驗(yàn)確定不同物質(zhì)對(duì)青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量影響的主次因素為蔗糖＞蠶蛹粉＞磷酸二氫鉀＞鏈霉素＞硫酸鎂＞酵母膏，各物質(zhì)最佳添加量為蔗糖30 g/L，蠶蛹粉7.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，鏈霉素2.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在優(yōu)化配方條件下，青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量可達(dá)8 215 mg/kg。

青稞蛹蟲(chóng)草；子實(shí)體；蟲(chóng)草菌素；正交試驗(yàn)

蟲(chóng)草素（cordycepin）即3'-脫氧腺苷（3'-deoxyadenosine），又稱蟲(chóng)草菌素是由蛹蟲(chóng)草[Cordyceps militaris（L.）Link]的培養(yǎng)濾液中分離得到的，蟲(chóng)草菌素是第一個(gè)從真菌中分離出來(lái)的核苷類抗生素[1-2]。蟲(chóng)草菌素具有多種生物活性，研究表明，蟲(chóng)草菌素能特異抑制人宮頸癌細(xì)胞（Hela）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）轉(zhuǎn)錄[3]，影響Hela細(xì)胞MMP-9、TIMP-1及TIMP-1mRNA的表達(dá)，國(guó)產(chǎn)蟲(chóng)草菌素可以劑量依賴方式抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過(guò)上調(diào)TIMP-1mRNA及蛋白的表達(dá)發(fā)揮潛在的抗腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用[4]。蟲(chóng)草菌素有降血糖和降血脂的作用，這為糖尿病和高脂血癥新藥開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)[5-7]。蟲(chóng)草菌素還具有抗病原微生物、抗炎、抗白血病等藥理作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者在蛹蟲(chóng)草菌株的誘變篩選和蟲(chóng)草菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化方面做了大量研究[8-9]，但蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量依然不高。為了提高蛹蟲(chóng)草固體發(fā)酵產(chǎn)物中蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量，本研究以從青藏高原分離獲得的具有高產(chǎn)蟲(chóng)草菌素潛力的蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）菌株YWCM-1為試驗(yàn)菌株，探討不同添加物及添加量對(duì)青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量的影響，以期通過(guò)添加不同物質(zhì)提高青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素的含量，為青藏高原青稞蛹蟲(chóng)草發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草菌素的產(chǎn)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

蛹蟲(chóng)草[Cordyceps militaris（L.）Link]菌株YWCM-1由青藏高原微生物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心分離保存。青稞、蠶蛹粉：市售。

1.1.2 試劑

蟲(chóng)草菌素（cordycepin）標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鏈霉素、檸檬酸銨、瓊脂粉、麥芽糖、酵母膏等試劑均為分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基采用沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，瓊脂粉40g，水1 000 mL，pH自然。

改良沙氏液體培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，水1 000 mL，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛹蟲(chóng)草固體發(fā)酵基質(zhì)為破碎的青稞。營(yíng)養(yǎng)液配方為葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，無(wú)水硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，酵母膏5.0 g/L?；|(zhì)與營(yíng)養(yǎng)液的質(zhì)量比為1∶1.5，初始pH自然，無(wú)色玻璃瓶容積為350 mL（內(nèi)徑6.2 cm，高15 cm），以聚乙烯膜封口，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

1260安捷倫高效液相色譜：安捷倫科技有限公司；DH-360A電熱恒溫光照培養(yǎng)箱：北京科偉興儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TS-2012恒溫振蕩器：上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；ZK-82A型真空干燥箱：上海鴻都電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化和種子液的制備

菌種活化：將菌株YWCM-1接種于活化培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種活化，先25℃，避光培養(yǎng)5 d，再25℃連續(xù)光照（光強(qiáng)600 lx）培養(yǎng)1 d至菌落完全變色。

種子液制備：以50 mL無(wú)菌水洗活化后斜面上菌株孢子，制成終濃度為106個(gè)/mL的均一孢子懸液。將種子液按照體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于添加0.2%青稞粉的改良沙氏液體培養(yǎng)基中，25℃、160 r/min條件下避光培養(yǎng)4 d，制得種子液。

