潘志強(qiáng)，方肇勤，盧文麗，劉小美，張園園

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)機(jī)制在肝臟、主動(dòng)脈研究很深入［1，2］，而膽固醇作為類固醇激素合成的前體物質(zhì)，如何被腎上腺細(xì)胞用于合成皮質(zhì)激素以適應(yīng)各種應(yīng)激尚缺乏深入研究?，F(xiàn)有研究表明［3］，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞通過3 種方式獲得類固醇激素合成的原料:①攝取血液膽固醇(人主要是低密度脂蛋白膽固醇，嚙齒類動(dòng)物主要是高密度脂蛋白膽固醇)，②在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中從頭合成膽固醇，③將脂滴中酯化膽固醇酶解為游離膽固醇。一旦細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚過量，則通過細(xì)胞膜上三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體A1 和G1 將膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外。此外，肝X 受體、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體等信號(hào)分子還參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇進(jìn)出與轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)［4，5］，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞正是通過這一精密調(diào)控機(jī)制以確保胞內(nèi)膽固醇的穩(wěn)態(tài)。

然而，在腫瘤狀態(tài)下，機(jī)體為適應(yīng)腫瘤的慢性應(yīng)激，腎上腺分泌皮質(zhì)激素以抵御應(yīng)激反應(yīng)，那么，腫瘤大小是否對(duì)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)有影響，尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本文在課題組對(duì)H22 肝癌小鼠腎上腺皮質(zhì)酮合成與分泌的研究基礎(chǔ)上［6］，重點(diǎn)比較了不同腫瘤大小的肝癌小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)分子的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)腫瘤越大者，小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞對(duì)膽固醇需求越高，用于皮質(zhì)激素的合成以抵御腫瘤的慢性應(yīng)激。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)KM 雄性小鼠250 只，7 周齡，體重(21±1)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2007-0005】;實(shí)驗(yàn)在上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心設(shè)施內(nèi)進(jìn)行【SYXK(滬)2009-0069】。

1.1.2 試劑

乙二胺四乙酸二鉀鹽(EDTA-2K)抗凝劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán);總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Trizol 購(gòu)自Invitrogen，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT Reagent Kit 和PCR 試劑盒SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)II 購(gòu)自TaKaRa 公司。SRB1、ApoA1、GAPDH 抗體購(gòu)自Abcam 公司，BCA 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑ECL 試劑盒購(gòu)自Pierce公司。

1.1.3 儀器

Elx800 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-TEK 公司)，Elx50型自動(dòng)洗板機(jī)(美國(guó)Bio-TEK 公司)。5417R 型冷凍臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司)，Eco-Illumina實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)Illumina 公司)，GBOX CheMI 凝膠掃描與分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 H22 肝癌小鼠模型建立

隨機(jī)取30 只小鼠作正常對(duì)照組，另220 只小鼠腋下接種H22 肝癌腹水癌細(xì)胞(課題組前期采用并保種凍存于-196℃液氮中)，每只0.2 mL(細(xì)胞濃度1 ×107個(gè)/mL)。

1.2.2 小鼠分組、處死、取材與組織濕重

采用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量小鼠腋下腫瘤最長(zhǎng)直徑(a)和最短橫徑(b)，通過腫瘤體積預(yù)測(cè)公式V =0.5ab2，估算腫瘤大小，按照腫瘤體積大小排序，選擇瘤體最大者18 只，瘤體最小者18 只，同時(shí)選擇體重居中的18 只正常小鼠作為正常對(duì)照組，于接種腫瘤細(xì)胞后第11 天處死瘤體大組、瘤體小組和正常組小鼠，摘眼球取血，常規(guī)分離血漿，剝離腫瘤并稱重，多余小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 血脂含量檢測(cè)

按照試劑盒及所提供的方法進(jìn)行操作，檢測(cè)血漿總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇含量。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)基因表達(dá)

