趙建勇，任水英

（國家農(nóng)副產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)中心（新疆），新疆 烏魯木齊 830011）

UPLC法同時(shí)檢測新疆葡萄酒中的7種單體酚

趙建勇，任水英

（國家農(nóng)副產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)中心（新疆），新疆 烏魯木齊 830011）

建立了一種測定葡萄酒中7種單體酚含量的超高效液相色譜（UPLC）檢測方法。采用ACQUITY BEH C18色譜柱，以甲醇/乙酸銨-乙酸緩沖溶液為流動相，0.2 mL/min梯度洗脫，變波長檢測，各化合物線性關(guān)系較好（R2＞0.993），不同的添加水平的回收率在84.0%～108.4%范圍，方法重復(fù)性較好（RSD≤6.08%）。該文利用UPLC法分析了不同地區(qū)、不同年份的葡萄酒中7種單體酚的含量，結(jié)果表明，葡萄酒中含有豐富的單體酚，單體酚的含量因酒樣含糖量、品牌、廠家和原料產(chǎn)地不同而差別很大。

UPLC；葡萄酒；單體酚

葡萄中的多酚化合物對果實(shí)的色澤、風(fēng)味以及葡萄酒的口感、營養(yǎng)價(jià)值都具有重要的作用，同時(shí)，多酚類化合物對一些嚴(yán)重危害人體健康的慢性疾病如肥胖、心臟病、癌癥等具有一定的治療或預(yù)防作用，在醫(yī)療、保健方面有著重要的利用價(jià)值[1-4]。所以對葡萄酒單體酚化合物的分析檢測具有重要的意義。

然而，現(xiàn)行的葡萄酒檢測標(biāo)準(zhǔn)中，并未制定出單體酚的限量指標(biāo)[5]及檢測方法[6]。由于缺乏特征性檢測指標(biāo)，當(dāng)今葡萄酒魚龍混雜，很多勾兌酒嚴(yán)重影響著消費(fèi)者的身心健康。為此，為了鑒別葡萄酒的真假，近年來許多學(xué)者對葡萄酒中酚類物質(zhì)的高效液相色譜分析方法進(jìn)行了研究[7-11]。而超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）不但縮短了分析時(shí)間，同時(shí)也提高了分離度。本研究建立了葡萄酒中7種單體酚的UPLC檢測方法，旨在探討“真假葡萄酒的特征性指標(biāo)群”，為真假葡萄酒的診斷和打假執(zhí)法提供可靠的方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10個(gè)葡萄酒樣品為本實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)用樣品，含糖量（分為干型、半干型、甜型）、商標(biāo)、廠家、原料產(chǎn)地均有不同。

咖啡酸、沒食子酸、兒茶素、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度98.5%）：美國Sigma公司；甲醇（色譜級）：美國Fisher公司；乙酸銨、乙酸（優(yōu)級純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；乙酸乙酯（分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity UPLCH-class超高壓液相色譜儀：美國Waters公司；電子天平（0.1 mg）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UPHW型優(yōu)普超純水凈化系統(tǒng)：成都超純科技有限公司；IKARRV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑配成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4℃冷藏避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL到50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，配成20μg/mL的混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃冷藏避光儲存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用超純水稀釋混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，質(zhì)量濃度分別為0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITYBEHC18（150 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相：A（0.01 mol/L乙酸銨-乙酸緩沖溶）和B（甲醇），流動相梯度洗脫見表1。流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：10μL；柱溫：30℃；波長：0～4.0 min，280 nm；4.0～7.0 min，320 nm；7.0～16.0 min，280 nm。

1.3.3 樣品前處理

稱取25 g（精確到0.01 g）混勻的葡萄酒，用25 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（＜40℃）濃縮近干后，甲醇∶水（4∶1，V/V）溶液定容5 mL，置于-4℃下避光保存，待液相分析用。進(jìn)樣前經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

前處理是分析檢測中一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)，直接影響著最終結(jié)果的準(zhǔn)確性。文獻(xiàn)中將樣品pH值調(diào)節(jié)到2.0[12]或者7.0[13-14]再萃取，或者直接萃取3種方法[15]。本實(shí)驗(yàn)對3種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，將pH值調(diào)節(jié)到7.0時(shí)，萃取速度緩慢，乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，延長了處理時(shí)間；未調(diào)pH的樣品和pH=2.0的樣品萃取速度相當(dāng)。將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后測試，發(fā)現(xiàn)同樣的條件下，pH=2.0的樣品基質(zhì)較多。故本實(shí)驗(yàn)選擇直接從樣品中萃取。由于目標(biāo)化合物均呈弱酸性，酒體本身也呈酸性（pH值約為4.0），可以使單體酚類物質(zhì)以分子狀態(tài)形式存在于酒體中，有利于有機(jī)相的萃取。

