朱宇萍,馮曉清

（內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641112）

基于明膠-碳納米管構(gòu)建癌胚抗原免疫傳感器的研究

朱宇萍*,馮曉清

（內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641112）

利用納米金與明膠-碳納米管 (MWCNTs)復(fù)合物固載癌胚抗體制得較高靈敏度的電流型癌胚抗原(CEA)免疫傳感器。首先將制得的明膠-碳納米管復(fù)合物修飾在金電極表面成膜，再利用明膠中豐富的氨基吸附納米金，并通過靜電吸附作用吸附癌胚抗體(anti-CEA)。實(shí)驗(yàn)過程中采用循環(huán)伏安法對(duì)電極的修飾過程及響應(yīng)性能進(jìn)行表征。結(jié)果表明，制得的免疫傳感器對(duì)癌胚抗原有良好的電流響應(yīng)，其線性范圍為0.1~80.0 ng/mL，檢出下限為0.03 ng/mL。

免疫傳感器；癌胚抗原；納米金；碳納米管；明膠

0 前言

免疫傳感器是生物傳感器諸多分類中的一類，它利用抗體與抗原之間的免疫應(yīng)答機(jī)理，將其中之一修飾到換能器內(nèi)(或表面)，能夠?qū)?fù)雜體系中相應(yīng)的免疫組分進(jìn)行檢測(cè)。由于它具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低以及容易在線活體檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境工業(yè)、食品加工及生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)等方面都有著重要應(yīng)用[1]。目前，對(duì)人體血清中癌胚抗原的檢測(cè)大部分以臨床實(shí)驗(yàn)為主。傳統(tǒng)免疫方法有放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、熒光免疫分析法，但這些分析方法存在一些弊端，如操作復(fù)雜、耗時(shí)，儀器設(shè)備精密度要求高，有潛在危險(xiǎn)或材料昂貴[2]。與上述檢測(cè)癌胚抗原的傳統(tǒng)方法相比較，電化學(xué)免疫分析方法具有操作簡(jiǎn)便，選擇性強(qiáng)，成本較低且省時(shí)，還可直接檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[1]。近年來，免疫傳感器的研究已十分普遍，其構(gòu)建方式被研究者們廣泛關(guān)注。

納米材料由于具有優(yōu)異的化學(xué)和物理性能，如較高的比表面積，較高的表面自由能、吸附濃縮效應(yīng)。這些優(yōu)良的性能有利于提高敏感分子的吸附能力和生化反應(yīng)的速率，因此被廣泛運(yùn)用于生物傳感器[3]。

納米金顆粒(nano-Au)具有比表面積大、表面反應(yīng)活性高、表面活性中心多、催化效率高、吸附能力強(qiáng)等性能。良好的生物共容性和穩(wěn)定性，可用于固載和標(biāo)記生物蛋白質(zhì)[4]。此外，蛋白質(zhì)分子帶正電荷可以通過靜電吸附作用結(jié)合帶負(fù)電荷納米金，并能夠保持蛋白質(zhì)的生物活性[5]，因而可利用納米金吸附癌胚抗體(anti-CEA)，制得靈敏度較高的免疫傳感器。

碳納米管(MWCNTs)是一種可用于修飾電化學(xué)傳感器的優(yōu)良納米材料。這是由于其比表面積大，易于向修飾電極中引入多種官能團(tuán)，使MWCNTs應(yīng)用于修飾電極中能夠降低電極的氧化過電勢(shì)、增加氧化峰的電流值、改善電化學(xué)傳感器的性能、提高選擇性和靈敏度等[6]。

明膠(Gelation)是肽分子聚合物，分子量一般在幾萬到幾十萬，既具有酸性又具有堿性，是一種兩性物質(zhì)。其分子在結(jié)構(gòu)上有大量的羥基、羧基和氨基，這就使得明膠具有極強(qiáng)的親水性，且明膠不溶于有機(jī)溶劑和冷水，具有較好的成膜能力[7]。

