朱宇萍,許 瓊

（內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641112）

基于二氧化硅-殼聚糖納米復(fù)合物構(gòu)建免疫傳感器的研究

朱宇萍*,許 瓊

（內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641112）

首先制備二氧化硅（SiO2）-殼聚糖（chitosan，Cs）納米復(fù)合物。將其修飾在玻碳電極表面，利用納米SiO2高的表面能和多孔結(jié)構(gòu)吸附電子媒介體硫堇(Thi)。通過Thi中的氨基吸附納米金(nano-Au)，從而固載甲胎蛋白抗體(anti-AFP)，并用牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性吸附位點(diǎn)，成功制得一種新型的甲胎蛋白免疫傳感器。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，該免疫傳感器在檢測范圍：0.01~1.0 ng/mL和5~200 ng/mL內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，檢測下限為0.003 ng/mL。結(jié)果表明，該免疫傳感器靈敏度高，制備方法簡易。

免疫傳感器；甲胎蛋白；二氧化硅；殼聚糖；納米復(fù)合物

0 引言

電化學(xué)免疫傳感器具有高特異性、高靈敏度、精確測量、操作簡單、分析快速、便宜和儀器小型化等優(yōu)勢，是生物化學(xué)分析的研究熱點(diǎn)。在臨床診斷，醫(yī)療保健，環(huán)境監(jiān)測，食品安全等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。修飾材料的選擇及其固載方法是成功制備免疫傳感器的關(guān)鍵[2]。

納米二氧化硅（SiO2）粒徑小，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。它比表面積大、表面吸附力強(qiáng)、表面含有豐富的羥基[3]。并具有生理惰性，能保證生物分子的活性[4]。因此，在免疫感器領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。有研究將金屬納米材料與其它納米材料制備成納米復(fù)合物，用于免疫傳感器的研究。使得免疫傳感器峰電流信號(hào)增強(qiáng)，穩(wěn)定性提高[5]。硫堇（Thi）分子中含有兩個(gè)氨基，帶正電，是良好的電子媒介體，可作氧化還原探針。同時(shí)，在酸性條件下，Thi單體分子可以聚合形成多孔高聚復(fù)合膜，這種多孔高聚硫堇復(fù)合膜的穩(wěn)定性好，比表面積大，是優(yōu)良的固定基質(zhì)。可將其用于增強(qiáng)抗體的吸附量， 提高免疫傳感器的靈敏度[6]。 殼聚糖（Chitosan;Cs）是甲殼素（Chitin）脫去其中一部分乙?；蟮漠a(chǎn)物，具有優(yōu)異成膜性、透氣性、吸附性和滲透性，作為一種良好的成膜材料在傳感器研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[7]。金屬納米顆粒則具有高的催化性、選擇性[8]、生物相容性好、吸附性強(qiáng)[6]等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于免疫傳感器的研究。納米金是典型的金屬納米材料。實(shí)驗(yàn)首先制備納米SiO2，并將它與Cs制備成納米復(fù)合物。再將其修飾在玻碳（GCE）電極表面。然后利用納米SiO2高的表面能和多孔結(jié)構(gòu)[9]，以及所含羥基與氨基反應(yīng)，吸附電子媒介體Thi[6]。Thi帶有雙功能團(tuán)，帶正電，可吸附帶負(fù)電的納米金顆粒，從而吸附甲胎蛋白抗體蛋白質(zhì)（anti-AFP）。該制備方法操作簡便，成功率高。制備的甲胎蛋白免疫傳感器靈敏度高，選擇性強(qiáng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學(xué)工作站 （上海辰華儀器公司 ），BRANSONIC200超 聲 清 洗 儀 （德 國BRANSONUL-TRASCHALL公司），F(xiàn)A2004A電子天平 （上海精天電子儀器有限公司），TL-5.0W臺(tái)式離心機(jī)（上海市離心機(jī)械研究所有限公司）。

