崔鶴清楊>驊 宋洪美 王忠明

1.蚌埠醫(yī)學(xué)：附屬連云港醫(yī)院放療科，江蘇連云港222000；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科，江蘇南京210000

腫瘤缺氧微環(huán)境中外泌體的研究進展

崔鶴清1楊>驊2宋洪美1王忠明1

1.蚌埠醫(yī)學(xué)：附屬連云港醫(yī)院放療科，江蘇連云港222000；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科，江蘇南京210000

缺氧可以導(dǎo)致腫瘤的適應(yīng)性更強、惡性程度更高以及耐藥性，外泌體在其中發(fā)揮了重要作用。外泌體是從胞內(nèi)體脫落下來的小囊泡，主要作用是運送細胞之間的生物活性分子。缺氧會導(dǎo)致外泌體分泌顯著增加，而外泌體中的核酸和蛋白質(zhì)通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮一系列作用，包括腫瘤異質(zhì)化、改變免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細胞、促進血管生成和轉(zhuǎn)移等。此外，研究發(fā)現(xiàn)外泌體的內(nèi)容物類似于來源的細胞，意味著如果把它們視為適宜的缺氧狀態(tài)標志物就能夠通過微創(chuàng)過程進行腫瘤的診斷和預(yù)后。因此，研究缺氧微環(huán)境中的外泌體可能會開拓癌癥治療的新思路。

腫瘤微環(huán)境；外泌體；缺氧；MicroRNAs；蛋白質(zhì)

許多因素都參與形成和維持腫瘤微環(huán)境，包括缺氧、不同種系的細胞、可溶性因子、信號分子、細胞外基質(zhì)及外泌體等等。這些因素共同作用使腫瘤細胞躲避宿主免疫、提高治療抵抗性并形成轉(zhuǎn)移生態(tài)位。越來越多的證據(jù)表明，缺氧微環(huán)境在腫瘤進展過程中具有重要作用[1-2]。缺氧微環(huán)境中的癌細胞可以通過多種細胞機制使自身適應(yīng)所處環(huán)境，因此具備更強的生存能力、侵襲性，更容易遠處轉(zhuǎn)移，并且對非手術(shù)治療的抵抗力更強，從而降低了腫瘤的治療效果[3-4]。

1 腫瘤缺氧微環(huán)境

缺氧原因具有復(fù)雜的空間多樣性和時間多樣性，根據(jù)形成機制及持續(xù)時間分為慢性缺氧與急性缺氧兩種主要類型。慢性缺氧主要是由于擴散障礙，往往是很多因素如擴散距離的增加、不利于擴散的幾何形狀、低氧血癥、灌注不足或血流中斷等共同作用導(dǎo)致。急性缺氧的主要原因是突然性、暫時性血流灌注中斷或減少、紅細胞數(shù)量改變等[5-6]。

研究發(fā)現(xiàn)，氧分壓降低會激活癌細胞中的乏氧誘導(dǎo)因子（HIF）以調(diào)節(jié)初級轉(zhuǎn)錄適應(yīng)缺氧[7]。已知HIF是由受氧分壓調(diào)節(jié)的HIF-α亞單位（HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α）和不±賴氧張力的HIF-1β亞單位組成。HIF-α亞單位通過堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域與HIF-1β聚合形成異源二聚體，從而識別并結(jié)合基因組中的低氧反應(yīng)元件（HRE）[8-9]。其中HIF-1α能夠在幾乎所有細胞中檢測到，而HIF-2α僅在特定的細胞類型例如血管內(nèi)皮細胞中表達。兩者不僅功能互不重疊，而且它們的表達在急性缺氧和慢性缺氧狀態(tài)下受到差異性調(diào)節(jié)[10]。目前對HIF-3α的功能了解甚少。已有研究充分證明，HIF是缺氧狀態(tài)下的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它們可以通過調(diào)節(jié)有氧糖酵解來滿足癌細胞的生物合成需求來適應(yīng)缺氧[11]。此外，HIF可以通過激活下游靶點如血管內(nèi)皮生長因子和促紅細胞生成素的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)血管生成、細胞生長增殖、凋亡、黏附和代謝[12]。

