張文旭，胡 雪，高玉杰，張立佳

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010050；2.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010110）

UPLC-MS/MS法測定嬰幼兒乳制品中的氟乙酸鈉

張文旭1，胡 雪2*，高玉杰2，張立佳2

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010050；2.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010110）

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了嬰幼兒乳制品中氟乙酸鈉的檢測方法，為相關(guān)中毒事件的樣本分析提供檢測依據(jù)。樣品經(jīng)水稀釋、乙腈沉淀蛋白、C18固相萃取填料凈化后，低溫冷凍離心除掉雜質(zhì)，含0.1%乙酸水溶液和乙腈梯度洗脫，通過ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl色譜柱分離，電噴霧負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，該方法在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，定量限0.2 mg/kg。不同添加質(zhì)量濃度的回收率為91.8%～114.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10.0%，精密度試驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5.0%。該方法操作快速簡單、靈敏度和重現(xiàn)性較好，能夠用于嬰幼兒乳制品中氟乙酸鈉的污染排查和相關(guān)中毒事件的樣品檢測。

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法；氟乙酸鈉；中毒檢測；嬰幼兒乳制品

氟乙酸鈉是一種劇毒物質(zhì)，常被作為殺鼠劑使用。雖然我國衛(wèi)生部于1982年已經(jīng)明令禁止其生產(chǎn)、銷售和使用，但是近年來依然有很多例誤食或投毒引起的氟乙酸鈉中毒事件。氟乙酸鈉中毒機(jī)制已經(jīng)有了很多研究[1-3]，主要為在體內(nèi)形成氟乙酸，進(jìn)而與檸檬酸結(jié)合形成氟檸檬酸，抑制烏頭酸酶，導(dǎo)致三羧酸循環(huán)中斷，氟檸檬酸在組織中蓄積，腎、心、腦組織中可分別增高80、20、8倍。腦細(xì)胞鈉鉀泵衰竭、細(xì)胞內(nèi)水腫，同時(shí)過多的氟檸檬酸可直接損害神經(jīng)細(xì)胞而造成腦功能障礙。心臟、肝臟、腎臟也可能由此造成不同程度損害。嬰幼兒由于各種器官耐受程度均低于成人，因此在氟乙酸鈉中毒搶救中起病更急、病死率更高。關(guān)注嬰幼兒乳制品中的毒物污染情況并研究該類食品中氟乙酸鈉快速、準(zhǔn)確的檢測方法具有重要的實(shí)際意義。

文獻(xiàn)報(bào)道的氟乙酸鈉含量分析檢測方法有離子色譜法[4]、毛細(xì)管電泳法[5]、液相色譜法[6]、氣相色譜法[7]、氣相質(zhì)譜法[8-9]、液相質(zhì)譜法[10]等。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法在復(fù)雜樣本痕量檢測中的應(yīng)用越來越廣泛，避免了由于衍生步驟而降低的方法穩(wěn)定性。但是液質(zhì)法對基質(zhì)效應(yīng)的要求比較高，因此對前處理方法的選擇十分重要。文獻(xiàn)報(bào)道的方法涵蓋了不同的檢測樣品，如鼠藥[11-13]、胃內(nèi)容物[14]、血液[15]、其他生物樣品[16-18]、植物[19]、醬油、醋[20-21]等，但是其前處理方法不適用嬰幼兒乳制品的檢測。嬰幼兒乳制品包括乳粉、兒童奶、兒童發(fā)酵乳以及冷凍飲品等，樣品蛋白質(zhì)含量高，基質(zhì)復(fù)雜，需要最大程度的去除基質(zhì)干擾并能保證回收率。本研究擬利用一種簡單并適用于多種嬰幼兒乳制品的前處理方法結(jié)合超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法實(shí)現(xiàn)對嬰幼兒乳制品中污染物氟乙酸鈉的快速、高效、準(zhǔn)確排查和相關(guān)中毒事件的樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒乳粉、QQ星兒童奶、QQ星兒童風(fēng)味發(fā)酵乳、冷凍飲品：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：德國Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司；乙酸（色譜純）、乙腈（色譜純）：德國Merck公司；C18固相萃取填料：美國Sepulco公司；Oasis HLB固相萃取柱（500mg/6mL）、Sep-PakC18固相萃取柱（500mg/6mL）：美國Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SIGMA3K30低溫高速離心機(jī)：德國Sigma公司；Waters Acquity TQ Detector超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

稱取試樣1.0 g于50 mL的具塞離心管中，加4 mL超純水稀釋，再加入10 mL乙腈和0.5 g C18固相萃取填料，渦旋混勻，超聲10 min，4℃、16 000 r/min離心10 min。取上清液于50 mL燒杯中，加入15 mL超純水，混勻，過0.22 μm濾膜，供液相色譜質(zhì)譜儀進(jìn)樣分析。

