陳穎

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

信號放大策略在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

陳穎

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

近年來，快速、簡單、靈敏的生物分子檢測在臨床診斷、食品分析、生物恐怖主義的防御和環(huán)境監(jiān)測等方面變得日益重要。電化學(xué)生物傳感器由于具有簡單、靈敏、成本低并可廣泛運(yùn)用于不同領(lǐng)域的固有優(yōu)勢而受到越來越多的關(guān)注。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏的生物檢測，不同信號放大方法被用于傳感器的構(gòu)建中。該文簡單介紹了電化學(xué)生物傳感器的基本原理，并重點(diǎn)概括了廣泛運(yùn)用于電化學(xué)生物傳感器中的信號放大策略。

電化學(xué)；生物檢測；信號放大策略

0 引言

電化學(xué)生物傳感器是將生物分子作為目標(biāo)物識別敏感元件固定于電極表面，生物分子間的特異性識別作用通過電極進(jìn)行信號轉(zhuǎn)換，以電阻、電位、電流或電容等物理量形式作為特征檢測信號輸出，從而完成對目標(biāo)物的定性或者定量分析任務(wù)的一類裝置。依據(jù)傳感器輸出特征物理信號所產(chǎn)生方式的不同，電化學(xué)生物傳感器一般可歸為生物催化型和親和型傳感器兩個(gè)大類：前者感受器部位元件采用能特異性識別目標(biāo)分子的酶、細(xì)胞或組織等并催化底物生成電活性物質(zhì)；后者則是基于生物識別元件與目標(biāo)分子間的特異性結(jié)合作用，例如抗原-抗體、適體-目標(biāo)分子、生物素-親和素之間及DNA堿基互補(bǔ)配對等相互作用。電化學(xué)生物傳感器性能的好壞可以通過傳感器的動力學(xué)線性范圍、檢測限、重現(xiàn)性、選擇性及響應(yīng)時(shí)間等參數(shù)來評估。

1 信號放大策略在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

臨床診斷中對痕量及超痕量生物分子檢測的要求使得科研工作者致力于提高傳感器靈敏度的研究，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展以及多種生物技術(shù)的興起，學(xué)科間進(jìn)一步交叉滲透融合，各種信號放大方法相繼出現(xiàn)并成功運(yùn)用于生物分析，電化學(xué)生物傳感器的靈敏度不斷提高，甚至達(dá)到單分子檢測水平。下面就各類近年來廣泛運(yùn)用的信號放大策略分別作簡要介紹。

1.1 酶催化放大技術(shù)

酶(enzyme)是一類由生命體產(chǎn)生的具有生理調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)，參與機(jī)體代謝及各種轉(zhuǎn)化反應(yīng)，特定的酶只對特定底物發(fā)生高效的催化作用，酶的這種專一性在一定程度上確保了傳感器的選擇性，其高效性也對靈敏度有所貢獻(xiàn)。在生物分析中，通常將酶作為標(biāo)記物間接指示目標(biāo)分子濃度，常用標(biāo)記酶有堿性磷酸酯酶(ALP)、辣根過氧化物酶(HRP)及葡萄糖氧化酶(GOD)等。此外，酶催化法一般要與納米材料放大技術(shù)聯(lián)用，借助其大比表面積實(shí)現(xiàn)酶的大量固載，并通過其優(yōu)良的導(dǎo)電性促進(jìn)電子傳遞，進(jìn)一步提高酶對底物的轉(zhuǎn)化率，以達(dá)到增強(qiáng)靈敏度的目的。根據(jù)酶的催化作用所產(chǎn)生變化的區(qū)別，酶催化放大信號主要通過以下兩種途徑：酶催化產(chǎn)物沉積法和多酶催化底物循環(huán)增強(qiáng)法。

酶催化產(chǎn)物沉積法是指酶催化形成不溶于水的有機(jī)物附著于電極表面，使得傳感界面性質(zhì)發(fā)生改變，通過電化學(xué)阻抗譜、循環(huán)伏安法、計(jì)時(shí)電位法等技術(shù)進(jìn)行檢測的一類分析方法。Akter等[1]使用碳納米管固載HRP作為二抗標(biāo)記物，一抗固定在碳納米管/納米金復(fù)合材料表面，通過夾心免疫法捕獲目標(biāo)抗原繼而結(jié)合二抗，二抗標(biāo)記物HRP催化底物4-氯-1萘酚生成難溶性沉淀附著于電極表面，阻礙電子傳輸，電流信號減小，實(shí)現(xiàn)對前列腺抗原PSA的高靈敏分析，并成功運(yùn)用于人血清實(shí)際樣品的檢測(圖1)。Wang等[2]同樣利用HRP對底物的催化作用，由于底物轉(zhuǎn)化與過氧化氫濃度相關(guān)，通過生成不同量有機(jī)產(chǎn)物對CdS量子點(diǎn)的電致化學(xué)發(fā)光淬滅作用的差別構(gòu)建了過氧化氫傳感器。

圖1 基于多酶催化的PSA免疫傳感器原理示意圖[1]Fig.1 Schematic illustrations of the multiple-HRP strategy-based PSA immunosensor[1]

將酶作為信號標(biāo)記物，通過檢測酶在催化反應(yīng)中產(chǎn)生的催化電流也可指示目標(biāo)分子的濃度。Caruana等[3]在微電極上電沉積一層高聚物充當(dāng)電子媒介并固定捕獲探針，與標(biāo)記了HRP的目標(biāo)序列互補(bǔ)雜交后，檢測HRP對H2O2的電化學(xué)還原催化電流即可實(shí)現(xiàn)對特異性DNA的分析。研究表明通過多種酶催化電活性物質(zhì)的氧化還原循環(huán)體系可以有效增強(qiáng)電流響應(yīng)信號[4-6]，也就是之前提到的多酶催化底物循環(huán)增強(qiáng)法，該方法可以顯著提高傳感器的靈敏度。Xiang等[7]通過ALP和輔酶對底物的催化產(chǎn)生增強(qiáng)的氧化還原循環(huán)電流信號構(gòu)建凝血酶傳感器(圖2)。