2 外泌體

外泌體是大小在30～120 nm的小囊泡，囊腔由膜蛋白組成的脂質(zhì)雙層包繞蛋白質(zhì)和核酸形成，由于來源于細胞類型和組織不同而具有差異性[13]，如B細胞、T細胞[14]、肥大細胞、樹突細胞[15]、內(nèi)皮細胞[16]以及腫瘤細胞[17]，在體液如外周血、腹水、尿液、羊水、腦脊液及唾液等中均能檢測出[18-19]。

外泌體的重要特點是含有大量核酸包括MicroRNAs（miRNAs）和mRNA、線粒體DNA（mtDNAs）、Piwi-RNA（piRNAs）、非編碼RNA（lncRNAs）、核糖體RNA（rRNA）、小核RNA（snRNAs）、核仁小分子RNA（snoRNAs）和轉(zhuǎn)運RNA（tRNAs）[20]等。由于來源于胞內(nèi)體，外泌體含有胞內(nèi)分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體（ESCRT）如TSG101、Alix以及涉及運輸和融合的蛋白如Rab11、Rab7、Rab2和各種膜聯(lián)蛋白。而外泌體內(nèi)部或表面表達的標志物包括跨膜四超家族（CD81、CD63、CD9）、熱休克蛋白（HSC70、HSP90）和細胞骨架蛋白（肌動蛋白、微管蛋白和膜突蛋白）[21-23]等。對多種正常細胞來源和腫瘤來源的外泌體的分子特征研究后發(fā)現(xiàn)，外泌體表面的細胞特異性抗原及腫瘤相關(guān)抗原的大量表達。

3 腫瘤缺氧微環(huán)境中的外泌體

一般來說，腫瘤微環(huán)境中的外泌體可以通過蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA調(diào)節(jié)細胞間通訊，導(dǎo)致瘤內(nèi)異質(zhì)性和免疫應(yīng)答改變、產(chǎn)生腫瘤相關(guān)成纖維細胞、使血管增多并促進轉(zhuǎn)移進而顯著影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

急性缺氧缺血性腦中風后高水平的血小板衍生微?？梢猿掷m(xù)6個月，可以推測外泌體與缺氧密切相關(guān)。Park等[24]發(fā)現(xiàn)，輕度缺氧（1%O2）不足以誘導(dǎo)細胞凋亡，但可以誘導(dǎo)人肺癌細胞株A549釋放外泌體，通過內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的趨化吸引并刺激基質(zhì)細胞釋放促血管生成因子幫助血管生成。研究缺氧的表皮樣癌細胞來源的外泌體，發(fā)現(xiàn)A431的雞胚絨毛尿囊膜試驗中血管生成和轉(zhuǎn)移同樣增強[25]。隨后有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）、乳腺癌、白血病、前列腺癌（PCA）和多發(fā)性骨髓瘤中均與缺氧密切相關(guān)[26]?？傊瑏碓从谌毖跄[瘤細胞的外泌體中含有不同的蛋白質(zhì)和核酸，被相鄰的癌細胞或內(nèi)皮細胞接收后激活各種信號通路，促進血管生成、腫瘤侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。

3.1 缺氧與外泌體核酸

腫瘤微環(huán)境中的缺氧因素可以通過影響外泌體中某些miRNAs分泌促進不同腫瘤的血管管腔生成，其中HIF-1作為重要的乏氧誘導(dǎo)因子代表了腫瘤微環(huán)境缺氧的水平。研究缺氧時分泌的外泌體中與腫瘤血管生成相關(guān)的miRNAs時，較多選擇缺氧時細胞外的控制基因miR-16、miR-18b、miR-135b及缺氧調(diào)控的miR-210。

