孫海彥，黎娟華，劉恩世，易小平，楊景豪，尹一伊，彭 明

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101）

黑曲霉G-1125生淀粉糖化酶基因的克隆與序列分析

孫海彥，黎娟華，劉恩世，易小平，楊景豪，尹一伊，彭 明*

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101）

從黑曲霉Aspergillus niger G-1125克隆到了生淀粉糖化酶菌基因的DNA及cDNA序列。序列分析表明，該生淀粉糖化酶基因組DNA序列編碼區(qū)長(zhǎng)2 172 bp，cDNA編碼區(qū)長(zhǎng)1 923 bp，該基因含有4個(gè)內(nèi)含子，共編碼640個(gè)氨基酸，前18個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，該氨基酸序列中共含有2個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，軟件預(yù)測(cè)出該酶的分子質(zhì)量約為68 ku，等電點(diǎn)為pH值4.07。

黑曲霉；生淀粉糖化酶；克?。恍蛄蟹治?/p>

淀粉酶是催化淀粉中糖苷鍵水解的酶類(lèi)的總稱(chēng)，是釀造工業(yè)中一種重要的酶類(lèi)，生淀粉糖化酶（raw starch digesting glucoamylase，RSDG）是指在低于淀粉糊化溫度條件下，直接水解不經(jīng)過(guò)蒸煮糊化的生淀粉顆粒，從非還原性末端的α-1,4或α-1,6糖苷鍵釋放出葡萄糖的一種酶[1]。由于用生淀粉糖化酶可以直接分解淀粉生成葡萄糖，從而省去傳統(tǒng)工藝中的高溫處理工序，能節(jié)約大量能源。所以從節(jié)約能源的角度考慮，研究和開(kāi)發(fā)生淀粉糖化酶具有重要的意義[2]。

由于生淀粉酶具有良好的應(yīng)用前景，近年來(lái)引起了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛興趣，在該研究領(lǐng)域做了很多工作。但是主要集中在生淀粉酶高產(chǎn)菌的選育、產(chǎn)酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化、酶的純化和性質(zhì)研究、酶的應(yīng)用研究等[3-10]。隨著基因工程的發(fā)展，通過(guò)基因克隆及分子改造進(jìn)行定向育種成為微生物菌種選育中的一種重要技術(shù)手段，但是目前有關(guān)生淀粉基因的克隆主要集中在生淀粉α-淀粉酶的克隆方面[11-13]，有關(guān)生淀粉糖化酶的基因克隆方面的研究還比較少，在前期中選育到一株生淀粉糖化酶高產(chǎn)菌黑曲霉（Aspergillus niger）G-1125，該菌種在淀粉培養(yǎng)基上產(chǎn)生淀粉糖化酶的活力可以達(dá)到458 U/mL，該活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的生淀粉糖化酶的活力，如羅時(shí)等[14]報(bào)道的馬鈴薯生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌所產(chǎn)酶的酶活為100 U/mL，孫子羽等[15]報(bào)道的化氣單胞菌所產(chǎn)生淀粉糖化酶活力最高是98.42 U/mL，本研究從前期實(shí)驗(yàn)中選育到一株生淀粉糖化酶高產(chǎn)菌黑曲霉Aspergillus niger G-1125，研究克隆了該菌所產(chǎn)生淀粉酶糖化酶的編碼基因，并對(duì)基因序列進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉Aspergillus niger G-1125菌種：由本實(shí)驗(yàn)室保藏。pMD 18-Tvector載體，Top10、Taq（聚合）酶、T4DNA連接酶、DNAMarker、三磷酸脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleoside-5′-triphosphate，dNTPs）、10×PCRBuffer：日本TaKaRa公司；DNA、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；膠回收試劑盒：美國(guó)Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

D-6708PCR儀：日本TaKaRa公司；5804R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；NANODROP2000紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司；DYY-8C型電泳儀：北京六一儀器廠；76S/07859凝膠成像分析儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Aspergillus niger G-1125 RSDG基因的克隆

引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用Vector.NTI.Advance.v10.3軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游引物P1：5′-ATGTCGTTCCGATCTCTACTCGCC-3′；下游引物P2：5′-GGTGACTGACACCTGGCGGTAG-3′；由上海生物工程有限公司合成。

