喬宗赟 曾胤新，2 董培艷 鄭天凌

(1集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門361021;2國家海洋局極地科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國極地研究中心，上海200136;3廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361005;4廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361005)

0 引言

王灣位于北極斯匹次卑爾根群島新奧爾松地區(qū)，是一個(gè)背靠冰川的開放峽灣。該海灣及其鄰近海域是北冰洋水團(tuán)和大西洋水團(tuán)的交匯處，受海冰、大西洋暖水團(tuán)以及北極冷水團(tuán)的多重影響，對(duì)氣候變化極為敏感。該區(qū)域已成為北極地區(qū)最主要的國際環(huán)境研究和監(jiān)測(cè)站點(diǎn)之一［1］。近年來由于北極地區(qū)增溫明顯，導(dǎo)致夏季王灣附近冰川融冰加速，而北冰洋也呈現(xiàn)大西洋水比重增加的趨勢(shì)。這些變化將影響王灣海域的水文狀況，導(dǎo)致水溫和鹽度發(fā)生較大變化，進(jìn)而影響到灣內(nèi)整個(gè)生物群落結(jié)構(gòu)［2］。

近十幾年來，有關(guān)浮游細(xì)菌在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的作用越來越受到人們重視。海洋中數(shù)量眾多的浮游細(xì)菌(數(shù)量級(jí)在106-109cells·L-1)，不僅是有機(jī)物質(zhì)的分解者，也是有機(jī)顆粒的重要生產(chǎn)者，在營養(yǎng)鹽和其他元素的再生中起著非常重要的作用。在一定海域，浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，其中的優(yōu)勢(shì)菌群在碳及其他元素的生物地球化學(xué)過程中起著關(guān)鍵作用［3］。 其中，玫瑰桿菌支系(Roseobacterclade)因其廣泛分布于世界各地，具有高豐度及不同的生理多樣性，相關(guān)研究業(yè)已成為海洋細(xì)菌研究中的熱點(diǎn)之一［4］。該支系細(xì)菌在整個(gè)微生物群落中的占有比例可達(dá)25%［5］。在王灣，浮游細(xì)菌豐度在108-109cells·L-1，在原核生物群落中所占比例超過75%，相比之下，古菌僅占1%左右［6-7］。研究結(jié)果表明，α-變形菌、γ-變形菌及嗜纖維菌-曲撓桿菌-擬桿菌群(CFB)是王灣浮游細(xì)菌群落中的主要組成成分，灣內(nèi)、外的浮游細(xì)菌群落在多樣性組成上沒有明顯差異［7-9］。但我們對(duì)2011年王灣夏季樣品的分析結(jié)果卻顯示出差異:海灣內(nèi)、外的表層浮游細(xì)菌群落均以γ-變形菌及擬桿菌為主［10］。在王灣，以甲藻、綠藻及小型異養(yǎng)生物為主的原生生物群落在夏季期間保持相對(duì)穩(wěn)定，但細(xì)菌群落則變化較大，這可能與冰川融水的輸入存在關(guān)系［9］。季節(jié)、地區(qū)以及生態(tài)方面的差異，都會(huì)影響細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

本文通過PCR-DGGE方法，對(duì)王灣表層海水及沉積物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，以檢測(cè)該海灣不同地點(diǎn)細(xì)菌群落的組成情況。此外，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)灣口、灣內(nèi)的浮游細(xì)菌和玫瑰桿菌支系進(jìn)行豐度檢測(cè)，以了解夏季陸源性淡水輸入對(duì)該海灣表層浮游細(xì)菌群落的影響。相關(guān)結(jié)果，對(duì)于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)夏季期間環(huán)境變化對(duì)于王灣浮游細(xì)菌群落乃至整個(gè)海洋上層生態(tài)系統(tǒng)的影響，具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及菌種

2011年7月中國北極黃河站度夏考察期間，在王灣選取從灣口(Stn1)到灣內(nèi)(Stn5)的5個(gè)站位采集表層水樣1.5-2.1 L(圖1，表1)。此外，在其中3個(gè)站位(Stn1、Stn3和Stn5)采集沉積物樣品。海水樣品經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過濾。濾膜及沉積物樣品凍存于-80℃并運(yùn)回國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室開展DNA抽提。參考菌株Roseicitreum antarcticumZS2-28由中國極地研究中心俞勇先生提供。