King等[27]在乳腺癌模型中發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α激活能夠促進外泌體釋放，最終形成侵襲性的細胞表型；同時發(fā)現(xiàn)缺氧處理后細胞中miR-210水平顯著增高，而在缺氧外泌體的RNA樣本中miR-210增高更加明顯。把miR-210標準化為miR-16時，給予同種程度的缺氧誘導(dǎo)，差異明顯變小。Tadokoro等[28]在白血病模型中發(fā)現(xiàn)，缺氧狀態(tài)下來源于K592細胞的外泌體促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的管腔形成。用缺氧及常氧狀態(tài)下培養(yǎng)24 h后的K592細胞的外泌體制作的miRNAs表達圖譜表明，miR-18b和miR-210在缺氧狀態(tài)下的細胞和外泌體中均屬于前十位的上調(diào)miRNAs。進一步的研究證實，外泌體來源的miR-210下調(diào)臍靜脈內(nèi)皮細胞中EFNA3的表達。因此可以推斷miR-210作為缺氧反應(yīng)的信號經(jīng)由外泌體傳送到內(nèi)皮細胞，并誘發(fā)常氧狀態(tài)下臍靜脈內(nèi)皮細胞的血管生成。研究耐缺氧多發(fā)性骨髓瘤細胞（HR-MM）也證明了這一推斷，Umezu等[29]發(fā)現(xiàn)對于常氧和缺氧狀態(tài)下的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，HR-MM來源的外泌體均能劑量±賴性地促進管腔形成。來源于不同亞系的HR-MM細胞和外泌體的miRNAs表達譜顯示，miR-210在急性缺氧和缺氧抵抗的所有細胞系中均上調(diào)。動力學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，miR-210是一個瞬時表達的非特異性缺氧反應(yīng)性miRNAs，而miR-135b是一個持續(xù)表達的HR-MM細胞特異性的miRNAs。計算機模擬分析證明外泌體（外源性）的miR-135b與FIH-1 3＇-UTR相互作用，從而抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的翻譯。試驗還表明，HR-MM的外泌體miR-135b通過抑制FIH-1來促進HIF-1轉(zhuǎn)錄的過程并不±賴于臍靜脈內(nèi)皮細胞的氧含量。除了上述miRNAs，Kucharzewska等[30]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中發(fā)現(xiàn)一些外泌體的組分如IGFBP3、NDRG1、LOX和ADM在mRNA水平上受缺氧調(diào)控，它們同樣對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及調(diào)控腫瘤血管細胞的缺氧±賴性活化具有重要作用。

腫瘤缺氧還能通過促進某些外泌體的miRNAs分泌影響腫瘤整體的發(fā)生、發(fā)展和疾病轉(zhuǎn)歸。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）活化后通過促進分化以及PPARγ配體在一些人類腫瘤細胞株中抑制細胞生長、增加凋亡，從而阻礙如結(jié)腸癌、乳腺癌、PCA和肺癌等組織的致瘤性轉(zhuǎn)化。Papi等[31]發(fā)現(xiàn)，MCF7來源的外泌體能夠調(diào)節(jié)乳腺癌干細胞（CSCs）的形成，而它誘導(dǎo)間質(zhì)細胞的活化則±賴于PPARγ的活性。相較于常氧狀態(tài)，在來源于缺氧狀態(tài)MCF7細胞的外泌體中受PPARγ調(diào)節(jié)的miR27b和miR130b水平更高。表明缺氧微環(huán)境中外泌體的miRNAs不僅能夠影響腫瘤干細胞進而決定腫瘤細胞的存活、增殖和轉(zhuǎn)移，還能夠通過間質(zhì)細胞調(diào)節(jié)腫瘤的免疫抑制、血管生成、遠處轉(zhuǎn)移等。除了miRNAs，還在外泌體中發(fā)現(xiàn)了高水平的載脂蛋白E（ApoE）和碳酸酐酶Ⅸ（CAⅨ），它們受PPARα/HIF-1α相互作用的調(diào)控并被PPARγ的活化抑制，可以推測它們受缺氧影響也參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡等。

來源于缺氧腫瘤細胞的外泌體核酸在腫瘤缺氧微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，在研究外泌體信息傳遞時不能忽視它們。但是目前大多數(shù)研究僅集中在外泌體分泌的核酸本身，幾乎沒有研究關(guān)注缺氧對其的影響。而且不確定常氧條件下的結(jié)果是否與缺氧條件下一致，比如研究表明正常組織細胞惡性轉(zhuǎn)化改變一些既定通路然后改變了外泌體釋放的miRNAs，暗示了惡性轉(zhuǎn)化受細胞來源的特殊miRNAs介導(dǎo)改變通路，而對于缺氧狀態(tài)下miRNAs是否存在這種作用尚不清楚。因此，應(yīng)該對缺氧誘導(dǎo)的外泌體核酸進行更多研究。

3.2 缺氧與外泌體蛋白質(zhì)