1.3.2 空白基質(zhì)標(biāo)線的制備及添加回收率

準(zhǔn)確稱取氟乙酸鈉約10 mg（精確至0.1 mg），用50%乙腈水溶解并定容至10 mL，按純度折算其質(zhì)量濃度，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

取與待測樣同樣基質(zhì)的陰性樣品，按照和待測樣品相同的前處理方法得到空白基質(zhì)液，用該空白基質(zhì)液配制成質(zhì)量濃度為10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L、1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)后得到空白基質(zhì)標(biāo)線。

添加回收率試驗(yàn)，在陰性樣品中添加一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后按照樣品前處理方法進(jìn)行處理，上機(jī)后得到的結(jié)果與理論添加值的比值，即為回收率。每類樣品選擇具有代表性的樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做6次平行試驗(yàn)，取平均值。

1.3.3 色譜條件

1.3.4 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧離子源（electronic spray ion，ESI）；毛細(xì)管電壓2.2 kV；錐孔電壓30 V；碰撞電壓10 V；源溫120℃；脫溶劑溫度350℃；脫溶劑氣流量600 L/h；碰撞室壓力0.31 Pa。多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測，母離子m/z76.74，定量子離子m/z57.06，定性子離子m/z49.09。

1.3.5 氟乙酸鈉的含量計(jì)算公式

式中：X為試樣中氟乙酸鈉的含量，mg/kg；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的上機(jī)液中氟乙酸鈉的質(zhì)量濃度，μg/L；D為樣品的定容體積乘以稀釋倍數(shù)，mL；m為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉淀劑的選擇

氟乙酸鈉的親水性極強(qiáng)，在傳統(tǒng)的反相液相色譜柱上保留很弱，易與溶劑共流出，因此選用ACQUITY UPLC CSHRFluoro-Phenyl色譜柱進(jìn)行分離[21]。

乳制品常用的蛋白沉淀劑有酸和有機(jī)溶劑，由于氟乙酸鈉極易溶于水而不溶于有機(jī)溶劑，所以在選用有機(jī)溶劑時(shí)要選擇合適的比例。經(jīng)過優(yōu)化試驗(yàn)，體積分?jǐn)?shù)＜50%乙腈作為沉淀劑時(shí)，上清液渾濁，沉淀不完全；＞80%乙腈作為沉淀劑時(shí)，因水相體積分?jǐn)?shù)較小，提取不徹底，影響回收率，甚至有時(shí)會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，因此乙腈體積分?jǐn)?shù)在50%～80%較為適宜。

由圖1a可知，氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為2.18 min。由圖1b可知，用10 g/L三氯乙酸或1%乙酸作為沉淀劑時(shí)，上清液較清，但是氟乙酸鈉在色譜柱上沒有保留（pH值從2調(diào)至4、6、8現(xiàn)象一樣）。由圖1c可知，用體積分?jǐn)?shù)為65%乙腈作為沉淀劑時(shí)，上清液較清，在色譜柱上同樣沒有保留，通過加水使乙腈含量降至30%，則氟乙酸鈉在色譜柱上保留良好，并且與標(biāo)品出峰時(shí)間一致。因此，選擇體積分?jǐn)?shù)為65%的乙腈作為沉淀劑，并在上機(jī)前用水稀釋至30%。

2.2 固相萃取方式的選擇

質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)的影響因素有很多，固相萃取是液質(zhì)檢測中常用的前處理方式以消除或減弱基質(zhì)效應(yīng)。用每種空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.3.2）與用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙腈配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行比較，二者峰面積做比值，即為基質(zhì)效應(yīng)。比值＞100%的有基質(zhì)增強(qiáng)作用；比值＜100%的有基質(zhì)抑制作用。但是由于氟乙酸鈉在反向固相萃取柱上的保留性極弱，因此該類固相萃取柱只能用作凈化柱使用。對氟乙酸鈉最佳的固相萃取方式是選用陰離子交換柱[4，7-8]，但是由于洗脫液通常用酸，因此該類前處理適用的上機(jī)儀器為離子色譜或氣相色譜，用液質(zhì)儀器同樣會發(fā)生色譜柱上沒有保留的現(xiàn)象。分別用C18固相萃取填料0.5 g、Oasis HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL）和Sep-Pak C18（500 mg/6 mL）固相萃取柱來凈化，發(fā)現(xiàn)其基質(zhì)效應(yīng)均可控制在90%～120%（兒童奶、兒童發(fā)酵乳、冷凍飲品）和60%～100%（嬰幼兒乳粉）。用C18固相萃取填料可與沉淀離心的步驟合并，減少了活化、上樣、淋洗、洗脫等固相萃取步驟，節(jié)省了前處理時(shí)間，因此選擇添加C18固相萃取填料為凈化方式。