1.1.2 主要試劑

DNA純化通用試劑盒購自廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司;UltraClean Soil DNA Isolation Kit購自MoBio公司;E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、TIAN pure Mini Plasmid Kit購自天根生化科技(北京)有限公司;pMD20-T載體、SYBR Premix Ex TaqⅡ購自TaKaRa公司。

圖1 王灣樣品采集站位圖Fig.1.Map of Kongsfjorden sampling station positions

表1 王灣采樣站點(diǎn)環(huán)境參數(shù)及DGGE條帶的豐富度、多樣性指數(shù)及均勻度Table 1.Summary of seawater and sediment samples collected from Kongsfjorden(Svalbard)and their DGGE patterns.Samples Stn1 to Stn5 were collected from seawater， and samples S1， S3， and S5 were collected from sediment

1.1.3 儀器設(shè)備

Gel Doc凝膠影像分析系統(tǒng)(Bio-Rad);DGGE system(Bio-Rad);CFX96 Touch Real-Time PCR Detection Systems(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 環(huán)境DNA的提取

濾膜上的樣品經(jīng)2 mL DNA提取緩沖液(Tris 50 mmol，EDTA 50 mmol，NaCl100 mmol，pH 8.0)沖洗、回收后，總DNA的提取參照文獻(xiàn)方法［11-12］進(jìn)行。提取的總DNA溶解于30μL TE中，-20℃保存?zhèn)溆?。沉積物樣品中的環(huán)境總DNA的提取采用MoBio公司的DNA提取試劑盒、參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。細(xì)菌Roseicitreum antarcticumZS2-28的基因組提取則采用DNA純化通用試劑盒進(jìn)行。

1.2.2 16S rDNA片段擴(kuò)增

以2μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的環(huán)境DNA(10-100 ng)為模板，采用引物 Eubac 27F和Eubac1492R［13］擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA片段。PCR反應(yīng)體系包括引物(10 μmol·L-1)各 1 μL，dNTPs(10 mmol· L-1)1 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL，10×PCR緩沖液5 μL，BSA(1 mg·mL-1)2 μL，補(bǔ)充雙蒸水定容至50μL。PCR反應(yīng)條件為94℃，5 min;(94℃，1 min;55℃，1 min;72℃，2 min)×30次循環(huán);72℃延伸8 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.3 16S rDNA-V3高變區(qū)擴(kuò)增

為比較直接PCR與巢式PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，分別以2μL環(huán)境DNA和上述16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物為模板(約50ng)，采用引物341F(前端加有GC鉗)與534R對(duì)細(xì)菌16S rDNA片段中的V3高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增［14］。PCR反應(yīng)體系包括引物(10μmol·L-1)各 0.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.8 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)1μL，10×PCR緩沖液5 μL，BSA(1 mg·mL-1)4 μL，補(bǔ)充雙蒸水定容至50μL。 反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)［8］進(jìn)行。

1.2.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)及圖譜分析

參照文獻(xiàn)［8］，采用40%-60%變性梯度對(duì) V3區(qū)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并經(jīng)EB染色后，將凝膠置于Gel Doc凝膠影像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)中進(jìn)行拍照及保存。DGGE電泳圖譜采用Quantity One處理。用BandScan4.3對(duì)DGGE指紋圖譜中每個(gè)條帶的灰度進(jìn)行分析，計(jì)算多樣性指數(shù)(H)、物種豐度(S)和均勻度(EH)。

1.2.5 優(yōu)勢(shì)條帶序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將優(yōu)勢(shì)DGGE條帶切割回收，置于Eppendorf管中，加入50μL ddH2O，4℃過夜。12 000 rpm離心10 min。取20μL上清液作為PCR模板，按照16S rDNA-V3高變區(qū)擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化通用試劑盒純化回收后，與載體 pMD20-T連接，再轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。序列測(cè)定由上海美季生物技術(shù)有限公司完成。所測(cè)得的序列采用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，并利用 Blastn工具在 NCBI數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)和模式菌種庫Eztaxon sever(http://147.47.212.35:8080/)中進(jìn)行比對(duì)以獲得親緣序列。利用Mega5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。28條序列已登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(序列號(hào):JX110669、JQ945201、JX110671、JQ945202、JX110672、JQ945203-JQ945206、 JX110675、 JQ945207、 JX110676-JX110678、JX041254、 JX110680、 JQ945208-JQ945211、JX110681-JX110684、JQ945213、 JX110686、 JQ945214、JQ945215)。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