腫瘤缺氧時，外泌體的另一個主要成分——蛋白質(zhì)能夠通過結(jié)合一些細胞表面黏附分子如E-鈣黏蛋白、L-選擇蛋白和血小板/內(nèi)皮細胞黏附分子1等對腫瘤細胞的遷移起重要的調(diào)節(jié)作用，并且能使細胞信號激酶磷酸化從而調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)。Gutwein等[32]發(fā)現(xiàn)，給予穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人類L1的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞（CHO-HL1）凋亡誘導(dǎo)劑可以顯著促進外泌體釋放L1且細胞凋亡誘導(dǎo)L1裂解。研究還表明，缺氧也能夠促進腫瘤細胞凋亡，進而增加外泌體釋放溶解性L1，L1裂解片段通過結(jié)合細胞表面黏附分子及刺激磷酸化作用而觸發(fā)細胞遷移和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）的磷酸化，外泌體釋放的金屬蛋白酶ADAM10和ADAM17在此過程中具有調(diào)節(jié)作用。有研究[33]發(fā)現(xiàn)缺氧時GBM的微泡（MVs）能夠通過促進位于內(nèi)皮細胞表面的PAR-2表達，顯著誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化并大幅度提高肝素結(jié)合性類表皮生長因子（HB-EGF）mRNA的表達從而促進血管生長，并阻礙缺氧時內(nèi)皮細胞小管的分解。已知MVs是細胞分泌產(chǎn)生的膜囊泡，包括外泌體。因此可以推測腫瘤缺氧時也可以通過外泌體分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)生促血管作用。類似的研究是Kucharzewska等[30]證明缺氧時外泌體在GBM細胞通過缺氧±賴性的旁分泌和自分泌刺激血管生成過程中具有調(diào)節(jié)作用，并促進內(nèi)皮細胞細胞旁分泌對血管生成的刺激。此外還發(fā)現(xiàn)，缺氧GBM細胞釋放的外泌體富含多種與腫瘤侵襲性有關(guān)的蛋白質(zhì)，并且外泌體囊泡的分子譜很大程度上反映了GBM細胞和腫瘤的氧合狀態(tài)，其中白細胞介素（IL）-8和IGFBP3是序列試驗中缺氧正調(diào)節(jié)最明顯的外泌體蛋白質(zhì)。這表明腫瘤細胞外泌體的蛋白質(zhì)不僅影響腫瘤的侵襲性，其分子譜某種程度上可以反映微環(huán)境的缺氧水平。

腫瘤缺氧微環(huán)境中，外泌體的蛋白質(zhì)可以通過促進腫瘤細胞的運動和侵襲、提高癌細胞的干性、提高前列腺成纖維細胞中腫瘤相關(guān)成纖維細胞表型等影響腫瘤的生長、浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移。Ramteke等[34]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，在缺氧狀態(tài)下，PCA分泌的外泌體中跨膜四超家族CD81和CD63水平更高，代表具有更強的遠處轉(zhuǎn)移能力；此外，熱休克蛋白HSP70、HSP90以及AnnexinⅡ水平提高而Alix水平下降，表示更強的腫瘤惡性程度及預(yù)后更差。已知腫瘤微環(huán)境中外泌體內(nèi)的多種細胞因子、生長因子和信號分子在細胞間通訊及腫瘤生長和進展過程中發(fā)揮重要作用，與常氧時比較，缺氧PCA外泌體中轉(zhuǎn)化生長因子-b2、腫瘤壞死因子-1α、IL-6、Akt、整合素連接激酶（ILK1）和連環(huán)蛋白以及胞內(nèi)體分選和運輸過程中的關(guān)鍵蛋白——腫瘤易感基因101的水平明顯更高。此外，從頭測序表明，缺氧狀態(tài)下的外泌體具有更多與不同信號通路有關(guān)的蛋白質(zhì)。據(jù)此可以推測腫瘤缺氧微環(huán)境中，腫瘤外泌體通過蛋白質(zhì)改變了信號分子和信號通路對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響。并且經(jīng)缺氧狀態(tài)下外泌體處理后PC3細胞細胞膜上的E-鈣黏蛋白表達降低，這說明缺氧外泌體的蛋白質(zhì)對細胞間的黏附連接具有影響同樣存在于PCA中。