1.3.2 蛹蟲(chóng)草固體發(fā)酵產(chǎn)子實(shí)體

按照10%接種量將種子液接種于添加營(yíng)養(yǎng)液的青稞基質(zhì)上，先25℃避光培養(yǎng)5 d，然后連續(xù)光照2 d至菌絲完全變?yōu)槌赛S色；再進(jìn)行間斷光照和變溫培養(yǎng)（每天光照18 h，光強(qiáng)600 lx；光照培養(yǎng)溫度為25℃；避光培養(yǎng)6 h，培養(yǎng)溫度為15℃）30 d后收取子實(shí)體，用于蟲(chóng)草菌素檢測(cè)，每組10個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

1.3.3 樣品蟲(chóng)草菌素測(cè)定

將收獲的子實(shí)體于60℃真空干燥，粉碎；蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定[10]。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-水=5∶95（V/V），用前過(guò)0.45 μm濾膜，脫氣；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量10 μL。

蟲(chóng)草菌素含量計(jì)算公式如下：

式中：W為蟲(chóng)草菌素的含量，μg/kg；A為試樣中蟲(chóng)草菌素的峰面積；As為標(biāo)準(zhǔn)工作樣中蟲(chóng)草菌素峰面積；ρs為標(biāo)準(zhǔn)工作液中蟲(chóng)草菌素的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為試樣液最終定容體積，mL；f為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.5 不同組分種類的單因素試驗(yàn)

分別以葡萄糖、蔗糖、葡萄糖/蔗糖（1∶1）代替原營(yíng)養(yǎng)液中的碳源，添加量均為20 g/L；以蛋白胨、蠶蛹粉、蛋白胨/蠶蛹粉（1∶1）代替營(yíng)養(yǎng)液中的氮源，添加量均為10 g/L；以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀代替原營(yíng)養(yǎng)液中的磷酸鹽，添加量均為1.0 g/L，以檸檬酸銨、鏈霉素為生長(zhǎng)因子，添加量均為1.0 g/L，培養(yǎng)基質(zhì)與各添加物組成的營(yíng)養(yǎng)液的質(zhì)量比均為1∶1.5，以青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體蟲(chóng)草菌素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)添加物種類進(jìn)行篩選，按蛹蟲(chóng)草固體發(fā)酵產(chǎn)子實(shí)體的方法進(jìn)行。

1.3.6 營(yíng)養(yǎng)液配方優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體蟲(chóng)草菌素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)蔗糖、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、鏈霉素、酵母膏、硫酸鎂等6個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化正交試驗(yàn)，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按L27（36）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，各因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析方法

本研究中所有的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)皆采用Minitab 16.0進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源、氮源、磷酸鹽、生長(zhǎng)因子的單因素試驗(yàn)

以蛹蟲(chóng)草固體發(fā)酵產(chǎn)子實(shí)體的方法，進(jìn)行單因素試驗(yàn)對(duì)影響青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素物質(zhì)種類進(jìn)行篩選，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，不同添加物對(duì)青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量影響各不相同。在碳源方面，當(dāng)以蔗糖為唯一碳源時(shí)，其子實(shí)體中的蟲(chóng)草菌素含量最高，由此可知，在以青稞為發(fā)酵基質(zhì)的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體發(fā)酵中蔗糖是其產(chǎn)蟲(chóng)草菌素的最適碳源，這與MAO X B等[9，11-12]研究結(jié)果有所出入。這可能是因?yàn)楸狙芯渴且郧嗖馗咴赜械霓r(nóng)作物青稞為發(fā)酵基質(zhì)，較其他研究者所使用的大米、玉米、高粱米等發(fā)酵基質(zhì)其營(yíng)養(yǎng)成分有所差別。在氮源方面，當(dāng)以蠶蛹粉為唯一氮源時(shí)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量最高，表明蠶蛹粉是青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體合成累積蟲(chóng)草菌素的最適氮源。在磷酸鹽方面，磷酸二氫鉀比磷酸氫二鉀更有利于蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素的合成累積，這與文庭池等[13]的研究結(jié)果有所不同，可能是因?yàn)樵谇嗖馗咴毖?、干燥環(huán)境中蛹蟲(chóng)草對(duì)磷酸鹽的需求有所不同。在生長(zhǎng)因子的篩選方面，鏈霉素在子實(shí)體的蟲(chóng)草菌素合成累積方面表現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢(shì)，這與肖正華等[14]在其他發(fā)酵基質(zhì)上的研究結(jié)果一致，這表明鏈霉素為生長(zhǎng)因子對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素合成累積確有促進(jìn)作用。