含細(xì)菌16SrDNA-V3高變區(qū)質(zhì)粒的制備:用TIAN pure Mini Plasmid Kit質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)上述測(cè)序菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。質(zhì)粒起始拷貝數(shù)計(jì)算公式:

含玫瑰桿菌特異性片段質(zhì)粒的制備:以Roseicitreum antarcticumZS2-28總DNA(10-100 ng)為模板，采用玫瑰桿菌特異性引物391F和536R［15］各0.5 μL(10 μmol·L-1)，dNTPs(10 mmol·L-1)2 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL，10×PCR緩沖液2.5μL，加ddH2O定容至25μL。PCR反應(yīng)條件:94℃，3 min;(94℃，30 s;58℃，30 s;72℃，1 min)×30次循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物參照前面純化及克隆步驟，轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α中并測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證通過后進(jìn)行質(zhì)粒制備及質(zhì)粒拷貝數(shù)的計(jì)算。

分別對(duì)上述兩種質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，開展5 個(gè)稀釋梯度(107、106、105、104、103)的熒光定量PCR并制作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)

以灣口(Stn1)和灣底(Stn5)站位的總DNA為模板，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)熒光擴(kuò)增體系，分別擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA-V3高變區(qū)和玫瑰桿菌特異性片段。每個(gè)樣品做3個(gè)生物重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，并用無菌水代替模板作陰性對(duì)照，反應(yīng)體系為:SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)12.5 μL，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。細(xì)菌16S rDNA-V3高變區(qū)的反應(yīng)條件為:95℃，3 min;95℃，15 s;60℃，1 min(后面兩步反應(yīng)進(jìn)行35次循環(huán))。玫瑰桿菌特異性片段的反應(yīng)條件為:95℃，3min;95℃，15 s;65℃，1 min(后兩步反應(yīng)進(jìn)行40次循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)入Bio-Rad CFX Manager分析界面，系統(tǒng)自動(dòng)得出目的基因的平均Ct值和溶解曲線。通過上面的標(biāo)準(zhǔn)曲線可確定目的基因的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 直接PCR與巢式PCR對(duì)16S rDNA-V3高變區(qū)的擴(kuò)增比較

結(jié)果顯示，以16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的巢式PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)于以環(huán)境DNA為模板的直接PCR而言，目標(biāo)條帶(200bp左右)更為銳利、明亮，更適合于后續(xù)DGGE分析所需。這一情況與我們對(duì)白令海北部沉積物細(xì)菌群落的分析結(jié)果相似［16］。

2.2 基于DGGE圖譜的細(xì)菌群落組成分析

王灣表層水體及沉積物細(xì)菌群落組成的DGGE指紋圖譜(圖2)顯示:海水細(xì)菌群落與沉積物細(xì)菌群落存在較明顯的差異;在不同站位的海水或沉積物樣品中，部分DGGE條帶出現(xiàn)在相同的位置(如條帶8、條帶20所處位置)，表明在該海域的海水或沉積物中普遍存在著一些優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育型;此外，這些處于相同電泳位置的條帶，在不同樣品中的濃淡程度存在差別，表明其DNA濃度存在差別。而DNA濃度的差別，可能來源于相關(guān)細(xì)菌豐度的差別。

對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果(圖3)顯示:來自灣口及海灣中間位置的沉積物樣品(S1、S3)獨(dú)立于其他樣品、聚為一簇，顯示出其細(xì)菌群落組成與其他樣品的較大差異性;位于海灣最里面的沉積物樣品S5則與表層水樣聚集成一個(gè)大簇，反映出該站位的沉積物細(xì)菌群落與浮游細(xì)菌群落的相似性程度高。此外，在表層浮游細(xì)菌群落中，位于灣口附近的站位(Stn1、Stn2)相互間的相似性更高，與灣內(nèi)的3個(gè)站位分別聚為2個(gè)簇。