2.3 進(jìn)樣體積的選擇

超高效液相色譜由于其流速為300 μL/min，因此存在溶劑效應(yīng)，即上機(jī)液的定容液種類和進(jìn)樣體積均會對色譜柱的分離造成一些影響。定容液為體積分?jǐn)?shù)30%的乙腈溶液，低于初始流動相中乙腈的含量。進(jìn)樣體積分別選擇2 μL、5 μL和10 μL，由圖2可知，進(jìn)樣體積為2 μL時(shí)沒有溶劑效應(yīng)，峰型較好。因此，選擇進(jìn)樣體積為2 μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

兒童乳制品主要有4類，分別為嬰幼兒乳粉、兒童奶、兒童發(fā)酵乳和冷凍飲品，用這種空白基質(zhì)配制標(biāo)線，峰面積（Y）和質(zhì)量濃度（X）標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)詳見表1。

定量限以最低加標(biāo)濃度試樣中氟乙酸鈉的定量色譜峰信噪比為10時(shí)計(jì)算所得，方法的定量限為0.2 mg/kg。由表1可知，該方法在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99?？疾樘砑淤|(zhì)量濃度為20 μg/L時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，其中嬰幼兒乳粉的基質(zhì)效應(yīng)比較明顯，其他三種基質(zhì)效應(yīng)較弱。因此嬰幼兒乳粉需要用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測定。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

在嬰幼兒乳粉、兒童奶、兒童發(fā)酵乳和冷凍飲品的陰性樣品中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氟乙酸鈉，平行測定6次，得出平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果如表2所示。

從表2可知，測定不同嬰幼兒乳制品基質(zhì)中氟乙酸鈉的平均回收率為91.8%～114.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10.0%，說明該方法的準(zhǔn)確度好，能滿足定量分析的要求。

對加標(biāo)的嬰幼兒乳粉和兒童奶平行測定6次，結(jié)果見表3，RSD值分別為2.6%和1.1%，說明該方法的精密度良好，能滿足定量分析的要求。

3 結(jié)論

本研究通過對沉淀劑、固相萃取方式及進(jìn)樣體積等前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對嬰幼兒乳制品中氟乙酸鈉的直接測定。與現(xiàn)有的報(bào)道相比，本方法的定量限為0.2 mg/kg，處于相當(dāng)?shù)乃?，同時(shí)避免了衍生反應(yīng)引起的不穩(wěn)定性及檢驗(yàn)周期長的缺點(diǎn)。該方法在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，不同添加質(zhì)量濃度的回收率為91.8%～114.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10.0%，精密度試驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5.0%。該檢測方法簡單快速且易于操作，精密度及準(zhǔn)確性良好，適合對嬰幼兒乳制品實(shí)現(xiàn)氟乙酸鈉污染的排查，并可用于該類中毒樣品的快速檢測。

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Determination of sodium fluoroacetate in infant dairy products by UPLC-MS/MS

ZHANG Wenxu1,HU Xue2*,GAO Yujie2,ZHANG Lijia2
(1.Affiliated Hospital,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China; 2.Inner Mongolia Yili Industrial Group Co.,Ltd.,Hohhot 010110,China)

A UPLC-MS/MS method for determination of sodium fluoroacetate in infant dairy products was developed and the analytical method for the relevant food poison accidents was provided.Samples were ultrasonically extracted with water,protein was precipitated by frozen with acetonitrile and the extracted solution was purified by dispersive DSC-C18.The target compound was separated by ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl with a mobile phase of 0.1%acetic acid solution and acetonitrile,and analyzed by a negative electrospray ion multiple reaction monitoring mode.The standard curves were linear in the concentration range of 10-1 000 μg/L with correlation coefficients more than 0.99.The quantification limits was 0.2 mg/kg.The recovery values and the relative standard deviation were 91.8%-114.9%and less than 10.0%at different fortification levels.Due to its simplicity,relatively high sensitivity and reproducibility,the method was suitable for the contamination screening and detection of sodium fluoroacetate in infant dairy products from the poisoning accidents.

UPLC-MS/MS;sodium fluoroacetate;poisoning test;infant dairy products

R917

A

0254-5071（2015）06-0150-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.033

2015-05-25

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAK17B00）

張文旭（1981-），男，藥師，本科，研究方向?yàn)樗幬锓治觥?/p>

*通訊作者：胡雪（1981-），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)榉治鰴z測。