1.2 納米材料放大技術(shù)

酶放大技術(shù)受到酶活性等因素影響，一般穩(wěn)定性差且成本高，因此研究不同類型的功能化納米材料(如金屬納米材料、量子點(diǎn)、碳納米材料、磁性納米材料、高分子聚合物等)在生物傳感器中的運(yùn)用近年來備受關(guān)注。由于其優(yōu)良的生物相容性、高的比表面積、良好的化學(xué)穩(wěn)定性、催化性能及導(dǎo)電性等，納米材料能大大提高傳感器的分析性能，有效放大檢測信號，并具有穩(wěn)定識別探針或生物傳感界面的作用。

納米材料可以作為電極材料使用，在通過不同分析原理構(gòu)建高性能電化學(xué)傳感平臺以檢測目標(biāo)分子中發(fā)揮著重要的作用。Yang等[8]通過一步電化學(xué)法合成了石墨烯/聚黃尿酸納米復(fù)合材料作為DNA捕獲探針固載材料，用電化學(xué)阻抗法實(shí)現(xiàn)了高靈敏DNA檢測。他們還合成了磺化聚苯胺/石墨烯復(fù)合材料，作為一種新型電極材料，通過其直接電化學(xué)達(dá)到檢測DNA[9]的目的。與此類似的策略也報(bào)道用于構(gòu)建基于水溶性電活性染料偶氮紅功能化石墨烯的免標(biāo)記電化學(xué)DNA生物傳感器[10]。此外，其他材料，例如汞膜/碳納米管[11]或生物兼容性好的納米結(jié)構(gòu)的氧化鎂/殼聚糖膜[12]等也用作先進(jìn)電極材料構(gòu)建高性能電化學(xué)生物傳感器。

圖2 雙重信號放大凝血酶傳感器原理示意圖[7]Fig.2 Illustration of the dual amplifed protocol for ultrasensitive thrombin detection[7]

圖3 協(xié)同放大信號的DNA傳感器原理示意圖[13]Fig.3 Schematic illustrations of the cooperative amplifcation-based genosensor[13]

以金納米顆粒和碳納米材料為代表的各種納米材料作為大量酶、寡核苷酸及氧化還原探針等信號分子的優(yōu)良載體廣泛使用。Qiu等[13]采用納米金為信號分子載體，發(fā)夾形DNA為捕獲探針，該探針莖部含有限制性內(nèi)切酶(EcoRI)特異性識別位點(diǎn)。如圖3所示，由于EcoRI酶的高效高保真性，只有在目標(biāo)物不存在時(shí)才會在發(fā)夾形捕獲探針莖部的識別位點(diǎn)發(fā)生催化剪切反應(yīng)，降低背景信號。目標(biāo)物存在時(shí)可以通過雜交打開發(fā)夾形捕獲探針，引起剪切位點(diǎn)變形，迫使生物素標(biāo)記遠(yuǎn)離電極表面，通過生物素-鏈霉親和素特異性結(jié)合作用捕獲修飾了大量二茂鐵(Fc)信號探針的納米金顆粒以產(chǎn)生信號。此外，F(xiàn)c可以通過與經(jīng)EcoRI酶處理過的捕獲探針殘基雜交拉近與電極表面的距離，促進(jìn)界面電子傳遞，進(jìn)一步增強(qiáng)信號。該傳感器實(shí)現(xiàn)了檢測限低至zeptomole級的超靈敏分析，且具有7個(gè)數(shù)量級的寬動態(tài)范圍。Wang等[14]在納米金表面修飾了兩種DNA信號探針：一種與目標(biāo)序列互補(bǔ)，另一種非互補(bǔ)，該非互補(bǔ)探針的存在可以降低目標(biāo)DNA和修飾于納米金上的互補(bǔ)探針之間的交叉反應(yīng)，從而提高該夾心DNA傳感器的靈敏度。

新近發(fā)展的一些納米材料可通過自身大量的信號物質(zhì)直接用作電活性標(biāo)記物，結(jié)合有效測定納米標(biāo)記物的方法，可以輕松構(gòu)建超靈敏的電化學(xué)生物分析策略。較為典型的代表是量子點(diǎn)，這種準(zhǔn)零維納米材料具有優(yōu)越的光學(xué)和電化學(xué)特性，可直接檢測其熒光或電致化學(xué)發(fā)光信號，也可通過酸溶解后檢測其金屬離子的伏安峰，因此被廣泛運(yùn)用于光學(xué)和電化學(xué)生物分析中。早期的研究工作中，一般將量子點(diǎn)作為單個(gè)信號標(biāo)記物直接修飾生物分子[15-17]， 靈敏度有限，而后發(fā)展的使用碳納米管、石墨烯等載體原位生成或共價(jià)鍵合量子點(diǎn)的方法[18-20]可以有效降低ECL發(fā)光電位且提高信號分子固載量，該復(fù)合物在傳感器構(gòu)建過程中充當(dāng)電極材料或信號標(biāo)記物顯著降低了分析檢測限。Jie等[21]合成了一種樹枝狀的量子點(diǎn)納米簇，借助碳納米管/納米金的協(xié)同放大作用和金磁納米易于分離富集的特點(diǎn)，通過夾心模式構(gòu)建傳感器可顯著放大ECL和電化學(xué)信號，分別實(shí)現(xiàn)了對DNA的ECL分析和癌細(xì)胞的電化學(xué)分析(圖4)。

圖4 (A)樹枝狀QDs納米簇-DNA復(fù)合物的制備，(B)ECL DNA傳感器構(gòu)建原理示意圖,和(C)基于金磁納米的電化學(xué)癌細(xì)胞傳感器原理示意圖[21]Fig.4 (A)Preparation of the dendrimer nanoclusters/QDs-DNA probe,(B)fabrication of the ECL biosensor for DNA detection,and(C)electrochemical detection of cancer cells based on the Fe3O4@Au-aptamer[21]