利用相關(guān)軟件對(duì)DGGE條帶進(jìn)行遺傳多樣性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果(表1)顯示，沉積物細(xì)菌群落的豐富度及多樣性指數(shù)，都高于浮游細(xì)菌群落，表明沉積物中的細(xì)菌群落組成相比浮游細(xì)菌更為豐富、多樣。從灣口到灣內(nèi)，細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)、均勻度基本上都呈現(xiàn)出遞增趨勢(shì)。

2.3 基于DGGE條帶的細(xì)菌多樣性分析

DGGE對(duì)環(huán)境中微生物的數(shù)量有一定要求，能夠在DGGE圖譜上顯現(xiàn)出來的條帶，代表的通常是在樣品中具有優(yōu)勢(shì)地位的細(xì)菌菌群［17］。對(duì)28條DGGE條帶的測(cè)序結(jié)果表明(圖2)，18條來自水樣的序列分別屬于α-變形細(xì)菌(Alphaproteobacteria)、γ-變形細(xì)菌(Gammaproteobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)及厚壁菌(Firmicutes)等5大類群;10條來自沉積物的序列則包括了 α-變形細(xì)菌、γ-變形細(xì)菌、δ-變形細(xì)菌(Deltaproteobacteria)、擬桿菌及厚壁菌等5大類群。其中，擬桿菌、α-變形細(xì)菌、γ-變形細(xì)菌分別占水樣總序列數(shù)的38%、22%及22%。

圖2 王灣海域表層海水及沉積物細(xì)菌群落組成的DGGE指紋圖譜.帶數(shù)字標(biāo)記的條帶表示已被回收、測(cè)序，Stn1-Stn5為表層海水樣品;S1、S3及 S5為沉積物樣品Fig.2.Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)fingerprint of bacterial communications in surface water and sediment samples collected in Kongsfjorden，Svalbard.Bands indicated by numberwere excised for sequencing.Samples Stn1 to Stn5 were collected from seawater，and samples S1，S3 and S5 were collected from sediment

圖3 王灣海域表層海水及沉積物細(xì)菌群落組成DGGE指紋圖譜的聚類分析.Stn1-Stn5為表層海水樣品，S1、S3及S5為沉積物樣品Fig.3.Cluster analysis of DGGE patterns of bacterial communications in surface water and sediment samples collected in Kongsfjorden，Svalbard.Samples Stn1 to Stn5 were collected from seawater， and samples S1， S3 and S5 were collected from sediment

序列比對(duì)結(jié)果顯示，分別有1條水體DGGE條帶(條帶4)、5條沉積物 DGGE條帶(條帶7、9、20、24及27)與模式菌種庫Eztaxon sever中參考菌株的序列相似性在84%-96%，表明這些序列來自尚未被報(bào)道的細(xì)菌新種屬。DGGE條帶及其親緣序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)也顯示，這5條序列與親緣序列均具有較遠(yuǎn)的遺傳進(jìn)化距離。結(jié)果同時(shí)也表明，在沉積物中找到新穎細(xì)菌的可能性比海水更高。

2.4 浮游細(xì)菌和紅細(xì)菌的豐度

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法、分別對(duì)灣口Stn1及灣內(nèi)Stn5表層海水中的總細(xì)菌和玫瑰桿菌的豐度進(jìn)行了檢測(cè)。16S rDNA-V3區(qū)擴(kuò)增曲線顯示，陰性對(duì)照無擴(kuò)增，表明樣品未受到污染;溶解曲線出現(xiàn)單一銳利的峰，說明引物特異性好，不存在非特異性擴(kuò)增。Stn1和Stn5的擴(kuò)增效率分別為94.7%和97.4%，決定系數(shù)R2分別為0.999和1.000，說明反應(yīng)已達(dá)到最優(yōu)，斜率分別為-3.456和-3.385，數(shù)據(jù)理想，可用于后續(xù)分析。通過質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算得到Stn1和Stn5的總細(xì)菌豐度分別為(7.7-8.1)×108cells·L-1和(8.1-8.4) ×108cells·L-1。