DNA克?。阂蕴崛〉腁spergillus niger G-1125基因組DNA為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：Taq 酶0.5μL；10×PCR Buffer 5μL；dNTP 4μL，引物20 pmol；模板2.5μL，無(wú)菌水37μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸2 min，退火溫度為58℃，25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

cDNA的克?。阂蕴崛〉木w總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，反應(yīng)條件為42℃、60 min，70℃、15 min。然后以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，采用DNA克隆相同的方法克隆基因的cDNA。

基因的鑒定：將回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T vector載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10菌株的感受態(tài)細(xì)胞，然后送測(cè)序。

1.3.2 基因的序列分析

采用ncbi、DNAstar、signalp 4.1 server、http：//www.cbs. dtu.dk/services/NetNGlyc/等數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件，分析RSDG基因的同源性、內(nèi)含子、推導(dǎo)蛋白的氨基酸序列，并對(duì)編碼蛋白的等電點(diǎn)、信號(hào)肽、糖基化位點(diǎn)等性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Aspergillus niger G-1125生淀粉糖化酶基因的克隆

Aspergillus niger G-1125的基因組DNA和RNA的提取結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可以看出，條帶1是提取的總RNA，兩條帶亮度一致，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量很好，可以用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和基因克隆實(shí)驗(yàn)，條帶2的DNA帶沒(méi)有彌散帶，說(shuō)明提取的DNA質(zhì)量也很好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

分別以基因組DNA及總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板的目標(biāo)基因克隆結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，由基因組DNA為模板到的目標(biāo)基因片段即DNA片段和由反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板的目標(biāo)基因的cDNA片段，均為單一條帶，亮度較高，這說(shuō)明已經(jīng)成功克隆到了相應(yīng)的目標(biāo)片段，可以用于連接pMD18-T vector載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10并送測(cè)序，此外由圖2還可以得出，目標(biāo)基因的DNA和cDNA片段大小都約為2 000 bp。

2.2 序列分析

分別以Aspergillus niger G-1125基因組DNA和總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，克隆到目標(biāo)基因的片段進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該該基因的DNA序列開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為2 172 bp，cDNA開(kāi)放閱讀框大小長(zhǎng)1 923 bp（含終止子）。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因含有4個(gè)內(nèi)含子，如圖3中方框所示，位置分別是216～290 bp、578～632 bp、729～790 bp、1 429～1 486 bp。鳥(niǎo)嘌呤（Guanine）+胞嘧啶（Cytosime）含量為56.22%，NCBI搜索比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該基因與Aspergillus niger糖化酶基因同源性達(dá)到99%，與Aspergillus awamori糖化酶基因同源性達(dá)到99%，與Aspergillus shirousami糖化酶基因同源性達(dá)到91%。推導(dǎo)氨基酸序列用DNAstar軟件處理得出，詳細(xì)序列見(jiàn)圖4。由圖4可知，該基因編碼的酶蛋白由640個(gè)氨基酸組成。軟件預(yù)測(cè)出該酶的分子質(zhì)量約為68 ku，等電點(diǎn)為4.07，兩個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)是N195 NQTG和N206 NGSS，采用signalp 4.1 server在線分析發(fā)現(xiàn)，該酶蛋白含有一個(gè)18個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序（MSFRSLLALSGLVCTGLA），屬于GS15亞家族。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)提取生淀粉糖化酶菌種Aspergillus niger G-1125基因組DNA和總RNA，并對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，克隆到了該菌生淀粉糖化酶基因的DNA及cDNA序列。經(jīng)測(cè)序后分析發(fā)現(xiàn)，該菌種的生淀粉糖化酶DNA序列長(zhǎng)2 172 bp，cDNA序列長(zhǎng)1 923 bp，通過(guò)DNA和cDNA序列的比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該基因含有4個(gè)內(nèi)含子，編碼的酶蛋白由640個(gè)氨基酸組成，其中前18個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，屬于GS15亞家族。該研究為今后構(gòu)建高產(chǎn)的生淀粉糖化酶的基因工程菌奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]SUN H Y,ZHAO P J,GE X Y,et al.Recent advances in microbial raw starch degrading enzymes[J].Appl Biochem Biotechnol,2010,160(4): 988-1003.

[2]ROBERTSON G H,WONG D WS,LEE C C,etal.Native or raw starch digestion:a key step in energy efficient biorefining of grain[J].J Agric Food Chem,2006,54(2):353-365.

[3]ANDERS V N,CARSTEN A,TINE H,et al.Development of new α-amylases for raw starch hydrolysis[J].Biocatal Biotransfor,2006,24 (1-2):121-127.