上下游引物序列采用Primer3 (v．0.4.0)在線軟件合成(參見表1)，委托Life Technologies 公司上海合成部完成。按照Trizol 試劑盒說明書抽提腎上腺總RNA;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為37℃×15 min，85℃×5 s，4℃(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序結(jié)束，可以取出，也可以過任意時(shí)間后取出);PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5℃×3 min，95℃×30 s，60℃×30 s，40 cycles?；蛳鄬?duì)表達(dá)量分析方法:采用2－ΔΔCT法分析［7］，以正常組作為對(duì)照組，以GAPDH 和β-actin 基因Ct 均值作為內(nèi)參組，ΔCt=Ct目的基因－ Ct內(nèi)參基因(其中，Ct 值為擴(kuò)增n 個(gè)循環(huán)基因的熒光數(shù)值)，ΔΔCt=ΔCT 腫瘤組－ ΔCT 對(duì)照組，目的基因相對(duì)表達(dá)量=2－ΔΔCT。

表1 小鼠上、下游引物序列Tab．1 Sequences of the mose primers

1.2.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

采用RIPA 裂解液裂解腎上腺組織，依據(jù)BCA蛋白質(zhì)定量試劑方法進(jìn)行蛋白定量，采用10% SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白，并進(jìn)行PVDF 轉(zhuǎn)膜與5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(SRB1 抗體1∶1000 稀釋、ApoA1 抗體1 ∶2000 稀釋、GAPDH 抗體1 ∶2000 稀釋)4℃過夜，用TBST 洗滌，再加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗(1∶2000 稀釋)孵育，TBST 洗滌，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，最后用GBOX Che-MI 凝膠掃描與分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件，兩組比較采用t 檢驗(yàn)，三組比較采用單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠去瘤體重與腫瘤質(zhì)量比較

與正常組比較，兩組肝癌小鼠去瘤體重差異無(wú)顯著性;與瘤體小組比較，瘤體大組小鼠腫瘤質(zhì)量明顯增大(P ＜0.05)(見表2)。

2.2 血脂含量比較

與正常組比較，兩組肝癌小鼠血漿TC 和TG 差異均無(wú)顯著性，而HDL-C 顯著下降(P ＜0.05)，提示肝癌小鼠膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟的代謝能力下降(見表3)。

表2 各組小鼠去瘤體重與腫瘤質(zhì)量比較(±s，n =18)Tab．2 Comparison of body weight and tumor weight among the mice of all groups

表2 各組小鼠去瘤體重與腫瘤質(zhì)量比較(±s，n =18)Tab．2 Comparison of body weight and tumor weight among the mice of all groups

注:與瘤體小組比較，▲P ＜0.05。Note．▲P ＜0.05 compared with the small tumor group．

組別Groups去瘤體重/g Body weight腫瘤/g Tumor weight正常組Control group 27.10±1.44 －瘤體大組Large tumor group 29.45±3.67 3.05±0.64 ▲瘤體小組Small tumor group 28.47±2.05 1.51±0.43

2.3 腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞膽固醇攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)

與正常組比較，瘤體大組肝癌小鼠腎上腺膽固醇攝取分子高密度脂蛋白受體(Srb1)和低密度脂蛋白受體(Ldlr)基因表達(dá)顯著升高(P ＜0.05)，且瘤體大組肝癌小鼠Ldlr 基因表達(dá)顯著高于瘤體小組(P ＜0.05)。Ldlr 通過質(zhì)膜內(nèi)吞進(jìn)入胞內(nèi)體，釋放膽固醇并通過含START 結(jié)合域蛋白3(Stard3)、C型尼曼-匹克病基因(Npc1 和Npc2)等蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然而這幾個(gè)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)分子基因表達(dá)在各組間差異無(wú)顯著性(見表4)。

表3 各組小鼠血脂含量比較(±s，mmol/L)Tab．3 Comparison of blood TC，TG and HDL-C among the mice of all groups

表3 各組小鼠血脂含量比較(±s，mmol/L)Tab．3 Comparison of blood TC，TG and HDL-C among the mice of all groups