結(jié)合Gelation和MWCNTs的優(yōu)點(diǎn)，將明膠溶于溫水中，作為MWCNTs的分散介質(zhì)。碳納米管能夠很好的被明膠包裹，并均勻的分散在整個(gè)基體中[8]。明膠還能夠使納米材料表面氨基(-NH2)功能化，以便聯(lián)結(jié)其它成分[7]。制備明膠-碳納米管復(fù)合物(Gelation-MWCNTs)并將其修飾在金電極表面。碳納米管可有效增大比表面積，明膠含有大量-NH2且具有較好的成膜能力，形成的明膠-碳納米管復(fù)合物能夠大量的吸附納米金，能固載更多的癌胚抗體。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)、BRANSONIC200超聲清洗儀 (德國)、AB204--S電子天平 (瑞士Mettler-toledo公司)、MP230酸度計(jì)(瑞士Mettler-toledo公司)、金電極(Φ=4 mm)、鉑電極、飽和甘汞電極、恒溫水浴鍋、所有玻璃儀器均用鉻酸洗液浸泡，再超聲洗滌并晾干。

試劑：癌胚抗原定量檢測(cè)試劑(博賽生物有限公司)、明膠、碳納米管、氯金酸、檸檬酸三鈉、固體K3Fe(CN)6、K4Fe(CN)6、KCl、NaH2PO4、Na2HPO4· 12H2O、無水乙醇等。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 免疫傳感器的制備

1.2.1 Gelation-MWCNTs復(fù)合物的制備

稱取0.05 g Gelation固體顆粒加入2 mL去離子水，在50℃水浴中加熱并振蕩，使明膠溶解。趁熱加入約5 mg MWCNTs充分混合，超聲0.5 h后即制得Gelation-MWCNTs復(fù)合物[9]。

1.2.2 nano-Au顆粒的制備

在 100 mL去離子水中加入 1 mL 1%(w) HAuCl4溶液,煮沸，再迅速加入4 mL 1%(w)檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)溶液，繼續(xù)煮沸15 min，冷卻至室溫，即得nano-Au顆粒，該顆粒粒徑為16 nm[10]。取3 mL制得的納米金溶液離心沉降5 min后，用滴管吸走上層清液，既得濃縮nano-Au，保存在4℃冰箱中備用。

1.2.3 修飾電極的制備

依次用0.3 μm、0.5 μm的Al2O3糊將金電極（Φ=4 mm)拋光成鏡面，用去離子水沖洗除去表面的拋光粉，依次用去離子水、無水乙醇、去離子水超聲清洗5 min，室溫下晾干備用。

將所制得的Gelation-MWCNTs復(fù)合物用微量取量計(jì)取出10 μL滴涂于預(yù)處理好的電極表面，待其電極表面成膜后，再取20 μL濃縮nano-Au溶膠滴涂在上述修飾電極表面，自然晾干。將修飾好的電極置于癌胚抗體(anti-CEA)溶液中，在4℃下放置16 h。最后將修飾好的電極浸泡在0.25%(w)的牛血清白蛋白(BSA)溶液中約30 min，使電極上的非特異性吸附位點(diǎn)封閉，即制得癌胚抗原免疫傳感器。將其置于4℃冰箱中，備用。圖1為免疫傳感器制備過程示意圖。

1.3 檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)對(duì)電極的制備過程采用三電極體系以循環(huán)伏安法(Cyclic voltammograms)進(jìn)行表征。飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極，被修飾的金電極為工作電極，電極表征在5 mmol/L K3Fe(CN)6+K4Fe(CN)6+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS(pH=7.4)溶液中進(jìn)行，循環(huán)伏安法電位區(qū)間為-0.2~0.6 V，掃描速率為50 mV/s，實(shí)驗(yàn)溫度若未做說明均為25℃。

圖1 免疫傳感器的制備過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the stepwise immunosensor construction process

2 結(jié)果與討論

圖2 電極修飾過程的循環(huán)伏安表征(a)裸Au電極；(b)Au/MWCNTs-Gelatin；(c)Au/ MWCNTs-Gelatin/nano-Au；(d)Au/MWCNTs-Gelatin/ nano-Au/anti-CEA；(e)Au/MWCNTs-Gelatin/nano-Au/ anti-CEA/BSA;(f)孵育20 ng/mL CEAFig.2 Cyclic voltammograms of different electrodes