同樣，針對(duì)玫瑰桿菌的 Stn1和 Stn5站位的QPCR擴(kuò)增曲線、溶解曲線顯示，測(cè)試樣品未受污染;所用引物的特異性好、擴(kuò)增效率達(dá)106%，決定系數(shù)R2為0.999，斜率為-3.186，數(shù)據(jù)理想。通過質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算得到灣口Stn1和灣內(nèi)Stn5浮游玫瑰桿菌的豐度分別為9.4×104cells·L-1和(6.0-6.7) ×104cells·L-1。

圖4 王灣表層水體及沉積物樣品中細(xì)菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.4.Phylogenetic tree showing the affiliation of16S rDNA sequences from surface water and sediment samples collected in Kongsfjorden(Svalbard)with selected sequences in GenBank database

3 討論

本文利用PCR-DGGE方法檢測(cè)了北極王灣表層海水及沉積物中的細(xì)菌群落組成。結(jié)果顯示，擬桿菌(38%)、α-變形細(xì)菌(22%)及 γ-變形細(xì)菌(22%)在表層水樣的DGGE條帶中占優(yōu)勢(shì)地位。這與我們對(duì)該海域2007年采集樣品的DGGE分析結(jié)果［8］較為相似:α-變形細(xì)菌、γ-變形細(xì)菌及擬桿菌均以22%的比例在表層水體的DGGE圖譜中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。但是，與2007年樣品中檢測(cè)到α-變形細(xì)菌、γ-變形細(xì)菌、ε-變形細(xì)菌、擬桿菌、放線菌、厚壁菌以及藍(lán)細(xì)菌(包括微藻葉綠體)等7個(gè)大類相比，本次研究并未在表層水樣中檢測(cè)到ε-變形細(xì)菌與藍(lán)細(xì)菌/葉綠體，顯示在門水平上的多樣性更低。我們基于454高通量測(cè)序方法對(duì)本次樣品的分析結(jié)果也顯示［10］，γ-變形細(xì)菌、擬桿菌在表層浮游細(xì)菌群落中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而營光合作用的藍(lán)細(xì)菌(包括微藻葉綠體)基本上未被檢測(cè)到。擬桿菌門中的成員能夠降解海洋中的多聚物，包括藻類來源的有機(jī)物［18-19］。與2007年夏季樣品相比，2011年夏季王灣浮游細(xì)菌群落出現(xiàn)了明顯變化:異養(yǎng)型的擬桿菌所占比例更高、而自養(yǎng)型的藍(lán)細(xì)菌/微藻所占比例下降顯著。究其原因，可能與該地區(qū)冰川淡水的輸入及浮游植物的水華進(jìn)程有關(guān)［9］。而2007年、2011年夏季王灣浮游細(xì)菌群落組成的差異，是否反映了近年來全球氣候變化對(duì)北極近岸海洋生態(tài)群落結(jié)構(gòu)的影響，還需要更多研究數(shù)據(jù)的收集與分析才能得到更確切的答案。

通常情況下，來源于同一環(huán)境中的不同樣品，如果在DGGE圖譜的同一電泳位置存在相似條帶，那么這些條帶會(huì)被認(rèn)為屬于同一系統(tǒng)發(fā)育型。在本次研究中，處于相同電泳位置的水樣 DGGE條帶Band-12(Stn4)、Band-13(Stn5)都與模式菌Algibacter lectusKMM 3902具有親緣關(guān)系。此外，處于相同位置的水樣條帶Band-21(Stn3)、Band-22(Stn4)及Band-23(Stn5)都與Loktanella salsilacusLMG21507關(guān)系密切。但同時(shí)，在DGGE圖譜上具有相似遷移位置的條帶也可能具有不同的序列［20］。在本次研究中，水樣條帶 Band-2(Stn3)的親緣序列來自Krokinobacter eikastusPMA-26，而處于同一電泳位置的Band-3(Stn5)則與Algibacter lectusKMM3902關(guān)系密切。在沉積物樣品中，也存在類似情況:處于相同位置的 Band-14(S1)、Band-15(S3)及 Band-16(S5)分別與Salmonella entericasubsp.salamaeDSM9220、Thalassobacter arenaeGA2-M15 及Pseudomonas plecoglossicidaFPC951關(guān)系密切。另一方面，處于DGGE圖譜不同位置的條帶卻可能屬于同一系統(tǒng)發(fā)育型:如水樣條帶 Band-2與 Band-5、以及Band-12/Band-13，雖然處于不同的電泳位置(圖2)，但親緣關(guān)系最近的參考菌株都是Algibacter lectusKMM3902(圖4)。因此，基于其自身的局限性，PCR-DGGE方法在微生物群落組成研究中更適合于不同環(huán)境之間微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的比較、以及同一環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化的動(dòng)態(tài)跟蹤［21］。在本次研究中，PCR-DGGE方法主要被用于王灣不同采樣站點(diǎn)表層海水及沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較。