注:與正常組比較，* P ＜0.05。Note．* P ＜0.05 compared with the control group．

組別Groups總膽固醇TC高密度脂蛋白膽固醇HDL-C甘油三酯TG正常組Control group 4.39±0.61 1.18±0.28 1.27±0.35瘤體大組Large tumor group 3.52±0.64 0.87±0.13* 1.70±0.39瘤體小組Small tumor group 3.49±0.72 0.62±0.18*1.65±0.45

表4 各組小鼠腎上腺細(xì)胞膽固醇攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)(±s)Tab．4 Comparison of the expression of cholesterol uptake and transport-related genes among all groups

表4 各組小鼠腎上腺細(xì)胞膽固醇攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)(±s)Tab．4 Comparison of the expression of cholesterol uptake and transport-related genes among all groups

注:與正常組比較，* P ＜0.05;與瘤體小組比較，▲P ＜0.05;Stard3 又名Mln64，Npc1 又名Nmf164。Note．* P ＜0.05，compared with the control group;▲P ＜0.05，compared with the small tumor group．Stard3 also known as Mln64．Npc1 also known as Nmf164．

組別Groups Srb1 Ldlr Npc1 Npc2 Stard3正常組Control group 1.00±0.21 1.00±0.13 1.00±0.21 1.00±0.02 1.00±0.28瘤體大組Large tumor group 1.89±0.24* 2.20±0.47＊▲ 1.24±0.11 0.83±0.09 1.06±0.08瘤體小組Small tumor group 1.35±0.21 1.33±0.15 1.16±0.13 0.92±0.06 1.29±0.11

2.4 腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞膽固醇合成、轉(zhuǎn)化與流出相關(guān)基因表達(dá)

與正常組比較，瘤體大組肝癌小鼠?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(Acat1)與膽固醇逆向流出胞外的三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體G1(Abcg1)基因表達(dá)顯著下降(P ＜0.05);與瘤體小組比較，瘤體大組肝癌小鼠酯化膽固醇的激素敏感脂肪酶(Lipe)、Acat1、Abca1 基因表達(dá)顯著下調(diào)(P ＜0.05);然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇合成的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(Hmgcr)各組間差異無(wú)顯著性(見表5)。

2.5 調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)分子的基因表達(dá)

與正常組比較，瘤體大組肝癌小鼠肝X 受體β(Lxrβ)與載脂蛋白a1(Apoa1)基因表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，瘤體小組肝癌小鼠固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(Srebp-1c)、Lxrβ 基因 表達(dá)明 顯升高(P ＜0.05)，而Apoa1 表達(dá)顯著下調(diào)(P ＜0.05);與瘤體小組比較，瘤體大組肝癌小鼠Srebp-1c 和Apoa1 顯著升高(P ＜0.05)，而肝X 受體α(Lxrα)與載脂蛋白e(Apoe)基因表達(dá)各組間差異無(wú)顯著性(見表6)。

2.6 腎上腺SRB1 與ApoA1 蛋白表達(dá)

與正常組比較，瘤體大組肝癌小鼠腎上腺SRB1蛋白表達(dá)顯著升高(P ＜0.05)，而瘤體小組ApoA1蛋白表達(dá)顯著下降(P ＜0.05);且瘤體大組肝癌小鼠ApoA1 蛋白表達(dá)顯著高于瘤體小組(P ＜0.05)(見圖1A、B)。

表5 各組小鼠腎上腺細(xì)胞膽固醇合成、轉(zhuǎn)化、流出相關(guān)基因表達(dá)(±s)Tab．5 Comparison of expression of cholesterol synthesis，transform and efflux-related genes in all groups

表5 各組小鼠腎上腺細(xì)胞膽固醇合成、轉(zhuǎn)化、流出相關(guān)基因表達(dá)(±s)Tab．5 Comparison of expression of cholesterol synthesis，transform and efflux-related genes in all groups

注:與正常組比較，* P ＜0.05;與瘤體小組比較，▲P ＜0.05;Lipe 又名Hsl。Note．* P ＜0.05，compared with the control group;▲P ＜0.05，compared with the small tumor group．Lipe also known as Hsl．