氨水（體積分?jǐn)?shù)25%），無水乙醇，正硅酸乙酯（TEOS），氯金酸（武漢興眾誠股份有限公司），檸檬酸三鈉（成都科龍化工試劑廠），磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，氯化鉀，硫堇（青島正業(yè)試劑儀器有限公司），以上試劑如未加說明，均為分析純。殼聚糖，甲胎蛋白診斷試劑盒（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司），牛血清白蛋白(BSA)，去離子水。

1.2 納米金的制備

將0.0300 g氯金酸溶于100 mL去離子水中，加熱至沸騰，攪拌下滴加1%(w)的檸檬酸鈉溶液2 mL（先滴加6滴，攪拌，沸騰2 min后繼續(xù)滴加剩余溶液）。持續(xù)沸騰15 min后，停止加熱。繼續(xù)攪拌至室溫，得到玫紅色納米金溶膠[10]。

1.3 納米二氧化硅的制備

將12 mL體積分?jǐn)?shù)為25%的氨水和100 mL無水乙醇混合。在35℃，超聲條件下，以0.4 mL/min的速度滴入6 mL TEOS，滴加完后再超聲5 min即得粒徑均一的納米二氧化硅納米粒子[11]。

以10000 r/min進(jìn)行高速離心10 min，倒掉上清液，用去離子水洗滌至亞中性，最后用去離子水定容至剛開始體積，保存待用。

1.4 二氧化硅-殼聚糖納米復(fù)合物的制備

將0.0100 g Cs溶于5 mL醋酸中，室溫?cái)嚢柚寥芙?。用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在4.0~5.0。將已制備好的納米SiO2溶液5 mL，加入其中，攪拌8 h，即得SiO2-Cs納米復(fù)合物。

1.5 免疫傳感器制備過程

玻碳電極 （GCE，Φ＝4 mm）經(jīng)0.3 μm，0.05 μm的Al2O3糊拋光后用蒸餾水沖洗干凈。再依次用去離子水，無水乙醇，去離子水分別超聲5 min后取出，室溫下晾干備用。取制備好的SiO2-Cs納米復(fù)合物10 μL，用微量取樣器滴加在處理過的電極表面。室溫下自然晾干后，向該修飾電極表面滴加10 μL Thi，室溫下晾干。將上述電極表面滴涂20 μL nano-Au溶膠，室溫下晾干。最后，將其侵泡在anti-AFP溶液中6 h后取出，用BSA封閉30 min，最后用去離子水洗滌晾干。在4℃條件下保存?zhèn)溆?。修飾電極制備過程如圖1。

圖1 免疫傳感器的制備過程Fig.1 Immune sensor preparation process

1.6 檢測方法

用循環(huán)伏安法（Cyclic Voltammetry，CV）對(duì)免疫傳感器不同過程進(jìn)行掃描。工作采用三電極體系，其中修飾電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極。 實(shí)驗(yàn)時(shí)以0.1 mol/L（pH6.0）磷酸緩沖液（PBS）作為測試底液，在-0.4 V~0.2 V電壓范圍內(nèi)掃描，掃描速度為50 mV/s。不另加說明，溫度均為25℃。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 電極在不同修飾過程的電化學(xué)表征