使用具有酶催化活性的納米材料也是電化學(xué)生物傳感器中放大信號的新方法。Zhang等[22]構(gòu)建了一個(gè)基于納米金自催化生長為導(dǎo)電橋梁放大檢測DNA雜交的高靈敏帶隙-電化學(xué)生物傳感器。如圖5所示，目標(biāo)DNA存在時(shí)，與捕獲探針雜交形成dsDNA，由于靜電作用不能吸附到納米金表面，此時(shí)的納米金具有葡萄糖氧化模擬酶的催化活性，納米金在葡萄糖和氯金酸底液中經(jīng)自催化作用增大半徑尺寸，致使納米金最終生長形成金膜，導(dǎo)電性顯著提高。相反，沒有目標(biāo)物存在時(shí)，單鏈DNA捕獲探針通過核苷酸堿基-金相互作用吸附于納米金表面，使其催化活性完全鈍化。

圖5 基于納米金自催化生長作為導(dǎo)電橋梁的帶隙-電化學(xué)DNA傳感器原理示意圖[22]Fig.5 Schematic diagram of the gap-electrical biosensor strategy based on self-catalytic growth of unmodifed AuNPs as conductive bridges for DNA hybridization detection[22]

歸納而言，納米材料主要通過四種方式實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分子的放大分析：(1)利用納米材料構(gòu)建電極傳感界面具有的優(yōu)越導(dǎo)電性及生物相容性，降低電化學(xué)反應(yīng)能壘，增強(qiáng)響應(yīng)信號；(2)利用納米材料的大比表面積增加電活性物質(zhì)、催化活性酶或仿酶(模擬酶)的固載量，從而放大響應(yīng)信號；(3)利用納米材料自身產(chǎn)生的特征峰電流或電致化學(xué)發(fā)光信號實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的放大檢測；(4)利用納米材料自身催化活性及導(dǎo)電性促進(jìn)電子傳遞的速率，進(jìn)而增強(qiáng)檢測信號。

1.3 DNA等溫?cái)U(kuò)增放大技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種高效率的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有快速、靈敏和特異性高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備提供溫度循環(huán)以及專業(yè)的技術(shù)人員，因此檢測成本較高。隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)的迅猛發(fā)展，一些在等溫條件下的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)相繼出現(xiàn)，該類技術(shù)的關(guān)鍵是不需要進(jìn)行變溫操作，在恒溫條件下即可實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增，在一定程度上克服了PCR的缺點(diǎn)。DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的典型代表是發(fā)明于1998 年 的 滾 環(huán) 擴(kuò) 增 技 術(shù) (rolling circle amplification,RCA)，該技術(shù)以病原生物體滾環(huán)復(fù)制為模型，實(shí)現(xiàn)了恒溫條件下以環(huán)狀DNA為模板短單鏈DNA為引物的核酸快速復(fù)制，產(chǎn)生一段含有大量重復(fù)序列單元的長單鏈DNA，該重復(fù)單元與模板DNA互補(bǔ)。由于RCA具有操作簡單、快速、高效、靈敏度高、特異性高和可定量分析等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)廣泛用于臨床和微生物分子診斷領(lǐng)域。Cheng等利用RCA的信號放大作用，采用夾心免疫模式構(gòu)建了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)傳感器[23]，二抗上標(biāo)記生物素，通過親和素結(jié)合生物素標(biāo)記的引物，在模板DNA和原料脫氧核苷三磷酸(dNTP)存在下發(fā)生RCA反應(yīng)產(chǎn)生長單鏈，繼而與大量修飾互補(bǔ)短DNA鏈的量子點(diǎn)結(jié)合，最后檢測量子點(diǎn)的溶出峰實(shí)現(xiàn)對VEGF的高靈敏分析(圖6)。

2000年，Notomi等建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，該方法使用一種具有自動鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，通過兩條特異的外部引物和兩條特異的內(nèi)部引物，在等溫(60~65℃)的條件下進(jìn)行靶序列特異性擴(kuò)增，且具有特異、靈敏、快速、簡便等特點(diǎn)[24]。一般來說，通過比較LAMP擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的白色焦磷酸鎂沉淀的混濁度，或加入染料可實(shí)現(xiàn)對初始靶序列的定量分析[25]。最近，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物也可用電化學(xué)方法檢測，實(shí)現(xiàn)對生化分子的檢測。Sun等[26]在離子液體修飾的基底電極上固定特異性單鏈捕獲探針構(gòu)造了一個(gè)電化學(xué)DNA生物傳感器，使用電化學(xué)雜交指示劑亞甲基藍(lán) (MB)檢測基于雜交的LAMP擴(kuò)增子。Nakamura等[27]發(fā)展了一種使用染料 Hoechst 33258作為雜交指示劑檢測LAMP產(chǎn)物的電化學(xué)DNA芯片傳感器。利用適體和相應(yīng)目標(biāo)分子的關(guān)系轉(zhuǎn)換可以建立基于LAMP放大的非DNA分析平臺。Xie等[28]報(bào)道了LAMP放大的電化學(xué)方法用于赫曲霉毒素A(OTA)的檢測。如圖7所示，首先將OTA適體的互補(bǔ)鏈自組裝于納米金修飾玻碳電極表面，己硫醇封閉后與OTA適體雜交形成部分互補(bǔ)的DNA雙鏈體，沒有目標(biāo)物時(shí)，OTA適體可以進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)生成大量雙鏈結(jié)合反應(yīng)底液中的MB，致使游離MB減少，DPV檢測信號較??；當(dāng)目標(biāo)物OTA出現(xiàn)時(shí)，它會與其適體形成絡(luò)合物從而將適體從電極表面帶走，LAMP反應(yīng)的引物減少，擴(kuò)增產(chǎn)物減少，反應(yīng)液中游離的MB相應(yīng)增加，DPV檢測信號增大，以此進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)表明該傳感器對OTA檢測限為0.3 pmol/L。