2.1 電極在修飾過程的電化學(xué)表征

對(duì)電極修飾過程中不同階段的電化學(xué)特性用CV進(jìn)行表征，結(jié)果見圖2。曲線a是裸金電極在鐵氰化鉀溶液中的CV表征圖。從圖中可見，曲線a出現(xiàn)一對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，這是由于測(cè)試底液中含有 Fe3+/Fe2+氧化還原電對(duì)；將Gelation-MWCNTs復(fù)合物滴涂于金電極表面后，由于復(fù)合物中Gelation在一定程度上阻礙了電子傳遞，導(dǎo)致氧化峰電流有所降低[9](圖2b)；通過明膠表面上的-NH2將nano-Au吸附到修飾電極上，由于nano-Au有利于電子在電極與測(cè)試底液中傳輸，從而使氧化峰電流升高[10](圖2c)；由于nano-Au與anti-CEA之間存在著靜電吸附作用，故可利用nano-Au使anti-CEA固定在電極表面。因蛋白質(zhì)大分子在一定程度上阻礙了電子的傳輸，氧化峰的電流值減小[11](圖2d)；再利用BSA封閉電極表面的非特異性吸附位點(diǎn)，氧化峰電流繼續(xù)降低 (圖2e)；最后將修飾好的免疫傳感器在 20 ng/mL的CEA抗原中孵育一定時(shí)間，當(dāng)溶液中CEA和電極表面的anti-CEA特異性結(jié)合后，生成的抗原-抗體復(fù)合物使修飾電極表面的電子傳輸通道部分堵塞，因而其響應(yīng)電流進(jìn)一步下降[11](曲線f)。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 掃描速度的優(yōu)化

將修飾電極置于pH為7.4的5 mmol/L K3Fe (CN)6+K4Fe(CN)6+0.1 mol/L KCl的測(cè)試底液中，分別于50、100、150、200、300、400、500、600 mV/s的掃描速度下進(jìn)行掃描，見圖3。還原峰電流值與掃描速度的平方根兩者之間成反比例關(guān)系，即掃描速度越大，其還原峰電流值越小，反之則越大。這就表明電極上的氧化還原反應(yīng)要受擴(kuò)散過程的影響[11]。

圖3 修飾電極峰電流與掃速的關(guān)系曲線，插圖為不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.3 plot of peak current vs scan rate; Inset：Cyclic voltammograms of the immunoelectrode at different rate

2.2.2 緩沖溶液pH的優(yōu)化

測(cè)試底液的pH對(duì)抗原抗體的活性和親和性均有影響。pH過低會(huì)使抗原-抗體締合物解離；而pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，會(huì)引起蛋白質(zhì)的自凝現(xiàn)象，造成假陽性結(jié)果。 因此，維持測(cè)試底液適當(dāng)?shù)膒H是抗原與抗體的結(jié)合的必要條件之一[12]。實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)試底液pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0下用CV法表征其對(duì)應(yīng)的峰電流值(見圖4)。當(dāng)pH在4.0~7.4的范圍時(shí)，pH越大，還原峰的峰電流值越大。當(dāng)pH大于7.4后，若繼續(xù)增加pH值，還原峰電流值又會(huì)降低。因此實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)試底液pH為7.4。

2.2.3 抗原孵育溫度的優(yōu)化

溫度對(duì)抗原抗體的免疫反應(yīng)具有重要的影響。溫度低時(shí)，免疫蛋白活性較低，免疫反應(yīng)速度緩慢，時(shí)間較長(zhǎng)；溫度較高時(shí)，免疫蛋白活性增加，免疫反應(yīng)速度較快，時(shí)間較短；但當(dāng)溫度過高時(shí)，免疫蛋白會(huì)失活，故控制適當(dāng)?shù)臏囟葘?duì)免疫反應(yīng)有重要的影響[9]。圖5為免疫傳感器分別在15、20、25、30、35、37、40、45℃溫度下孵育20 ng/mL抗原的還原峰電流值與溫度的關(guān)系。由圖可見孵育溫度為30℃時(shí)還原峰電流值最小，此時(shí)癌胚抗體對(duì)抗原結(jié)合的較快且較穩(wěn)定，響應(yīng)曲線較好,因此該免疫傳感器最佳孵育溫度為30℃。但在實(shí)際應(yīng)用中由于考慮到免疫傳感器的保存問題，長(zhǎng)期置于30℃的工作環(huán)境下，蛋白質(zhì)大分子易失活，故實(shí)際操作中一般選擇25℃為工作溫度。

圖4 pH值對(duì)免疫傳感器的影響Fig.4 The effect of pH on the response of immunosensor

2.2.4 抗原孵育時(shí)間的優(yōu)化

抗原孵育的時(shí)間直接影響抗原與抗體結(jié)合的程度[11]。對(duì)同一支修飾電極在20 ng/mL的CEA中分別孵育3、5、8、10、12、15、20、25 min，然后進(jìn)行CV表征。還原峰電流與孵育時(shí)間的關(guān)系見圖6。由圖可知，當(dāng)孵育時(shí)間為15 min時(shí)，還原峰具有最大峰電流值，即抗原與抗體反應(yīng)最充分，電極上結(jié)合的抗原量達(dá)到飽和，因此實(shí)驗(yàn)的最佳孵育時(shí)間為15 min。