2.2 檢測波長的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器對7種單體酚進(jìn)行波長掃描，掃描波段為200～400 nm。結(jié)果表明，除兒茶素和咖啡酸兩種化合物最大吸收波長在320 nm之外，另外5種目標(biāo)化合物在波長280 nm條件下均有較好的響應(yīng)值，故本實(shí)驗(yàn)采用變波長掃描。在兒茶素和咖啡酸流出時(shí)間段掃描波長定在320 nm，其他分析時(shí)間檢測波長均為280 nm。

2.3 流動相的選擇

考察了常用的甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相，發(fā)現(xiàn)在此溶液洗脫時(shí)，保留時(shí)間存在著漂移，再現(xiàn)性不好。本實(shí)驗(yàn)將流動相改為甲醇/乙酸銨-乙酸緩沖溶液（pH=3.45），克服了pH值變化帶來的影響，保留時(shí)間重現(xiàn)性好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)曲線

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品在確定的色譜條件下進(jìn)行測試，得到7種混標(biāo)以及樣品的色譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，各組分分離效果好。

將5水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，根據(jù)質(zhì)量濃度（X）和峰面積（Y）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，7種目標(biāo)化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)如表2所示，由表2可知，各化合物線性關(guān)系良好（R2＞0.993），儀器檢出限低，此方法能滿足定量分析的要求。

2.5 方法的回收率和檢出限

對樣品按照1.3.3前處理方法方法進(jìn)行前處理，按照1.3.2色譜條件上機(jī)測試，每個(gè)水平平行分析2次，計(jì)算本方法的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，各化合物在不同的添加水平都得到了較滿意的回收率（84.0%～108.4%）和較好的方法重復(fù)性（RSD≤6.08%）。

2.6 樣品分析

從市場上抽取10個(gè)樣品，采用本方法對樣品進(jìn)行處理、分析，其單體酚含量測定結(jié)果見表4。

從表4可知，10種樣品中均含有豐富的單體酚，但不同樣品中單體酚含量差別很大，尤其是沒食子酸和兒茶素；單體酚的含量受酒樣的品牌和生產(chǎn)地域影響較大，這可能是釀酒原料葡萄及釀造工藝的不同所致。

3 結(jié)論

建立了葡萄酒中7種單體酚的UPLC檢測分析方法，以ACQUITY BEH C18色譜柱作為分離柱，以甲醇/乙酸銨-乙酸緩沖溶液（pH=3.45）為洗脫液，克服了pH值變化帶來的影響，各目標(biāo)化合物分離效果良好，在不同的添加水平都得到了較滿意的回收率（84.0%～108.4%）和較好的方法重復(fù)性（RSD≤6.08%）。樣品分析結(jié)果顯示，葡萄酒中含有豐富的單體酚，各單體酚含量差異很大。葡萄酒中的含糖量、原料產(chǎn)地、釀造方式都會影響單體酚的含量。

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Determination of 7 mono-phenols in Xinjiang wines by UPLC

ZHAO Jianyong,RENShuiying

(National Quality Supervision Test Center of Agricultural Byproducts(Xinjiang),Urumqi 830011,China)

A UPLC method was developed for determining 7 mono-phenols in wines.The chromatographic separation was performed on an ACQUITY BEH C18column eluted with mobile phase of methanol/ammonium acetate-acetic acid mixture ata flow rate of 0.2 ml/min.The detection wavelength was variable with the change ofmaximum wavelength.The calibration curves of7 mono-phenols were linear with correlation coefficients more than 0.993,recovery rate 84.0%-108.4%,and the method repeatability was good(RSD≤6.08%).Differentaging times and different geographical origins of wine were determined.The results showed thatwine was rich in mono-phenols,and their contents were distinct with the difference of sugarcontent,brand,producer and geographicalorigins of raw materials.

UPLC;wine;mono-phenol

TQ201

A

0254-5071（2015）02-0139-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.031

2014-12-29

國家質(zhì)檢總局科研計(jì)劃項(xiàng)目（2011QK385）

趙建勇（1973-），男，工程師，碩士研究生，主要從事食品檢驗(yàn)工作。