圖6 基于RCA放大的VEGF傳感器原理示意圖[23]Fig.6 Schematic representation of the VEGF sensor with RCA for amplification[23]

2006年，Willner課題組提出了一種內(nèi)切酶放大的鏈置換 DNA 等 溫?cái)U(kuò)增 法(strand displacement amplification,SDA)[29-30]。該方法依賴于目標(biāo)物沿著模板鏈聚合形成核酸內(nèi)切酶可識別位點(diǎn)，經(jīng)內(nèi)切酶切割產(chǎn)生3′-OH缺口，繼而再次被聚合酶識別沿著3′端到5′端方向聚合，置換出之前的擴(kuò)增產(chǎn)物并再次形成可識別切割位點(diǎn)，如此進(jìn)行“切刻-聚合-置換”循環(huán)反應(yīng)，游離出大量聚合剪切的單鏈DNA產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增。該方法具有擴(kuò)增效率高且操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，具有生化分析方面的應(yīng)用潛力[31-32]。Yang等[33]結(jié)合SDA和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (hybridization chain reaction,HCR)的雙重信號放大能力設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)檢測miRNA的方法。如圖8所示，目標(biāo)miRNA存在時(shí)，可以沿著模板DNA序列聚合形成限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和擴(kuò)增產(chǎn)物，被內(nèi)切酶切割后再次形成聚合酶識別缺口并聚合置換出之前形成的擴(kuò)增產(chǎn)物，如此在聚合酶和內(nèi)切酶交替作用下產(chǎn)生大量擴(kuò)增DNA產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物作為HCR的引發(fā)劑促使形成大量含環(huán)狀富C序列的雙鏈DNA，并以此為DNA模版原位生成銀納米簇產(chǎn)生電化學(xué)信號。

圖7 LAMP放大的電化學(xué)方法用于OTA檢測原理示意圖[28]Fig.7 Schematic illustration of OTA detection principle using electrochemical method based on LAMP[28]

圖8 基于SDR和HCR放大的電化學(xué)方法用于miRNA檢測原理示意圖[33]Fig.8 Schematic illustration of miRNA detection principle based on SDR and HCR Amplifcations[33]

1.4 DNA自組裝放大技術(shù)

自組裝是指基本結(jié)構(gòu)單元，如分子、納米粒子、生物大分子或微米尺度物質(zhì)，在一定條件下依賴分子間非共價(jià)作用力(氫鍵、范德華力、靜電力、疏水作用力、π-π堆積作用等)自發(fā)地形成一種穩(wěn)定有序結(jié)構(gòu)的過程。DNA自組裝是一種嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對原則的自下而上(bottom-up)的分子自發(fā)組裝技術(shù)，區(qū)別于活細(xì)胞中DNA作為遺傳信息載體的功能，此處的DNA充當(dāng)構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)材料基元的角色。通過對堿基序列進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)DNA納米結(jié)構(gòu)的精密控制，并作為信號放大手段運(yùn)用于電化學(xué)生物傳感器。Pierce等[34]提出的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hybridization chain reaction,HCR)，其實(shí)質(zhì)是一種鏈置換驅(qū)動的DNA自組裝，該反應(yīng)在等溫?zé)o酶條件下進(jìn)行，通過一段單鏈寡核苷酸引發(fā)兩條分別含有粘性末端的發(fā)夾形單體交疊雜交組裝成一段延展的帶有缺口的雙鏈DNA。HCR組裝特異性高，相當(dāng)于DNA擴(kuò)增，但卻不需要聚合酶等酶的參與，操作簡單。此外，產(chǎn)物易于與雙鏈指示劑結(jié)合或設(shè)計(jì)帶有功能化側(cè)鏈的雙鏈產(chǎn)物而達(dá)到放大檢測信號的目的，目前相關(guān)研究非常熱門。

圖9 基于四面體DNA納米結(jié)構(gòu)和HCR放大的電化學(xué)DNA檢測原理示意圖[35]Fig.9 Schematic illustration of electrochemical DNA detection based on tetrahedral DNA nanostructure and HCR amplification[35]

Ge等[35]展示了一個(gè)結(jié)合HCR放大作用和四面體DNA納米結(jié)構(gòu)探針的超靈敏miRNA檢測平臺。在該方案中，三維四面體DNA納米結(jié)構(gòu)作為固定捕獲探針的支架更容易接近目標(biāo)miRNA而增加反應(yīng)性，由于發(fā)夾形單體修飾了生物素，通過HCR形成的觸須狀DNA納米線便含有大量生物素，可以捕獲大量親和素修飾的催化酶，從而有效放大檢測信號(圖9)。實(shí)驗(yàn)表明，四面體DNA納米結(jié)構(gòu)和HCR產(chǎn)物的協(xié)同效應(yīng)可以大大提高檢測DNA和miRNA的靈敏度。事實(shí)上，大多數(shù)報(bào)道的電化學(xué)生物傳感器都是與其他放大技術(shù)聯(lián)用構(gòu)建的。Zhuang等[36]結(jié)合HCR放大與銀納米探針采用電化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了高靈敏的DNA檢測。由于目標(biāo)物引發(fā)發(fā)夾形單體自組裝形成長的DNA納米結(jié)構(gòu)，使得大量銀納米探針不需要銀增強(qiáng)底物和生物活性的酶就可以直接固定其上，在施加的電位下納米銀產(chǎn)生強(qiáng)電化學(xué)信號從而進(jìn)行定量分析(圖10)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，目標(biāo)傳感器對人類免疫缺陷病毒(HIV)特異性DNA序列的檢測表現(xiàn)出良好的電化學(xué)性能，檢測限低至0.5 fmol/L。通過單鏈DNA間的交疊組裝也可以形成類似于HCR產(chǎn)物的超夾心DNA納米結(jié)構(gòu)。Xia等[37]采用MB修飾DNA探針分子與目標(biāo)物進(jìn)行級聯(lián)雜交形成超夾心結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)信號放大，報(bào)道了一種電化學(xué)高靈敏DNA檢測法(圖11)。Yin等[38]也通過超夾心DNA組裝放大方法，向生成的長雙鏈DNA中嵌入雙鏈指示劑MB，分別實(shí)現(xiàn)了對DNA和三磷酸腺苷(ATP)的檢測。

