蔡 靜，張紊瑋，贠建民，武建禎

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

餐廚垃圾微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的工藝優(yōu)化

蔡 靜，張紊瑋，贠建民*，武建禎

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

以餐廚垃圾為原料，采用酵母菌、黑曲霉和枯草芽孢桿菌作為混合發(fā)酵菌劑進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)合正交試驗，建立并優(yōu)化了餐廚垃圾轉(zhuǎn)化為生物活性蛋白飼料的工藝條件。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵工藝為以釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶黑曲霉（1∶1∶2）為混合菌劑，接種量1.0%，尿素添加量1.0%，30℃發(fā)酵48 h，含水量60%，在此發(fā)酵條件下發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量提高了58.7%；粗纖維、粗淀粉和粗灰分含量均顯示下降；氨基酸總含量增加了1.08倍，其中必需氨基酸含量提高了95.9%；維生素B1、B2的含量也有顯著提高；微生物指標(biāo)均符合國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 5009.23—2006）。

餐廚垃圾；菌體蛋白；多菌發(fā)酵；工藝優(yōu)化

餐廚垃圾是家庭、飲食單位拋棄的剩飯剩菜以及廚房殘余物的統(tǒng)稱，主要包括米和面粉類、蔬菜、動植物油、肉骨等食物殘渣，含水率高、成分復(fù)雜、營養(yǎng)成分高[1]，極易腐爛變質(zhì)、散發(fā)惡臭、傳播細(xì)菌和病毒[2]。隨著社會的發(fā)展，人們生活水平的不斷提高，餐廚垃圾的產(chǎn)量也在逐年上漲[3-4]。目前我國餐飲垃圾的處理方法有以下幾種：直接排放、填埋、焚燒、堆肥，雖然這些方法處理了餐廚垃圾，但是均會產(chǎn)生不利影響[5-8]。餐廚垃圾營養(yǎng)成分很高，并沒有將餐廚垃圾資源化利用[9]。此外，餐廚垃圾大多數(shù)被直接用作動物飼料，由于其可能含有口蹄疫病菌、豬瘟病菌、弓形蟲、沙門氏菌等病原菌，未經(jīng)處理直接飼養(yǎng)畜禽，會將其中的病菌通過食物鏈傳染給食用者，進(jìn)一步對人體造成危害，形成惡性循環(huán)[10-11]，后果不堪設(shè)想。隨著畜牧業(yè)和飼料工業(yè)的發(fā)展，蛋白飼料的不足將成為全球性的問題。由于對蛋白飼料資料認(rèn)識不足，不少可以開發(fā)的資源卻未能得到有效利用[12-13]。然而利用微生物將有機(jī)廢物轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，生產(chǎn)的生物飼料具有消化吸收率高、適口性好，增加動物的采食量等優(yōu)點[14]，不僅能夠提高資源的利用效率，而且對消除環(huán)境污染、改善生態(tài)環(huán)境都具有重要意義[15]。本試驗以餐廚垃圾為原料，采用多菌協(xié)生固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，使微生物間進(jìn)行有效的優(yōu)勢互補(bǔ)[16]，以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母為發(fā)酵菌種，結(jié)合正交試驗設(shè)計方法對餐廚垃圾轉(zhuǎn)化為生物活性蛋白飼料的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，旨在為餐廚垃圾的資源化高效利用提供技術(shù)支撐和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

餐廚垃圾：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生二號食堂。

1.1.2 菌種

釀酒酵母（Saccharomyces cerivisia）、黑曲霉（Aspergillus niger）、枯草芽孢桿菌（Bacillu ssubtilis）均為食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物發(fā)酵實驗室自行保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，麥芽糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉5 g，NaCl5 g，蒸餾水1 000 mL，用于培養(yǎng)酵母菌。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g、蔗糖（或葡萄糖）20 g、水1 000 mL，pH值自然，用于培養(yǎng)黑曲霉。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值7.0～7.2，用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌。

固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：經(jīng)過預(yù)處理的餐廚垃圾用勻質(zhì)機(jī)打漿，121℃滅菌20 min即為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.1.4 試劑