DGGE圖譜的聚類分析結(jié)果顯示(圖3)，所有樣品被聚類為2個(gè)大簇:沉積物S1/S3簇、海水-沉積物S5簇。站位Stn1、Stn3水深皆超過200 m(表1)，因此這兩個(gè)站位的沉積物樣品S1與S3受表層海水、尤其是夏季冰川融水的影響小，它們主要是受外來大西洋水體的影響［22］。位于灣內(nèi)最里處的站位Stn5水深僅40 m左右，附近有多條冰川，因此其沉積物樣品S5受表層水體的影響非常大，這就解釋了為何沉積物S5中的細(xì)菌群落組成與表層浮游細(xì)菌群落的相似程度更高。而在海水-沉積物S5這一個(gè)大簇中，位于灣口位置的站位(Stn1、Stn2)又形成了一個(gè)獨(dú)立于灣內(nèi)站位(Stn4、Stn5及S5)的小簇，表明灣內(nèi)、灣口的浮游細(xì)菌群落受周圍環(huán)境、尤其是陸源性淡水輸入的影響，其組成存在一定的差異。

基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的檢測(cè)結(jié)果表明，王灣灣口(Stn1)、灣內(nèi)(Stn5)的浮游細(xì)菌豐度相近，數(shù)量級(jí)在108cell·L-1，與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)量級(jí)一致［23］。但浮游玫瑰桿菌的豐度分布卻顯示出差異:灣口的玫瑰桿菌豐度高于灣內(nèi)。玫瑰桿菌支系屬于α-變形細(xì)菌，是全球大洋中分布最廣泛的細(xì)菌類群之一，其中的Loktanella、Sulfitobacter等屬成員，很多是含有pufM基因的好氧不產(chǎn)氧光合細(xì)菌［24］，或者具有DMSP(二甲基琉基丙酸內(nèi)鹽)裂解酶基因［25］，因此該支系細(xì)菌在海洋上層生態(tài)系統(tǒng)的碳、硫循環(huán)中扮演著重要角色。盡管本次研究中檢測(cè)到的玫瑰桿菌在浮游細(xì)菌中所占比例極低(僅0.01%左右)，但在4條屬于α-變形細(xì)菌的水樣DGGE條帶中有3條(Band-19、21、23)屬于Loktanella或Sulfitobacter屬，表明玫瑰桿菌可能在王灣生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的生態(tài)學(xué)功能。在海洋環(huán)境中，低豐度的微生物類群雖然數(shù)量少、但卻可能具有高生長(zhǎng)速率并在當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)功能［26］。此外，根據(jù)海洋細(xì)菌的“種子銀行”學(xué)說［27］，對(duì)于玫瑰桿菌支系這類在全球海洋中廣泛分布的細(xì)菌類群而言，其豐度可隨環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化，一旦環(huán)境條件適宜，它們可由細(xì)菌群落組成中的稀有成分轉(zhuǎn)變成為優(yōu)勢(shì)成分。鹽度數(shù)據(jù)(表1)證實(shí)灣內(nèi)表層海水受冰川融水等陸地淡水輸入的影響明顯。結(jié)合DGGE圖譜及細(xì)菌豐度數(shù)據(jù)，本次研究的分析結(jié)果表明，王灣內(nèi)、外的浮游細(xì)菌群落受陸地淡水輸入的影響明顯，雖然細(xì)菌總體數(shù)量差異不大，但某些具有特定生態(tài)功能的類群(如玫瑰桿菌)的數(shù)量分布出現(xiàn)較大差異，并且群落結(jié)構(gòu)組成也出現(xiàn)差異。

致謝感謝國家海洋局第二海洋研究所金海燕研究員提供海水溫、鹽及營養(yǎng)鹽數(shù)據(jù)。

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