圖10 基于HCR放大和銀納米探針的電化學(xué)DNA檢測原理示意圖[36]Fig.10 Schematic illustration of electrochemical DNA detection principle based on HCR amplification and silver nanotags[36]

圖11 電化學(xué)超夾心DNA檢測原理示意圖[37]Fig.11 Schematic illustration of the electrochemical DNA supersandwich assay[37]

1.5 目標(biāo)物循環(huán)放大技術(shù)

目標(biāo)物循環(huán)一般是利用核酸切酶的剪切作用，將被捕獲的目標(biāo)物釋放游離出來，并參與和未作用DNA探針的下一輪結(jié)合-剪切過程，如此循環(huán)，使得單個(gè)目標(biāo)分子不斷重復(fù)利用，即目標(biāo)分子與DNA探針按照1:n比例反應(yīng)，達(dá)到n倍放大檢測信號的效果，是近幾年來發(fā)展迅速的一種信號放大技術(shù)，在高靈敏生物分析中廣泛使用[39-42]。根據(jù)對DNA底物作用方式和切割位置的不同，核酸切酶主要分為限制性內(nèi)切酶及核酸外切酶。

限制性內(nèi)切酶是可以識別特異的堿基序列并在識別位點(diǎn)或其周圍進(jìn)行切割的一類酶，可分為識別具回文序列的雙鏈DNA并對兩條DNA均剪切的一類，和識別特異性雙鏈但只剪切其中一條單鏈的一類。Chen等[43]將包含一段富G序列的DNA捕獲探針通過金巰鍵組裝于電極表面，目標(biāo)DNA與其雜交產(chǎn)生后限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，在限制性內(nèi)切酶催化剪切作用下釋放出目標(biāo)DNA，游離出的目標(biāo)物又能參與下一個(gè)雜交-剪切過程，如此循環(huán)，使得電極表面固定的捕獲探針大量轉(zhuǎn)化為僅保留富G序列的短DNA鏈，易于與卟啉鐵(hemin)結(jié)合形成hemin/G四倍體DNA酶，可以催化過氧化氫介導(dǎo)的四甲基聯(lián)苯胺的氧化，從而產(chǎn)生增強(qiáng)的催化電流信號，達(dá)到檢測目的(圖12)。Zhou等[44]也利用限制性內(nèi)切酶輔助目標(biāo)DNA循環(huán)在電極表面形成大量hemin/G四倍體DNA酶，該DNA酶通過催化H2O2的還原競爭共反應(yīng)試劑，從而淬滅電極材料石墨烯/量子點(diǎn)復(fù)合物的ECL發(fā)射，實(shí)現(xiàn)了DNA的高靈敏分析。限制性內(nèi)切酶能否發(fā)揮作用依賴于特異性識別位點(diǎn)的形成，這要求目標(biāo)DNA具有相應(yīng)的特殊序列，限制了其適用范圍，為了解決這一問題，可向體系中引入一條輔助探針，通過捕獲探針、輔助探針及目標(biāo)DNA間的相互雜交形成Y型結(jié)構(gòu)[45-46]，酶切位點(diǎn)位于Y結(jié)構(gòu)上的輔助探針/捕獲探針雙鏈分枝，從而擴(kuò)大可檢測DNA對象，具有普適性。Bai等[47]結(jié)合納米材料與酶輔助目標(biāo)物循環(huán)放大技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)適體傳感器用于內(nèi)毒素(LSP)的超靈敏檢測。如圖13所示，首先通過LPS結(jié)合固定在金磁納米表面的適體，置換出之前雜交好的互補(bǔ)鏈DNA1作為間接目標(biāo)物檢測，釋放的DNA1和輔助探針共同被發(fā)夾形捕獲探針捕獲形成Y型結(jié)構(gòu)和識別位點(diǎn)，在限制性內(nèi)切酶作用下促使DNA1循環(huán)利用產(chǎn)生大量被剪短的能與DNA2雜交的DNA片段，通過DNA2上修飾的甲苯胺藍(lán)-石墨烯(Tb-Gra)復(fù)合物產(chǎn)生增強(qiáng)的電化學(xué)檢測信號。當(dāng)LPS不存在時(shí)，電極表面組裝的捕獲探針呈發(fā)夾形閉合構(gòu)型，不能與DNA2雜交，因此背景信號較低。結(jié)果表明，該傳感器對LPS檢測限為8.7 fg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于之前文獻(xiàn)報(bào)道。

圖12 基于酶輔助目標(biāo)物循環(huán)電化學(xué)DNA檢測原理示意圖[43]Fig.12 Schematic illustration of the electrochemical DNA assay based on nuclease-assisted target recycling[43]

圖13 電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[47]Fig.13 Schematic illustration of the electrochemical aptasensor[47]