硫酸鉀（分析純）：天津市巴斯夫化工有限公司；硫酸銅（分析純）、酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉（分析純）：成都市科龍化學(xué)試劑廠；硼酸（分析純）、乙醚（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇凈集團(tuán)蘇州安秦空氣技術(shù)有限公司；ATN-300半微量凱氏定氮儀、SXT-06索氏提取器：天長市長城玻璃儀器制造廠；DH-600A恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；101-1-S-Ⅱ鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；FA1004B分析天平：上海佑科儀器儀表有限公司；HHS恒溫水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；WFX-110B/120B/130B原子吸收分光光度計：北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）公司。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

粗蛋白的測定參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；氨基酸組成和含量測定參照GB 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》；粗淀粉的測定參照GB/T 20194—2006《飼料中淀粉含量的測定》；還原糖的測定參照GB 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》；粗灰分的測定參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；粗纖維的測定參照GB 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》；維生素B1、B2參照GB/T 14700—2002《飼料中維生素B1的測定》；礦質(zhì)元素采用原子吸收分光光度法；黃曲霉毒素B1的測定參照GB/T 5009.23—2006《食品中黃曲霉毒素Bl、B2、Gl、G2的測定》；病原菌的檢測：參照GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》等系列國家標(biāo)準(zhǔn)方法。

微生物指標(biāo)測定：取發(fā)酵物樣品1 g置于9 mL無菌水中，充分混勻后，取1 mL進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的稀釋液分別涂布于適宜的培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)30 h，計數(shù)平板中的菌落數(shù)。

1.3.2 生產(chǎn)蛋白飼料的工藝流程

1.3.3 餐廚垃圾的采集及基本成分分析

餐廚垃圾取自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生二號食堂，主要是餐飲消費(fèi)剩余的米面主食及植物類菜品。初步分揀去除一次性筷子、餐盒、紙巾等不可利用物，離心、去除部分水分，拌入10%～18%農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，置于4℃?zhèn)溆?，?jīng)過以上方法處理的固體原料為研究對象。對主要的幾類食物殘余物，包括米和面粉主食類、蔬菜類、動植物油、肉骨類等基本成分進(jìn)行分析，主要是化學(xué)成分分析，測定其中的粗蛋白、粗纖維、粗灰分、粗淀粉及還原糖含量。

1.3.4 菌種活化及液體菌種的制備

將菌種從4℃冰箱取出，無菌操作，用接種環(huán)挑取于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48 h，作為斜面菌種。將活化好的斜面菌種無菌操作向250 mL液體培養(yǎng)基中接入少量菌種，150 r/min培養(yǎng)48～72 h，作為種子液。

1.3.5 最佳蛋白飼料的工藝條件的確定

分別研究接種量、混合菌種接種比例對餐廚垃圾發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的的影響，再依據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)氮源、含水量、溫度、發(fā)酵時間4個因素，以粗蛋白含量為評價指標(biāo)確定最佳工藝條件。

1.3.6 發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)分析及安全性評價

研究發(fā)酵產(chǎn)物的主要理化成分及營養(yǎng)價值，開展生物安全性檢測及評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 餐廚垃圾成分分析

對餐廚垃圾的基本成分分析，以便選擇不同發(fā)酵菌種、調(diào)整基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，為發(fā)酵試驗打下基礎(chǔ)，其結(jié)果見表1。

由表1可知，餐廚垃圾中含有較豐富的可供微生物發(fā)酵利用的碳源、氮源和礦質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)，可以作為微生物的基質(zhì)發(fā)酵再利用。

2.2 菌種發(fā)酵試驗

2.2.1 單一菌種對固體發(fā)酵的影響

在餐廚垃圾中分別接入1.0%的黑曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母3種不同菌種，考察其在25℃條件下發(fā)酵48 h，對固體發(fā)酵的影響結(jié)果見圖1。

由圖1可知，向固體發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基中接入各種供試菌種均能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物的粗白含量。在相等的接種比例下，相同的培養(yǎng)條件下，黑曲霉對固體發(fā)酵培養(yǎng)基的粗蛋白含量的增幅最高，達(dá)到20.21%，由此確定出單一菌種發(fā)酵的最佳菌種為黑曲霉。

2.2.2 黑曲霉添加量對固體發(fā)酵的影響

接種量的大小會影響微生物生長繁殖的速度。因此，本試驗研究了不同接種量0.5%、1.0%、1.5%黑曲霉，考察在25℃條件下發(fā)酵48 h對固體發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，不同黑曲霉接種量相同的培養(yǎng)條件下，接種量為1.0%對固體發(fā)酵培養(yǎng)基的粗蛋白含量的增幅最高，達(dá)到20.21%，因此黑曲霉最佳接種量為1.0%。

