吳偉澎，李偉，程鵬，姜代勛，陳武

(1．北京農(nóng)學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室;2．北京農(nóng)學院動物科學技術學院，北京 102206)

椎間盤脫出是人和動物常見病，針灸療法顯示了良好的療效。髓核脫出壓迫脊髓導致機能障礙與微循環(huán)障礙和微血管數(shù)量變化密切相關［1］。本實驗室前期研究表明椎間盤脫出壓迫模型大鼠的脊髓微血管數(shù)量異常減少，而電針組能夠改善這種異常變化［2］，但其機理不明。血管生成因子與血管生成抑制因子、血管破壞因子之間的動態(tài)平衡是維持微血管的數(shù)量和結構穩(wěn)定性的重要因素［3］，本研究通過觀察血管生成因子血管生成素1 (angiopoietin-1，Ang-1)、血管生成素2 (angiopoietin-2，Ang-2)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及它們的受體Tie-1、Tie-2、Flt-1，血管生成抑制因子凝血酶敏感蛋白1 (thrombospondin-1，Tsp-1)，細胞凋亡因子caspase-3 在脊髓受壓損傷后表達量的變化以及電針對其的影響，為針灸治療椎間盤病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

東華牌電針治療儀(WQ-6F);毫針(蘇州天協(xié)針灸器械有限公司，規(guī)格0.2 ×25 mm);微動力儀(Surgic XT，NSK，Japan);Step One Plus 熒光定量PCR 儀(ABI);戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司，德國進口分裝);注射用青霉素鉀160 萬單位、注射用硫酸鏈霉素50 萬單位;TRIzol (Invitrogen);Revert Aid TM First Stand cDNA Synthesis Kit (Thermo);Trans Start Grenn qPCR Super Mix (Trans Gen Biotech)。

1.2 實驗動物分組

清潔級雄性SD 大鼠18 只，體重180 ～200 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供【SCXK-(軍)2012-004】，實驗在北京農(nóng)學院屏障動物實驗設施進行【SYXK (京)2010 -0003】，并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。實驗動物隨機分成三組，即電針治療組(n =6)、模型組(n=6)、假手術對照組(n =6)。電針組和模型組進行脊髓壓迫，假手術組只暴露脊髓不壓迫。電針組進行電針治療，對照組和假手術組不做任何治療。

1.3 椎間盤脫出模型制作

大鼠椎間盤脫出模型參考文獻［4］，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/(kg·bw)進行麻醉，俯臥保定，以胸腰段椎體為中心剃毛、消毒，以第一腰椎(L1)為中心，沿背正中線切開皮膚約2 cm，分離筋膜、背最長肌、多裂肌，充分暴露L1的棘突、椎板和關節(jié)突，微動力儀小心打磨椎板，暴露脊髓背側，將自制的硅膠片從L1的左側填塞入至T13段脊髓的左腹側位，假手術組則只暴露脊髓，不進行壓迫。分層縫合肌肉、皮膚關閉切口。術后每只大鼠肌肉注射青霉素鉀30 000 U/(kg·bw);硫酸鏈霉素15 mg/(kg·bw)，2 次/日，連用3 d。單獨分籠飼養(yǎng)，正常供給飲水和飼料，人工幫助排尿、排便，每日三次。

1.4 穴位選取與電針方法

電針治療組，根據(jù)本課題組前期研究，選用以下三組穴位:左右膀胱俞(BL28);左側足三里(ST36)、趾間(EX-LE10);右側足三里(ST36)、趾間(EX-LE10)，每組分別接通電針儀，頻率2 Hz，幅度為5，每天一次，每次20 min，連續(xù)治療7 d。

1.5 運動機能評分

采用BBB 運動機能評分法［5］，于術前、術后每日，對大鼠左、右后肢分別進行運動機能評分，其中第1 天在大鼠從麻醉狀態(tài)完全清醒后開始評分。

1.6 標本收集

術后第7 天，在麻醉狀態(tài)下，500 mL 生理鹽水進行心臟灌注，在冰塊上快速取出脊髓，從壓迫正中向頭側取3 mm 用于RT-PCR 檢測，向尾側取3 mm用于病理學檢測。