核酸外切酶是指能夠從分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵生成單核苷酸的酶，作用底物可以是雙鏈DNA也可以是單鏈DNA，作用方向可以沿3′→5′端，也可以沿5′→3′端。由于該類酶不要求特殊的目標(biāo)堿基序列，因此在基于酶輔助目標(biāo)物循環(huán)檢測方案的構(gòu)建上具有較強(qiáng)的靈活性，常用的有核酸外切酶III(Exo III)、外切酶I(Exo I)和λ外切酶(λ Exo)等[48-51]。Wu等[52]設(shè)計(jì)了一種基于Exo III輔助目標(biāo)物循環(huán)的電化學(xué)免標(biāo)記法用于檢測DNA。傳感界面的構(gòu)建是通過自組裝巰基DNA捕獲探針和巰基己醇混合單分子膜制備的，當(dāng)沒有目標(biāo)DNA時(shí)，通過電極表面DNA的負(fù)電性磷酸骨架吸附大量正電性電活性分子六氨合釕(RuHex)產(chǎn)生較強(qiáng)的電化學(xué)還原峰，當(dāng)有目標(biāo)物時(shí)，可以與DNA捕獲探針雜交形成平末端的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，Exo III沿3′→5′方向逐步催化去除捕獲探針的單核苷酸而釋放出目標(biāo)DNA，釋放出的DNA可與其他未被剪切的捕獲探針雜交致使捕獲探針的催化降解，如此循環(huán)，單個(gè)目標(biāo)分子就能導(dǎo)致n個(gè)捕獲探針被催化剪切，減少RuHex的靜電吸附量，電化學(xué)信號相應(yīng)減小并以此為定量依據(jù)(圖14)。

圖14 通過Exo III輔助目標(biāo)物循環(huán)的免標(biāo)記電化學(xué)DNA傳感器原理示意圖[52]Fig.14 Schematic illustration of the label-free electrochemical DNA sensor via Exo III-aided target DNA recycling for sequence-specifc detection of DNA[52]

此外，通過聚合酶輔助引物擴(kuò)增的鏈置換反應(yīng)也能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的循環(huán)。該方法的基本原理是：首先將DNA模板設(shè)計(jì)成發(fā)夾形構(gòu)象以鈍化其與引物DNA的結(jié)合位點(diǎn)，通過適體-目標(biāo)物特異性結(jié)合或者DNA雜交打開發(fā)夾形DNA模板，裸露出可結(jié)合引物位點(diǎn)，與引物DNA雜交后在聚合酶和脫氧核苷三磷酸 (dNTP)作用下進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生延展的DNA產(chǎn)物能置換出之前與模板DNA結(jié)合的目標(biāo)物，被釋放的目標(biāo)物可以再次結(jié)合鈍化的DNA模板，發(fā)生下一輪聚合-置換反應(yīng)，以此達(dá)到目標(biāo)物重復(fù)利用的目的[53]。Cheng等[54]將包含VEGF適體的發(fā)夾形捕獲探針組裝于金電極表面，目標(biāo)物VEGF與其結(jié)合打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)暴露出引物DNA的互補(bǔ)序列繼而與引物雜交，在聚合酶和dNTP作用下以捕獲探針為模板發(fā)生引物擴(kuò)增反應(yīng)，形成與捕獲探針完全互補(bǔ)序列置換出VEGF，釋放的目標(biāo)物參與下一個(gè)循環(huán)的聚合-置換反應(yīng)，最后使得電極表面的發(fā)夾形捕獲探針與引物擴(kuò)增產(chǎn)物形成完全互補(bǔ)雙鏈體結(jié)構(gòu)，該引物DNA上標(biāo)記有生物素，可結(jié)合親和素修飾的磷酸酶(ST-AP)，產(chǎn)生增強(qiáng)的酶催化信號(圖15)。Zhang等[55]通過目標(biāo)DNA打開發(fā)夾形捕獲探針誘導(dǎo)循環(huán)的引物擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量擴(kuò)增產(chǎn)物與發(fā)夾形捕獲探針形成雙鏈雜交結(jié)構(gòu)，使原本靠近電極表面的光敏劑遠(yuǎn)離電極，光電流信號減小從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)DNA的靈敏分析(圖16)。

圖15 基于循環(huán)的目標(biāo)物誘導(dǎo)引物擴(kuò)增的電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[54]Fig.15 Schematic presence of electrochemical aptasensor based on cyclic target-induced primer extension[54]

圖16 基于等溫鏈置換反應(yīng)的光電化學(xué)DNA傳感器原理示意圖[55]Fig.16 Principle of the photoelectrochemical DNA biosensor based on isothermal circular strand-displacement polymerization reaction[55]

[1]Akter R,Rahman M A,Rhee C K.Amplified electrochemical detection of a cancer biomarker by enhanced precipitation using horseradish peroxidase attached on carbon nanotubes[J].Analytical Chemistry,2012,84 (15):6407-6415.

[2]Wang J,Zhao W W,Tian C Y,et al.Highly efficient quenching ofelectrochemiluminescence from CdS nanocrystal film based on biocatalytic deposition[J].Talanta,2012,89:422-426.

[3]Caruana D J,Adam H.Enzyme-amplified amperometricdetection of hybridization and of a single base pair mutation in an 18-base oligonucleotide on a 7-μm-diameter microelectrode[J].Journal of the American Chemical Society,1999,121(4):769-774.

[4]Kwon S J,Yang H,Jo K,et al.An electrochemical immunosensor using p-aminophenol redox cycling by NADH on a self-assembled monolayer and ferrocenemodified Au electrodes[J].Analyst,2008,133(11): 1599-1604.

[5]Limoges B,Marchal D,Mavré F,et al.High amplification rates from the association of two enzymes confined within a nanometric layer immobilized on an electrode:modeling and illustrating example[J].Journal of the American Chemical Society,2006,128(18):6014-6015.

[6]Limoges B,Marchal D,Mavré F,et al.Theory and practice of enzyme bioaffinity electrodes.Chemical,enzymatic,and electrochemical amplification of in situ product detection[J].Journal of the American Chemical Society, 2008,130(23):7276-7285.

[7]Xiang Y,Zhang Y Y,Qian X Q,et al.Ultrasensitive aptamer-based protein detection via a dual amplifed biocatalytic strategy [J].Biosensors and Bioelectronics, 2010,25(11):2539-2542.