2.2.3 混合菌種對固體發(fā)酵培養(yǎng)基的影響

在發(fā)酵基質(zhì)中按接種量1.0%，分別接入釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶黑曲霉以不同混合比例1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1、1∶2∶2、2∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶1菌種種子液，在25℃條件下發(fā)酵48 h，考察其對固體發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，相同的培養(yǎng)條件下，接種酵母菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌混合菌種，當(dāng)釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶黑曲霉的接種比例為1∶1∶2時，發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量最高，達(dá)到21.82%。由此確定出混合菌種最佳接種比例為1∶1∶2。

2.3 混合菌種發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 氮源種類對固體發(fā)酵的影響

氮源是微生物生長和產(chǎn)物合成的必要保障，直接影響發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白的含量。因此，以混合菌種最佳接種比例為1∶1∶2，在氮源的添加量相同的條件下（添加量為1.0%），加入不同氮源種類時（磷酸二氫銨、硫酸銨、尿素），考察不同氮源在25℃條件下發(fā)酵48 h對固體發(fā)酵的影響，其結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在相同的培養(yǎng)條件下，磷酸氫二銨、硫酸銨、尿素這三種氮源均可以提高固體發(fā)酵粗蛋白的含量。在添加量為1.0%的情況下，尿素對固體發(fā)酵粗蛋白含量的增幅高于其他氮源，因此，選擇尿素作為固體發(fā)酵的最適氮源。

2.3.2 尿素的添加量對固體發(fā)酵的影響

以尿素為最佳氮源，考察其在不同的添加量0.5%、1.0%、1.5%對混合菌種在25℃條件下發(fā)酵48 h，考察尿素的添加量對固體發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的影響，其結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)尿素添加量為1.0%時，固體發(fā)酵培養(yǎng)基的粗蛋白含量可達(dá)23.51%。因此最佳尿素添加量為1.0%。

2.3.3 不同含水量對固體發(fā)酵的影響

含水量過低，造成基質(zhì)膨脹程度低，微生物生長受到抑制；含水量過大，難以通風(fēng)降溫，造成產(chǎn)品的粗蛋白降低，而且使產(chǎn)品容易染菌。因此對不同含水量30%、40%、50%、60%、70%對固體發(fā)酵的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，在相同的培養(yǎng)條件下，隨著含水量的增加，固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的粗蛋白含量升高，含水量達(dá)到60%時，粗蛋白含量最高，為23.23%。但當(dāng)含水量＞60%，粗蛋白含量降低。由此確定固體發(fā)酵最佳含水量為60%。

2.3.4 不同溫度對固體發(fā)酵的影響

溫度直接影響著微生物生長和代謝。由于是多種微生物對餐廚垃圾進(jìn)行發(fā)酵，每種微生物具有不同的最佳生長溫度，因此要研究不同溫度25℃、30℃、35℃對固體發(fā)酵的影響，其結(jié)果見圖7。

由圖7可知，在相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)溫度為30℃時，發(fā)酵培養(yǎng)基中的粗蛋白含量最高，達(dá)到24.02%。由此確定固體發(fā)酵最佳溫度為30℃。

2.3.5 不同發(fā)酵時間對固體發(fā)酵的影響

發(fā)酵時間太短，微生物代謝產(chǎn)物積累少，粗蛋白含量少；發(fā)酵時間太長，影響產(chǎn)品品質(zhì)。探究發(fā)酵時間對固體發(fā)酵的影響，其結(jié)果見圖8。

由圖8可知，在相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)時間為48 h時，發(fā)酵培養(yǎng)基中的粗蛋白含量最高，達(dá)到24.48%。由此確定固態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)時間為48 h。

2.4 正交試驗優(yōu)化固體發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗，以餐廚垃圾發(fā)酵過程中產(chǎn)品粗蛋白含量為考察指標(biāo)，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量影響由大到小依次為尿素添加量＞含水量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度，A2B2C2D2為最優(yōu)組合，即在以釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶黑曲霉（1∶1∶2）為混合菌劑，接種量1.0%的基礎(chǔ)上，尿素添加量1.0%，培養(yǎng)基含水量60%，發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度30℃。在此最佳條件下進(jìn)行驗證試驗，最終產(chǎn)品中粗蛋白含量達(dá)到25.07%。