1.7 病理學檢測

脊髓組織在4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、組織包埋、切片、HE 染色，顯微鏡下觀察脊髓損傷情況。

1.8 RT-PCR 檢測

取50 mg 脊髓組織，用TRIzol 提取總RNA，按RevertAid TM First Stand cDNA Synthesis Kit 說明書反轉錄為cDNA，根據(jù)文獻［6，7］選取與血管生成相關因子引物(見表1)，擴增條件:95℃預變性2 min;94℃20 s;57 ～63℃20 s;72℃30 s，循環(huán)40 次?？截怌T 值，采用2－ΔΔCt法進行分析。

表1 血管生成相關因子基因引物Tab．1 The primers of the related-angiogenic genes

1.9 分析方法

2 結果分析

2.1 電針對椎間盤脫出模型大鼠后肢運動機能的影響

造模后大鼠的運動機能評分迅速降為零，隨著時間的延長，后肢運動機能逐漸恢復(見圖1-A，B)。對第1、4、7 天數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，由圖1-C 和圖1-D 可知，在第4 天和第7 天，電針組大鼠的左、右后肢運動機能評分極顯著高于模型組(P ＜0.01)。電針組第7 天大鼠的左、右后肢運動機能評分極顯著高于第4 天(P ＜0.01);模型組第7 天大鼠的左后肢運動機能評分與第4 天相比差異無顯著性(P ＞0.05)，第7 天右后肢運動機能評分顯著高于第4 天(P ＜0.05)。表明電針能顯著改善椎間盤脫出模型大鼠的后肢運動機能。

2.2 組織病理學變化

電針組神經(jīng)元多完好，尼氏小體可見，灰質(zhì)與白質(zhì)分界明顯，軸索與髓鞘多完整排列有序，偶見空泡化。模型組，神經(jīng)元少見且多損傷，尼氏小體消失，灰質(zhì)與白質(zhì)邊界模糊不清，殘存的白質(zhì)中可見到不完整的軸索和髓鞘，多空泡化(見圖2)。

2.3 電針對血管生成相關因子的mRNA 表達的影響

由圖3 可知，模型組與假手術組相比Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1 極顯著升高(P ＜0.01)，VEGF、Flt-1 差異無顯著性(P ＞0.05);模型組與電針組相比Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1極顯著升高(P ＜0.01)，Ang-1、VEGF、Flt-1 無顯著性變化(P ＞0.05);電針組與假手術組各指標差異均無顯著性(P ＞0.05)。結果顯示，模型組Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1 的mRNA 的表達量異常高于假手術組和電針組，電針組與假手術組各指標差異均無顯著性，提示電針能維持血管生成相關因子的mRNA 表達的相對穩(wěn)定并使之接近機體正常水平。

圖1 電針對椎間盤脫出模型大鼠后肢運動機能的影響Fig．1 Effects of electroacupuncture on the hind limb motor function in the rat models of intervertebral disc herniation

圖2 電針組(A)，假手術組(B)，模型組(C)，脊髓腹角形態(tài)學觀察(標尺=50 μm)Fig．2 Pathological changes in the anterior horn of spinal cord in the rats of the electroacupuncture group(A)，sham operation group (B)，and model group (C)．HE staining，bar=50 μm．

圖3 電針對血管生成相關因子mRNA 表達的影響Fig．3 Effects of electroacupuncture on the changes of mRNA expressions of angiogenesis-related factors

3 討論

脊髓血管能為脊髓組織運送營養(yǎng)物質(zhì)，同時移除組織代謝產(chǎn)物，對受損脊髓組織的修復意義重大。而血管結構的穩(wěn)定與血管生成因子和血管生成抑制因子與細胞凋亡因子關系密切［8］。

脊髓組織受到打擊、壓迫等損傷后，受損部位出血、水腫、缺氧，局部組織穩(wěn)態(tài)受到破壞，導致大量鈣離子內(nèi)流，自由基大量產(chǎn)生，單胺類物質(zhì)大量釋放，致使血管收縮，脊髓微血管灌注量顯著下降，進一步加劇組織缺血缺氧的狀態(tài)［9］。在低氧環(huán)境下機體過量表達的缺氧誘導因子-1α (hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)與VEGF 基因轉錄啟動子的結合位點結合，促進VEGF 的表達［10］。VEGF 能促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，促進血管的新生。新生血管由于缺少血管周細胞和基質(zhì)細胞，結構穩(wěn)定性差，滲透性增強，加劇組織出血與水腫，造成脊髓組織二次損傷［11］。在本次試驗中，模型組VEGF 和Flt-1 的表達量有所上調(diào)，但與電針組和假手術組相比無統(tǒng)計學意義。