[8]Yang T,Li Q,Meng L,et al.Synchronous electrosynthesis of poly(xanthurenic acid)-reduced graphene oxide nanocomposite for highly sensitive impedimetric detection of DNA[J].ACS Applied Materials Interfaces,2013, 5(9):3495-3499.

[9]Yang T,Meng L,Wang X,et al.Direct electrochemical DNA detection originated from the self-Redox signal of sulfonated polyaniline enhanced by graphene oxide in neutral solution[J].ACS Applied Materials Interfaces, 2013,5(21):10889-10894.

[10]Guo Y X,Guo Y J,Dong C.Ultrasensitive and label-free electrochemical DNA biosensor based on water-soluble electroactive dye azophloxine-functionalized graphene nanosheets[J].Electrochimica Acta,2013,113:69-76.

[11]Serpi C,Voulgaropoulos A,Girousi S.Use of mercury film glassy carbon electrode modified with multiwalled carbon nanotubes in electrochemical analysis of DNA[J]. Electroanalysis,2013,25(5):1256-1262.

[12]Patel M K,Ali M A,Zafaryab M,et al.Biocompatible nanostructured magnesium oxide-chitosan platform for genosensing application[J].Biosensors and Bioelectronics,2013,45:181-188.

[13]Qiu L,Qiu L,Wu Z S,et al.Cooperative amplificationbased electrochemical sensor for the zeptomole detection of nucleic acids[J].Analytical Chemistry,2013,85(17): 8225-8231.

[14]Wang Z J,Zhang J,Zhu C F,et al.Amplified detection of femtomolar DNA based on a one-to-few recognition reaction between DNA-Au conjugate and target DNA[J]. Nanoscale,2014,6:3110-3115.

[15]Huang H P,Zhu J J.DNA aptamer-based QDs electrochemiluminescence biosensor for the detection of thrombin[J].Biosensors and Bioelectronics,2009,25(4): 927-930.

[16]Huang H P,Li J J,Tan Y L,et al.Quantum dot-based DNA hybridization by electrochemiluminescence and anodic stripping voltammetry[J].Analyst,2010,135(7): 1773-1778.

[17]Huang H P,Jie G F,Cui R J,et al.DNA aptamer-based detection of lysozyme by an electrochemiluminescence assay coupled to quantum dots[J].Electrochemistry Communications,2009,11(4):816-818.

[18]Cheng L X,Liu X,Lei J P,et al.Low-Potential Electrochemiluminescent sensing based on surface unpassivation of CdTe quantum dots and competition of analyte cation to stabilizer[J].Analytical Chemistry,2010,82(8): 3359-3364.

[19]Wang T,Zhang S Y,Mao C J,et al.Enhanced electrochemiluminescence of CdSe quantum dots composited with graphene oxide and chitosan for sensitive sensor[J]. Biosensors and Bioelectronics,2012,31(1):369-375.

[20]Tian C Y,Zhao W W,Wang J,et al.Amplified quenching of electrochemiluminescence from CdS sensitized TiO2nanotubes by CdTe-carbon nanotube composite for detection of prostate protein antigen in serum[J].Analyst, 2012,137(13),3070-3075.

[21]Jie G F,Zhang J,Jie G X,et al.A novel quantum dot nanocluster as versatile probe for electrochemiluminescence and electrochemical assays of DNA and cancer cells[J].Biosensors and Bioelectronics,2014,52:69-75.

[22]Zhang J,Nie H,Wu Z,et al.Self-catalytic growth of unmodified gold nanoparticles as conductive bridges mediated gap-electrical signal transduction for DNA hybridization detection[J].Analytical Chemistry,2014,86 (2):1178-1185.

[23]Cheng W,Yan F,Ding L,et al.Cascade signal amplification strategy for subattomolar protein detection by rolling circle amplifcation and quantum dots tagging[J].Ana-lytical Chemistry,2010,82(8):3337-3342.

[24]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research,2000,28(12):E63.

[25]Zhang X Z,Lowe S B,Gooding J J.Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplifcation(LAMP)[J].Biosensors and Bioelectronics,2014,61: 491-499.

[26]Sun W,Qin P,Gao H,et al.Electrochemical DNA biosensor based on chitosan/nano-V2O5/MWCNTs composite film modified carbon ionic liquid electrode and its application to the LAMP product of Yersinia enterocolitica gene sequence[J].Biosensors and Bioelectronics, 2010,25(6):1264-1270.

[27]Nakamura N,Ito K,Takahashi M,et al.Detection of six single-nucleotide polymorphisms associated with rheumatoid arthritis by a loop-mediated isothermal amplification method and an electrochemical DNA chip[J]. Analytical Chemistry,2007,79(24):9484-9493.

[28]Xie S B,Chai Y Q,Yuan Y L,et al.Development of an electrochemical method for Ochratoxin A detection based on aptamer and loop-mediated isothermal amplification [J].Biosensors and Bioelectronics,2014,55:324-329.

[29]Weizmann Y,Beissenhirtz M K,Cheglakov Z,et al.A virus spotlighted by an autonomous DNA machine[J]. Angewandte Chemie International Edition,2006,45(44): 7384-7388.

[30]Beissenhirtz M K,Elnathan R,Weizmann Y,et al.The aggregation of Au Nanoparticles by an Autonomous DNA machine detects viruses[J].Small,2007,3(3):375-379.

[31]Liu Y Q,Zhang M,Yin B C,et al.Attomolar ultrasensitive microRNA detection by DNA-scaffolded silvernanocluster probe based on isothermal amplifcation[J]. Analytical Chemistry,2012,84(12):5165-5169.

[32]Zhang M,Liu Y Q,Yu C Y,et al.Multiplexed detection of microRNAs by tuning DNA-scaffolded silver nanoclusters[J].Analyst,2013,138(17):4812-4817.

[33]Yang C,Shi K,Dou B,et al.In Situ DNA-templated synthesis of silver nanoclusters for ultrasensitive and labelfree electrochemical detection of microRNA [J].ACS Applied Materials&Interfaces,2015,7(2):1188-1193.