由表3可見，尿素添加量對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響顯著，發(fā)酵時間、含水量、發(fā)酵溫度對粗蛋白含量的影響不顯著。因素作用的主次順序是尿素添加量＞含水量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度，與極差分析得出的結(jié)果一致。

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物主要理化成分及營養(yǎng)價值分析

2.5.1 營養(yǎng)價值分析

完成蛋白飼料生產(chǎn)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化后，對該工藝下的產(chǎn)品營養(yǎng)價值進(jìn)行了分析。餐廚垃圾常規(guī)營養(yǎng)成分組成（以干物質(zhì)計）分析測定結(jié)果見表4，菌體蛋白飼料礦質(zhì)元素測定結(jié)果見表5，氨基酸組成與維生素含量的測定結(jié)果見表6。

由表4可知，發(fā)酵后的餐廚垃圾中粗蛋白含量比原料提高了58.7%，粗纖維、粗淀粉、粗灰分均有較大程度的下降，尤其是粗纖維含量降低幅度較大，減少了58.2%，說明餐廚垃圾發(fā)酵后營養(yǎng)價值得到了提高，適口性得到了明顯的改善。

由表5可知，發(fā)酵飼料中的礦質(zhì)元素豐富，尤其是Ca、P、K、Mg含量最為豐富。

由表6可知，氨基酸總含量提高了1.08倍，必需氨基酸含量提高了95.9%，維生素B1、B2的比例也得到了提高。因此飼料的營養(yǎng)價值得到了提高。

2.5.2 衛(wèi)生指標(biāo)測定

以菌體蛋白飼料中生物毒素的含量及是否存在致病菌為指標(biāo)來開展安全性評價，其結(jié)果見表7。

由表7可知，餐廚垃圾菌體蛋白飼料中的黃曲霉毒素檢測結(jié)果在國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)之下，而致病菌（沙門氏菌）未檢測出來，說明用該工藝生產(chǎn)出的蛋白飼料是安全的。

3 結(jié)論

采用多菌協(xié)生混合發(fā)酵技術(shù)原理，將3種有益微生物復(fù)配，對餐廚垃圾轉(zhuǎn)化為生物活性蛋白飼料的工藝條件開展了優(yōu)化研究。

在以釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶黑曲霉1∶1∶2為混合菌劑，接種量1.0%，添加1.0%尿素，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵48 h，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量為25.07%，與原來未經(jīng)處理前相比，提高了58.7%。粗纖維、粗淀粉、粗灰分均有大程度下降，尤其是粗纖維含量降低幅度較大，減少了58.2%，適口性到明顯改善。氨基酸總含量提高了1.08倍，必需氨基酸含量提高了95.9%，維生素B1、B2的比例也得到了提高，營養(yǎng)價值和風(fēng)味都得到了較大的改善。微生物指標(biāo)均符合國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的安全性。

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Optimization of microbial fermentation process to produce protein feed from kitchen waste

CAIJing,ZHANG Wenwei,YUNJianmin*,WU Jianzhen

(College of Food Science and Engineering,Gansu AgriculturalUniversity,Lanzhou 730070,China)

Using kitchen waste as raw material,Saccharomyces cerevisiae,Aspergillus niger and Bacillus subtilis as mixed fermentation starter,combining with orthogonaltest,the protein feed solid-state fermentation processing condition was optimized.The results showed thatthe optimum fermentation process was S.cerevisiae∶B.subtilis∶A.niger(1∶1∶2),inoculum 1.0%,urea addition 1.0%,temperature 30℃,time 48 h,and moisture 60%. Under these conditions,crude protein contentof fermentation productincreased 58.7%;the crude fiber,starch and ash content decreased;total amino acid content increased 1.08 times,in which the essential amino acid content increased 95.9%;vitamin B1,B2content significantly increased,and the microbialindexes metthe NationalFeed Hygiene Standards(GB/T5009.23—2006).

kitchen waste;mycoprotein;mixed-microbe fermentation;process optimization

TS264.2

A

0254-5071（2015）02-0114-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.026

2014-11-25

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201310733002）

蔡 靜（1992-），女，本科生，研究方向為發(fā)酵微生物。

*通訊作者：贠建民（1968-），男，教授，博士，研究方向為微生物發(fā)酵工程。