利用電化學(xué)工作站（CHI660C）中CV技術(shù)對(duì)電極在不同修飾過程中進(jìn)行表征，見圖2。圖2中曲線a為裸(GCE)電極。由于玻碳電極不導(dǎo)電，測試底液中無電活性物質(zhì)，此時(shí)沒有出現(xiàn)氧化還原峰[12]。曲線b為電極表面修飾了SiO2-Cs納米復(fù)合物的CV圖。SiO2-Cs納米復(fù)合物不利于電子傳輸，因此也沒有出現(xiàn)氧化還原峰。曲線c為修飾了Thi之后的CV圖。 從圖中明顯可見，電壓在-0.2 V~-0.1 V范圍內(nèi)出現(xiàn)了一對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，此峰為Thi特征峰[7]，因?yàn)門hi是一種良好的電子媒介體。同時(shí)也表明Thi成功修飾在電極表面。曲線d為修飾了nano-Au之后的CV圖。由圖可見，氧化還原峰峰電流值明顯增大。這是由于nano-Au能促進(jìn)電子傳輸，使得峰電流值增大[12]；曲線e、f、g分別為浸泡anti-AFP、BSA，孵育20 ng/mL AFP之后的CV圖?？梢钥闯鲅趸€原峰值逐漸減小。這是由于anti-AFP、BSA、AFP均為蛋白質(zhì)大分子，會(huì)阻礙電子傳輸，使得峰電流值下降[13]。

圖2 修飾電極制備過程的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of the immunoelectrode preparation paocess(a)GCE;(b)SiO2-Cs/GCE;(c)Thi/SiO2-Cs/GCE;(d)nano-Au/ Thi/SiO2-Cs/GCE;(e)anti-AFP/nano-Au/Thi/SiO2-Cs/GCE; (f)BSA/anti-AFP/nano-Au/Thi/SiO2-Cs/GCE;(g)AFP/BSA/ anti-AFP/nano-Au/Thi/SiO2-Cs/GCE

圖3 免疫電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of the immunoelectrode at different scan rate

圖3為免疫傳感器在0.1 mol/L（pH=6.0）的PBS中，掃速分別為50、100、150、200、250、300、350、400 mV/s（從內(nèi)到外）下的CV圖。由圖可見，隨著掃速的增大，氧化還原峰值不斷增加。在50~ 400 mV/s掃速范圍內(nèi)氧化還原峰電流值與掃速均呈良好線性關(guān)系（見插圖），相關(guān)系數(shù)分別為：0.9996和0.9991，說明電極氧化還原受表面吸附的影響[6]。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 測試底液酸度的選擇

測試底液的pH將影響抗體、抗原的活性，同時(shí)還會(huì)影響抗原抗體特異性結(jié)合。試驗(yàn)用CV掃描了測試底液PBS的pH在4.0~8.0范圍內(nèi)，免疫傳感器的響應(yīng)性能。圖4為免疫傳感器在不同pH值下掃描的CV。由圖可得，隨著pH逐漸增大，氧化還原峰電流值逐漸減小。并且，pH值達(dá)到6以后，電流值趨于平穩(wěn)。同時(shí)，氧化峰、還原峰電位隨著pH的增大負(fù)移。說明H+濃度大有利于電子媒介體Thi發(fā)生氧化還原反應(yīng)[14]。但酸度太大會(huì)影響生物分子的活性。因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH為6.0。

圖4 免疫電極在不同pH值下的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of the immunoelectrode in different pH

圖5 免疫傳感器在不同孵育時(shí)間下的CVFig.5 Cyclic voltammograms of the immunoelectrode in different incubation time

2.2.2 孵育時(shí)間的選擇

免疫反應(yīng)受孵育時(shí)間的影響。在實(shí)驗(yàn)中，將已制備好的修飾電極放入20 ng/mL AFP抗原溶液中孵育，依次測定孵育時(shí)間分別為1、3、5、7、10、12、15、20 min CV圖。圖5插圖即為孵育不同時(shí)間后所測循環(huán)伏安圖，可看出隨著時(shí)間的增長，氧化峰電流值逐漸減小，峰電流值變化較大。但在12 min以后，峰電流變化較小，說明此時(shí)免疫反應(yīng)達(dá)到平衡，抗體吸附抗原達(dá)到飽和[15]。故選擇12 min為最佳孵育時(shí)間。