2.2 營(yíng)養(yǎng)液配方正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、鏈霉素是影響青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體產(chǎn)蟲(chóng)草菌素的顯著因子，另外文庭池等[13，15]的研究表明硫酸鎂和酵母膏對(duì)蛹蟲(chóng)草產(chǎn)蟲(chóng)草菌素也有較顯著影響，因此為了確定這6因素對(duì)青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量影響，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表2可知，以青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各因素對(duì)子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量的影響程度大小依次為蔗糖＞蠶蛹粉＞硫酸鎂＞磷酸二氫鉀＞鏈霉素＞酵母膏。最佳組合為A2B2C1D3E3F2，即添加量為蔗糖30 g/L，蠶蛹粉7.5 g/L，鏈霉素2.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在此最佳配方條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，蟲(chóng)草菌素的含量為8 215 mg/kg。

由表3可知，蔗糖、蠶蛹粉對(duì)青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素合成累積有極顯著（P＜0.01）的影響；磷酸二氫鉀和鏈霉素對(duì)青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素合成累積有顯著（P＜0.05）的影響；而硫酸鎂和酵母膏對(duì)青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素合成累積無(wú)顯著影響。

3 結(jié)論

本研究以青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等進(jìn)行篩選，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定有利于青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素合成累積的碳源為蔗糖、氮源為蠶蛹粉、無(wú)機(jī)鹽為磷酸二氫鉀、生長(zhǎng)因子為鏈霉素。篩選出的有利于青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量的物質(zhì)與以往報(bào)道的有同異之處，這從一定程度上表明不同的發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵環(huán)境對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素的合成累積所需的物質(zhì)有所影響。通過(guò)正交試驗(yàn)獲得了以青稞為發(fā)酵基質(zhì)有利于青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素合成累積的最佳營(yíng)養(yǎng)液配方為蔗糖30 g/L，蠶蛹粉7.5 g/L，鏈霉素2.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在此優(yōu)化配方條件下，青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草菌素含量可達(dá)8 215 mg/kg。本研究為高原環(huán)境下青稞蛹蟲(chóng)草子實(shí)體產(chǎn)蟲(chóng)草菌素的工業(yè)化開(kāi)發(fā)奠定了一定基礎(chǔ)。

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Effect of different additives on the production of cordycepin in the fruit body of highland barleyCordycepes militaris

HU Jiuping1,2,3,ZHAO Hui1,2,3*,ZHOU Lihong2,4,LIU Min1,2,3,CHEN Fagui1,2,3,QI Shanshan1,2,3,XIONG Yan1,2,3
(1.Tibet Yuewang Biotechnology Co.,Ltd.,Lhasa 850000,China; 2.National United Engineering Research Center for Tibetan Plateau Microbiology,Lhasa 850000,China; 3.Lhasa Highland Barley Fermentation Engineering Technology Research Center,Lhasa 850000,China; 4.Institute of Fungi Resource,College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

The effect of different additives and additions on cordycepin content of highland barelyCordycepes militarisfruit body was studied,and the medium formula that affect cordycepin production was optimized.Results indicated that sucrose,silkworm chrysalis meal,monopotassium phosphate and streptomycin were the optimal carbon source,nitrogen source,inorganic salt,and growth factor,respectively,which are all significantly beneficial to cordycepin sythesis and accumulation.The orthogonal experiments indicated that the effect of different substances on cordycepin content in order was sucrose,silkworm chrysalis meal,potassium dihydrogen phosphate,streptomycin,magnesium sulfate,yeast extract,respectively.The optimal addition were sucrose 30 g/L,silkworm chrysalis meal 7.5 g/L,monopotassium phosphate 1.0 g/L,streptomycin 2.0 g/L,magnesium sulfate 1.5 g/L and yeast extract 2.5 g/L,respectively.The cordycepin production in highland barelyC.militarisfruit body could reach 8 215 mg/kg at such condition.

highland barleyCordycepes militaris;fruit body;cordycepin;orthogonal experiment

Q815

A

0254-5071（2015）06-0080-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.018

2015-05-27

拉薩市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201410）

胡久平（1986-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、微生物活性。

*通訊作者：趙輝（1969-），男，經(jīng)濟(jì)師，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、工商行政管理。