[4]EZEJI T C,BAHL H.Production of raw-starch-hydrolysingα-amylase from the newly isolated Geobacillus thermodenitrificans HRO10[J]. World J Microbiol Biotechnol,2007,23(9):1311-1315.

[5]DEMIRKAN E S,MIKAMI B,ADACHI M,et al.α-Amylase from B.amyloliquefaciens:purification,characterization,raw starch degradation and expression in E.coli[J].Process Biochem,2005,40(8):2629-2636.

[6]KANEKO T,OHNO T,OHISA N.Purification and characterization of a thermostable raw starch digesting amylase from a Streptomyces sp.isolated in a milling factory[J].Biosci Biotechnol Biochem,2005,69(6): 1073-1081.

[7]LI H,CHI Z,DUAN X,et al.Glucoamylase production by the marine yeast Aureobasidium pullulans N13d and hydrolysis of potato starch granules by the enzyme[J].Process Biochem,2007,42(3):462-465.

[8]GAWANDE B N,GOEL A,PATKAR A Y,et al.Purification and properties of a novel raw starch degrading cyclomaltodextrin glucanotransferase from Bacillus firmus[J].Appl Microbiol Biotechnol,1999,51(4): 504-509.

[9]ITKOR P,TSUKAGOSHI N,UDAKA S.Nucleotide sequence of the raw-starch-digesting amylase gene from Bacillus sp.B1018 and its strong homology to the cyclodextrin glucanotransferase genes[J].Biochem Biophys Res Commun,1990,166(2):630-636.

[10]HASHIMOTO Y,NISHIYAMA M,LKEHATA O,et al.Cloning and characterization of an amidase gene from Rhodococcus species N-774 and its expression in Escherichia coli[J].Biochimica et biophysica Acta,1991,1088(2):225-233.

[11]JEANG C L,CHEN L S,CHEN MY,etal.Cloning of a gene encoding raw-starch-digesting amylase from a Cytophaga sp.and its expression in Escherichia coli[J].Appl Envir Microbiol,2002,68(7):3651-3654.

[12]HMIDET N,BAYOUDH A,BERRIN J G,et al.Purification and biochemical characterization of a novelα-amylase from Bacillus licheniformis NH1:cloning,nucleotide sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli[J].Process Biochem,2008,43(5):499-510.

[13]KIM C H,SATA H,TANIGUCHIH,et al.Cloning and expression of raw-starch-digestingα-amylase gene from Bacillus circulans F-2 in Escherichia coli[J].Biochimica et Biophysica Acta,1990,1048(2-3): 223-230.

[14]羅 時(shí)，譚興和，蘇小軍，等.馬鈴薯生淀粉糖化酶高產(chǎn)菌株的篩選與誘變研究[J].中國(guó)釀造，2009，28（2）：19-22.

[15]孫子羽，遲乃玉，李 兵，等.響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基[J].中國(guó)釀造，2010，29（7）：110-114.

Cloning and sequence analysis of gene encoded raw-starch-digesting-glucoamylase from Aspergillus niger G-1125

SUN Haiyan,LIJuanhua,LIU Enshi,YIXiaoping,YANG Jinghao,YIN Yiyi,PENGMing*

(Institute of TropicalBioscience and Biotechnology,Chinese Academy of TropicalAgricultural Sciences,Haikou 571101,China)

DNA and cDNA ofraw-starch-digesting-glucoamylase were cloned from Aspergillus niger G-1125.The sequence analysis revealed thatthe length of DNA and cDNA of this gene were 2 172 bp and 123 bp,respectively.The DNA sequence contained 4 introns and encoded a protein of 640 amino acids with a signalpeptide of 18 amino acids and two potentialglycosylation sites.The calculated molecular weight and isoelectric pointof the enzyme were 68 ku and pH 4.07,respectively.

Aspergillus niger;raw-starch-digesting-glucoamylase;cloning;sequence analysis

Q933

A

0254-5071（2015）02-0051-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.012

2015-01-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（31000029）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”（2012AA101204）；海南省自然科學(xué)基金（ZDFD 20120765）；海南省研究生創(chuàng)新科研課題（Hyb2011-4）；海南省引進(jìn)集成應(yīng)用專(zhuān)項(xiàng)（YJJC2011004）；海南省重大科技項(xiàng)目（ZDZX2013023-1）；中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院中央級(jí)公益院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（ITBB2015RC06）

孫海彥（1979-），女，副研究員，碩士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。

*通訊作者：彭 明（1956-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。