2.2.3 孵育溫度的選擇

抗體，抗原的活性同樣也受溫度的影響。實(shí)驗(yàn)中固定抗原濃度為20 ng/mL，測試底液pH= 6.0，孵育時(shí)間12 min，改變孵育溫度，用CV掃描。從圖6中可見，在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高，氧化峰值減小。說明在適宜溫度范圍內(nèi)，溫度越高越有利于吸附抗原。但當(dāng)溫度達(dá)到35℃后，峰電流值基本不變，說明此時(shí)免疫反應(yīng)達(dá)到平衡[10]?？紤]溫度過高，會(huì)影響蛋白質(zhì)活性，選擇室溫25℃作為反應(yīng)條件。

圖6 免疫傳感器在不同溫度下的循環(huán)伏安圖Fig.6 Cyclic voltammograms of the immunoelectrode in different temperature

2.3 免疫傳感器的性能

2.3.1 免疫傳感器的檢測范圍和檢出限

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，測試免疫傳感器檢測范圍和檢出限。配制成不同濃度的抗原溶液（0.01~ 200 ng/mL），由低濃度到高濃度，將免疫傳感器依次孵育不同濃度抗原12 min后，取出用CV表征。圖7插圖即為在不同濃度抗原中孵育后的CV圖，隨著濃度的增大，氧化還原峰降低。同時(shí)，從圖7可知AFP抗原濃度分別在0.01~1.0 ng/mL和5~200 ng/mL范圍內(nèi)，峰電流與抗原濃度成良好線性關(guān)系。線性方程分別為：Current= -1.51082 c+6.94359和 Current=-0.00639 c+ 5.44035，相關(guān)系數(shù)分別為0.9901和0.9712，檢出下限為0.003 ng/mL。說明該傳感器檢測范圍寬，靈敏度高。主要是Thi和nano-Au的協(xié)同作用，促進(jìn)了電子傳輸。

2.3.2 免疫傳感器的選擇性和抗干擾性

為了檢測免疫傳感器的選擇性和抗干擾性，實(shí)驗(yàn)將免疫傳感器分別置于只含AFP抗原100 ng/mL溶液與含有BSA、賴氨酸、谷氨酸和抗壞血酸等干擾蛋白質(zhì)的100 ng/mL AFP抗原溶液中浸泡12 min后，取出依次用CV表征。從圖8中可以看出兩次掃描峰電流值相差很小，說明該免疫電極具有良好的選擇性和抗干擾性。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)用SiO2-Cs納米復(fù)合物、Thi共同修飾電極構(gòu)建了檢測范圍廣，靈敏度高，抗干擾性強(qiáng)的AFP免疫傳感器。與其他傳統(tǒng)固載方法相比，該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）納米SiO2具有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加了抗體吸附量；（2）Thi的引入，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了免疫傳感器的靈敏度；（3）利用Cs、Thi和nano-Au及抗體蛋白質(zhì)之間的靜電吸附，提高了實(shí)驗(yàn)成功率，同時(shí)也增加了抗體吸附量。該傳感器的制備過程中可操作性強(qiáng)，同時(shí)該傳感器也可應(yīng)用于其他免疫體系的檢測，在臨床醫(yī)學(xué)方面有潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖7 不同濃度抗原下循環(huán)伏安圖Fig.7 Cyclic voltammograms of the immunoelectrode in different AFP concentration濃度：0.01，0.05，0.1，0.5,1,5,10,20,50，80,100,120,150,200 ng/mL

圖8 (a)加有干擾物的循環(huán)伏安圖 (b)只有AFP抗原的循環(huán)伏安圖Fig.8 (a)Cyclic voltammograms of the immunoelectrode have other protein molecules.(b)Cyclic voltammograms of the immunoelectrode only have AFP

[1]賈立永，鄭磊，王前，等.電化學(xué)免疫傳感器及其在臨

床檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010, 31(11):1329-1330.

[2]蔣文，袁若.納米材料在電化學(xué)生物傳感器及生物電分析領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].分析測試學(xué)報(bào)，2011,30(11): 1200-1206.