[34]Dirks R M,Pierce N A.Triggered amplification by hybridization chain reaction[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004,101(43),15275-15278.

[35]Ge Z,Lin M,Wang P,et al.Hybridization chain reaction amplifcation of microRNA detection with a tetrahedral DNA nanostructure-based electrochemical biosensor[J]. Analytical Chemistry,2014,86(4):2124-2130.

[36]Zhuang J Y,Fu L B,Xu M D,et al.Sensitive electrochemical monitoring of nucleic acids coupling DNA nanostructures with hybridization chain reaction[J]. Analytica Chimica Acta,2013,783:17-23.

[37]Xia F,White R J,Zuo X,et al.An electrochemical supersandwich assay for sensitive and selective DNA detection in complex matrices[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132:14346-14348.

[38]Yin B C,Guan Y M,Ye B C.An ultrasensitive electrochemical DNA sensor based on the ssDNA-assisted cascade of hybridization reaction[J].Chemical Communications,2012,48(35):4208-4210.

[39]Zhu Z,Gao F L,Lei J P,et al.A Competitive strategy coupled with endonuclease-assisted target recycling for DNA detection using silver-nanoparticle-tagged carbon nanospheres as labels[J].Chemistry-A European Journal,2012,18(43),13871-13876.

[40]Chen J H,Zhang J,Li J,et al.An ultrahighly sensitive and selective electrochemical DNA sensor via nicking endonuclease assisted current change amplifcation[J]. Chemical Communications,2010,46(32):5939-5941.

[41]Zhou H,Zhang Y Y,Liu J,et al.Efficient quenching of electrochemiluminescence from K-doped grapheme-CdS:Eu NCs by G-quadruplex-hemin and target recycling-assisted amplification forultrasensitive DNA biosensing[J].Chemical Communications,2013,49(22): 2246-2248.

[42]Guo Y S,Jia X P,Zhang S S.DNA cycle amplifcation device on magnetic microbeads for determination of thrombin based on graphene oxide enhancing signal-on electrochemiluminescence[J].Chemical Communications,2011,47(2):725-727.

[43]Chen J,Zhang J,Guo Y,et al.An ultrasensitive electrochemical biosensor for detection of DNA species related to oral cancer based on nuclease-assisted target recycling and amplification of DNAzyme[J].Chemical Communications,2011,47(28):8004-8006.

[44]Zhou H,Zhang Y Y,Liu J,et al.Efficient quenching of electrochemiluminescence from K-doped graphene -CdS:Eu NCs by G-quadruplex-hemin and target recycling-assisted amplification for ultrasensitive DNA biosensing[J].Chemical Communications,2013,49(22): 2246-2248.

[45]Nakayama S,Yan L,Sintim H O.Junction probes-sequence specific detection of nucleic acids via template enhanced hybridization processes[J].Journal of the American Chemical Society,2008,130(38):12560-12561.

[46]Kong R M,Zhang X B,Zhang L L,et al.Molecular beacon-based junction probes for efficient detection of nucleic acids via a true target-triggered enzymatic recycling amplification[J].Analytical Chemistry,2010,83 (1):14-17.

[47]Bai L J,Chai Y Q,Pu X Y,et al.A signal-on electrochemical aptasensor for ultrasensitive detection of endotoxin using three-way DNA junction-aided enzymatic recycling and graphene nanohybrid for amplification[J]. Nanoscale,2014,6(5):2902-2908.

[48]Cui L,Ke G,Wang C,et al.A cyclic enzymatic amplifcation method for sensitive and selective detection of nucleic acids[J].Analyst,2010,135(8):2069-2073.

[49]Zuo X,Xia F,Xiao Y,et al.Sensitive and selective amplifed fluorescence DNA detection based on exonuclease III-aided target recycling[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132(6):1816-1818.

[50]Wu Z,Zhen Z,Jiang J H,et al.Terminal protection of small-molecule-linked DNA for sensitive electrochemical detection of protein binding via selective carbon nanotube assembly[J].Journal of the American Chemical Society,2009,131(34):12325-12332.

[51]Hsieh K,Xiao Y,Tom Soh H.Electrochemical DNA detection via exonuclease and target-catalyzed transformation of surface-bound probes[J].Langmuir,2010,26 (12):10392-10396.

[52]Wu D,Yin B C,Ye B C.A label-free electrochemical DNA sensor based on exonuclease III-aided target recycling strategy for sequence-specific detection of femtomolar DNA[J].Biosensors and Bioelectronics,2011,28 (1):232-238.

[53]Guo Q,Yang X,Wang K,et al.Sensitive fluorescence detection of nucleic acids based on isothermal circular strand-displacement polymerization reaction[J].Nucleic Acids Research,2009,37(3):e20.

[54]Cheng W,Ding S,Li Q,et al.A simple electrochemical aptasensor for ultrasensitive protein detection using cyclic target-induced primer extension[J].Biosensors and Bioelectronics,2012,36(1):12-17.

[55]Zhang X,Xu Y,Zhao Y,et al.A new photoelectrochemical biosensors based on DNA conformational changes and isothermal circular strand-displacement polymerization reaction[J].Biosensors and Bioelectronics,2013,39 (1):338-341.

The application of signal amplification strategies in electrochemical biosensors

Chen Ying
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

Rapid,simple and sensitive determination of biomolecules has become increasingly important in clinical diagnosis,food analysis and bioterrorism/environmental monitoring over the past few years.Electrochemical biosensor has gained increasing interest due to its inherent advantages such as simplicity,sensitivity and low cost in cooperation with the comprehensive applications in different fields.Various signal amplification methods have been reported to achieve high sensitivity for biomolecules determination.In this article,we briefly introduce the fundamentals of the electrochemical biosensor,and emphatically summarize the popular signal amplification strategies applied in electrochemical biosensors.

electrochemistry;biodetection;signal amplification strategy