Tie-1、Tie-2 是一類酪氨酸受體，Tie-1 能維持血管內(nèi)皮細胞結構及功能的完整性，促進新生血管的成熟，其配體目前仍不十分清楚;Tie-2 的配體為Ang-1 和Ang-2［12］。Ang-1 和Ang-2 能競爭性與Tie-2 結合并與VEGF 協(xié)同作用，參與血管新生，并且在維持新生血管的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。Ang-1 與Tie-2 結合時表現(xiàn)為維持血管結構正常;Ang-2 與Tie-2 結合表現(xiàn)為打破血管的正常結構，當在VEGF高度表達的環(huán)境下，Ang-2 與Tie-2 結合有利于內(nèi)皮細胞遷移，促進血管新生，反之則表現(xiàn)為血管的退變［13］。本研究結果中，模型組的Ang-2 與Tie-2 的mRNA 表達都顯著上調(diào)，VEGF 的mRNA 表達雖有上調(diào)，但與電針組和假手術組相比無顯著差異，提示模型組存在VEGF 低表達環(huán)境引起血管退變的因素。在VEGF 低表達環(huán)境中Ang-2 與Tie-2 的結合表現(xiàn)為血管退變，而在模型組Ang-2 與Tie-2 的表達顯著高于電針組(P ＜0.01)，提示電針能夠減少Ang-2 與Tie-2 的結合，從而有利于維持血管的正常結構。另外，電針組與假手術組的Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie-2 均無顯著差異，提示電針能夠調(diào)節(jié)Ang-1、Ang-2、Tie-2、VEGF 之間的平衡使之接近正常機體水平，維持受損脊髓的血管生成相關因子的相對穩(wěn)定。本課題組前期研究表明，電針能顯著提高壓迫部位脊髓血流灌注量，促進神經(jīng)機能的恢復［4］。本研究觀察到電針下調(diào)VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-2的表達，這可能與電針增加壓迫部位脊髓血流灌注量，緩解局部缺氧環(huán)境，減輕血管新生造成的二次損傷等相關［11］。

Tsp-1 作為強效血管生成的負性調(diào)節(jié)因子之一，能與血管內(nèi)皮細胞上的CD36 受體作用，影響血管內(nèi)皮細胞釋放VEGF，抑制血管內(nèi)增殖、分化和遷移，從而抑制血管的生成;并能誘導血管內(nèi)皮的凋亡，破壞血管結構的穩(wěn)定［14］。Caspase-3 處于凋亡有序級聯(lián)反應的下游，是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，它的活化是凋亡進入不可逆階段標志。TSP-1 能與細胞膜上的CD47 受體結合，上調(diào)Caspase-3 的表達［15］，誘導細胞凋亡。本研究結果顯示模型組Tsp-1 和Caspase-3 的表達顯著上調(diào)，而電針能極顯著降低TSP-1、Caspase-3 的mRNA 表達，提示電針能夠抑制血管生成負性調(diào)節(jié)因子的表達，從而為血管的生成和穩(wěn)定提供有利環(huán)境。萬賽英等［16］研究也表明電針可以上調(diào)Ang-1 及下調(diào)TSP-1的表達，促進腦缺血區(qū)的血管的重建。余曉慧［17］等研究表明電針能通過抑制Caspase-3 在大鼠脊髓損傷神經(jīng)元中表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡，減輕了脊髓繼發(fā)性損傷，促進神經(jīng)功能恢復。

脊髓壓迫損傷后血管生成相關因子mRNA 表達異常，電針能夠下調(diào)Ang-2、Tie-2、Tsp-1 和Caspase-3 的表達，從而使血管生成促進因子和抑制因子趨于正常水平，為受損脊髓組織修復提供有利條件。

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