另一個重要發(fā)現(xiàn)，腫瘤外泌體中的HIF-1α有利于侵襲。Aga等[35]發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌細胞外泌體中的LMP1上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的內(nèi)源性表達，它與CD63陽性的晚期胞內(nèi)體有關(guān)，并維持DNA結(jié)合活性，在受體細胞中轉(zhuǎn)錄活>。功能性運動實驗發(fā)現(xiàn)，LMP1陽性的外泌體可以提高鼻咽癌細胞的遷移能力和侵襲能力。此結(jié)果表明，HIF-1α也許是在缺氧腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞外泌體作用的關(guān)鍵點。

Rab蛋白是在囊泡形成、運輸和膜融合過程中起關(guān)鍵作用的膜結(jié)合GTP酶，隨患者生存率降低出現(xiàn)過表達，這表明Rab與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。Wang等[36]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌缺氧導(dǎo)致MV增多和Rab22A表達增加，并且具有HIF±賴性，還進一步證明，缺氧誘導(dǎo)MV形成需要Rab22A的表達，并且Rab22A±賴性地直接作用于細胞以改變細胞骨架，從而促進黏著斑形成、細胞外基質(zhì)侵襲和肺轉(zhuǎn)移。Rab22A缺乏則減少乳腺癌細胞的侵襲和自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移。據(jù)此能夠推測Rab蛋白可以調(diào)控腫瘤微環(huán)境中缺氧因素對腫瘤外泌體產(chǎn)生的影響。

由于外泌體包含的蛋白質(zhì)眾多，腫瘤細胞分泌的外泌體在腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的具體機制和關(guān)鍵因子，還需要進一步研究。

4 小結(jié)

缺氧是腫瘤微環(huán)境一個重要的組成部分。外泌體根據(jù)不同的來源具有差異性，是缺氧刺激下最重要的腫瘤促進因子之一，它通過影響周圍的腫瘤微環(huán)境來影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，在缺氧狀態(tài)下，不同腫瘤細胞來源外泌體中的核酸和蛋白質(zhì)等通過不同的機制對腫瘤存在的微環(huán)境、促進血管生成、侵襲、浸潤及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響。這些研究深入探討了外泌體的內(nèi)容物，還揭示了外泌體成分如何在支持免疫治療的臨床應(yīng)用方面發(fā)揮作用。在缺氧腫瘤細胞的腫瘤微環(huán)境中HIF-1α也許是外泌體作用的關(guān)鍵點，而這一作用或許受到Rab蛋白影響。此外缺氧條件下的外泌體分子譜能夠反映腫瘤的缺氧狀態(tài)，這意味著未來可以把外泌體當作細胞表型的復(fù)合標志物，以代表缺氧導(dǎo)致的藥物和放射抵抗特征?？傊鳛槟[瘤進展過程中不可忽略的一部分，腫瘤缺氧微環(huán)境中的外泌體值得更深入研究，或許能為腫瘤的臨床診治開辟新的方向。

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Progress of exosomes in tumor hypoxia microenvironment

CUI Heqing1YANG Yuehua2SONG Hongmei1WANG Zhongming1
1.Department of Radiotherapy,Lianyungang Hospital Affiliated to Bengbu Medical College,Jiangsu Province, Lianyungang222000,China;2.Department of Radiotherapy,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Jiangsu Province,Nanjing210000,China

Hypoxia could lead to stronger ability to adapt,higher degree of malignancy and drug resistance in tumors, exosomes play an important role in this progress.Exosomes are vesicles derived from the endosomes,and contribute to transporting bioactive molecules in cellular level mainly.Significantly increased secretion of exosomes in hypoxia condition has been proved,exsomes play a role in tumor microenvioronment due to internal nucleic acid and proteins which act as transmission signals,and result in intratumour heterogeneity,changing immunological responses,producing cancer associated fibroblasts,promoting angiogenesis and metastasis.Exosomes content similar to the original cell has been reported,it indicates if they are deemed appropriate hypxia markers,tumor diagnosis and prognosis could be implementedthroughaminimallyinvasiveprocedure.Therefore,thestudyofexosomesinhypoxiatumor microenvironment might expand a new way in cancer treatment.

Tumor microenvironment;Exsomes;Hypoxia;MicroRNAs;Protein

R730.5

A

1673-7210（2015）07（c）-0026-05

2015-03-19本文編輯：李亞聰）

王忠明（1970.12-），男，南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)：臨床腫瘤學(xué)2012級在讀博士研究生，教授，蚌埠醫(yī)學(xué)：附屬連云港醫(yī)院放療科主任；研究方向：放射治療敏感性的個體化研究。