圖5 不同孵育溫度下免疫電極的響應(yīng)峰電流值Fig.5 The effect of incubation temperature on the response of the immunosensor

圖6 峰電流值與孵育時(shí)間的關(guān)系Fig.6 The effect of incubation time on the response of the immunosensor

圖7 峰電流響應(yīng)值與濃度的關(guān)系曲線（插圖為免疫傳感器在不同濃度CEA下的循環(huán)伏安圖）Fig.7 Linear relationship between the peak current and Cyclic voltammograms of the immunoelectrode in different concentration of CEA Insert:Cyclic voltammograms of the immunoelectrode in different concentration of CEA

2.3 免疫傳感器的響應(yīng)特性

2.3.1 免疫傳感器對(duì)CEA抗原的響應(yīng)曲線

在最優(yōu)化的條件下，將免疫電極依次孵育濃度為 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 ng/mL的CEA抗原溶液，并用CV表征，測(cè)得其還原峰峰電流與濃度的關(guān)系。圖7為該免疫傳感器還原峰電流值與抗原濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系。線性關(guān)系式為I=-89.87194+8.62307 lg c；相關(guān)系數(shù)r2=0.99963；檢出范圍為0.1~80.0 ng/mL；檢出限為0.03 ng/mL。在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高，抗體與抗原結(jié)合的越多，則電極表面的電子傳輸通道阻塞的越多，則還原峰峰電流值增加[11]見圖7插圖。

2.3.2 免疫傳感器的選擇性

模擬人體環(huán)境存在的L-谷氨酸(C5H9NO4)、甘氨酸 (C2H5NO2)、牛血清蛋白等干擾物質(zhì)與CEA抗原的混合溶液，將制備好的同一免疫傳感器先后置于只含20 ng/mL CEA抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液和含20 ng/mL CEA抗原以及干擾物質(zhì)的混合溶液中依次孵育15 min，分別進(jìn)行CV表征見圖8。曲線a表示有干擾物質(zhì)存在時(shí)的響應(yīng)曲線，b表示無干擾物質(zhì)存在時(shí)的響應(yīng)曲線，兩者并無明顯差別，故該免疫傳感器具有良好的選擇性。

圖8 干擾物質(zhì)對(duì)免疫電極響應(yīng)曲線的影響a：20 ng/mL CEA抗原+干擾物質(zhì)；b：20 ng/mL CEA抗原Fig.8 Effects of interfering substances on the response curve of the Immunosensor

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)首先制得Gelation-MWCNTs復(fù)合物，通過Gelation表面的-NH2結(jié)合nano-Au，再利用nano-Au靜電吸附anti-CEA成功制備了癌胚免疫傳感器。該傳感器具有靈敏度高、制作簡(jiǎn)單、響應(yīng)時(shí)間快、選擇性強(qiáng)、檢測(cè)下限低，成本低等特點(diǎn)。此外，實(shí)驗(yàn)中采用的原料明膠價(jià)廉易得且無污染，取代了一般用于電化學(xué)免疫傳感器中較貴的原料。在實(shí)驗(yàn)中，以CEA作為免疫物質(zhì)模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CEA的定量檢測(cè)。同時(shí)該方法也可應(yīng)用于其他免疫物質(zhì)的測(cè)定，在臨床診斷方面有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Study on construction of An immunosensor for carcinoembryonic based on carbon nanotube-gelatin composite

Zhu Yu-ping*,Feng Xiao-qing
(College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University,Neijiang 641112,China）

A highly sensitive amperometric immunosensor for the determination of carcinoembryonic antigen(CEA) was construted with the comprised of gelatin,muti-wall carbon nanotubes(MWCNTs).At first,place the prepared gelatin-carbon nanotube composites on the gold electrode surface.Then,absorb the nano-Au by the numerous amino of gelatin and anti-CEA by electrostatic adsorption on its surface successively.In the experiment,the perparing process of the immunosensor was characterized by the cyclic voltammetrys.The results show that the immunosensor present highly sensitivity,with a linear range of 0.1~80.0 ng/mL and a detection limit of 0.03 ng/mL.

immunosensor;CEA;nano-Au;MWCNTs;gelatin

四川省教育廳科研項(xiàng)目（15ZA0292）

*通信聯(lián)系人，Tel：13696067037，E-mail：judy20060830@163.com