[3]禹坤.納米二氧化硅的生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代技術(shù)陶瓷，2005，4:28-32.

[4]李曦，劉連利，王莉莉.納米二氧化硅的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].渤海大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版），2006，27(4): 304-308.

[5]Yang M H，Yang Y，Yang H F.Layer-by-layer self-assembled multilayer films of carbon nanotubes and platinum nanoparticles with polyelectrolyte for the fabrication of biosensors[J].Biomaterials，2006，27(2):246-255.

[6]安海珍，袁若，柴雅琴，等.基于聚硫堇、DNA/納米銀復(fù)合物共修飾癌胚抗原免疫傳感器的研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2008，66(6):633-638.

[7]閔麗根，袁若，柴雅琴，等.基于納米金與碳納米管-納米鉑-殼聚糖納米復(fù)合物固定癌胚抗原免疫傳感器的研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2008,66（14）:1676-1680.

[8]Nara yanan R，EL-sayed M A.Effect of colloidal catalysis on the nanoparticle size distribution:dendrimer-Pd vs PVP-Pd nanoparticles catalyzing the suzuki coupling reaction[J].J.Phys.Chem.B.，2004，108(25):8572-8580.

[9]Zhuo Ying，Yuan Ruo，Chai Yaqin，et al.Enhancement of carcinoembryonicantibody immobilization on gold electrode modified by gold nanoparticles and SiO2/Thion-ine nanocomposite[J].Journal of Electroanalytical Chemistry，2009，628(1-2):90-96.

[10]歐朝鳳，袁若，柴雅琴，等.基于硫堇/碳納米管修飾電極的過氧化氫生物傳感器[J].分析化學(xué)研究簡報(bào)，2007，35(7):1011-1014.

[11]范艷玲，劉藝芳，呂雪莉，等.硅酸乙酯為原料反相微乳液法制備納米二氧化硅[J].化學(xué)工業(yè)與工程，2010，27(5)：378-410.

[12]冉小琪，袁若，柴雅琴，等.基于納米金、鐵氰化鎳納米顆粒共修飾的電流型甲胎蛋白免疫傳感器的研究[J].化學(xué)傳感器，2010，30(1)：36-41.

[13]朱宇萍，袁若，柴雅琴，等.基于碳納米管/L-半胱氨酸/ Fe3O4@Au納米復(fù)合材料的電流型甲胎蛋白免疫傳感器的研究[J].分析化學(xué)，2012,40：359-364.

[14]Liu Ya xi，Yuan Ruo，Chai Ya qin，et al.Preparation of a composite film electrochemically deposited with chitosan and gold nanoparticles for the determination of α-1-fetoprotein[J].Bioprocess Biosyst Eng，2010，33(5)：613-618.

[15]柴榮，袁若，柴雅琴，等.鄰氨基苯甲酸膜及納米金固定的亞甲基藍(lán)為介體的乙型肝炎免疫傳感器[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，29(9)：52-56.

An immunosensor based on silica-chitosan nano composites

Zhu Yu-ping*,Xu Qiong
(College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University，Neijiang 641112，China)

First,the preparation of silica-chitosan nano composites.Then modify the surface of glassy carbon electrode,using nano silicon dioxide high porous structure and surface energy of adsorption electronic media body thionine.Through thionine amino adsorption of nanometer gold,which immobilized AFP antibody,using bovine serum albumin closed nonspecific adsorption sites,successfully obtained a new kind of AFP immune sensor.Under the optimal experimental conditions,the immune sensor detection range in 0.01~1.0 ng/mL and 5~200 ng/mL show good linear relations,detecting limit was 0.003 ng/mL.Results show that the sensor sensitivity,simple preparation method.

immunosensor;AFP；SiO2;chitosan;nano composite

四川省教育廳科研項(xiàng)目（15ZA0292）

*通信聯(lián)系人，Tel：13696067037，E-mail：judy20060830@163.com