組別Groups Hmgcr Lipe Acat1 Abca1 Abcg1正常組Control group 1.00±0.33 1.00±0.09 1.00±0.06 1.00±0.21 1.00±0.37瘤體大組Large tumor group 1.03±0.24 0.91±0.15▲ 0.68±0.05＊▲ 0.76±0.13▲ 0.54±0.08*瘤體小組Small tumor group 0.78±0.01 1.36±0.08 1.06±0.06 1.19±0.05 0.76±0.09

表6 各組小鼠腎上腺細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)分子基因表達(dá)(±s)Tab．6 Comparison of the expression of cholesterol homeostasis-related genes in the mice of all groups

表6 各組小鼠腎上腺細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)分子基因表達(dá)(±s)Tab．6 Comparison of the expression of cholesterol homeostasis-related genes in the mice of all groups

注:與正常組比較，* P ＜0.05;與瘤體小組比較，▲P ＜0.05。Note．* P ＜0.05，compared with the control group;▲P ＜0.05，compared with the small tumor group．

組別Groups Srebp-1c Lxrα Lxrβ Rxrα Apoa1 Apoe正常組Control group 1.00±0.12 1.00±0.25 1.00±0.09 1.00±0.10 1.00±0.21 1.00±0.09瘤體大組Large tumor group 1.06±0.19▲ 0.81±0.13 1.52±0.32* 1.30±0.28 1.79±0.16＊▲ 1.11±0.08瘤體小組Small tumor group 1.88±0.21* 1.12±0.12 1.40±0.06* 1.38±0.06* 0.18±0.01*1.24±0.03

圖1 SRB1(A)、ApoA1(B)蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig．1 SRB1 (A)and ApoA1 (B )protein relative expression in the mice

3 討論

膽固醇是腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞合成類固醇激素的重要前體物質(zhì)，在肝癌疾病狀態(tài)下，機(jī)體為適應(yīng)腫瘤的慢性反復(fù)應(yīng)激，腎上腺皮質(zhì)需合成糖皮質(zhì)激素以抵御應(yīng)激反應(yīng)，因此，維持腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞充裕的膽固醇是必需的。課題組對(duì)各組小鼠血漿激素檢測(cè)結(jié)果表明［6］，腫瘤形成后，小鼠血漿皮質(zhì)酮水平均高于正常對(duì)照組，且瘤體越大者，血漿促腎上腺皮質(zhì)激素含量顯著升高，并存在垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的負(fù)反饋機(jī)制。那么，對(duì)于皮質(zhì)激素合成前期過程而言，與肝細(xì)胞、主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞類似，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞也存在一套精密的調(diào)控膽固醇穩(wěn)態(tài)機(jī)制，既可通過質(zhì)膜上高密度脂蛋白受體和低密度脂蛋白受體攝入血液中的膽固醇并儲(chǔ)存于脂滴中備用，又可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中從頭合成膽固醇，此外，胞內(nèi)過量的膽固醇還將通過三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體相關(guān)蛋白逆向流出胞外，而且，肝X 受體、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體等信號(hào)分子還參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇的維穩(wěn)過程［8，9］。因此，生理狀態(tài)下，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞能充分協(xié)調(diào)有效利用各種途徑的膽固醇并轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)合成類固醇激素，在腫瘤病理狀態(tài)下，有報(bào)道顯示膽固醇代謝、血清膽固醇水平及膽固醇合成抑制劑與結(jié)直腸癌的關(guān)系密切［10］，那么，在腫瘤慢性應(yīng)激過程中，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞對(duì)膽固醇的利用如何?我們以H22 肝癌小鼠為觀察對(duì)象，深入研究不同大小肝癌的小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞膽固醇攝入、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)化、合成、流出及其參與維穩(wěn)的調(diào)控分子表達(dá)差異，以闡明腫瘤對(duì)腎上腺皮質(zhì)激素合成前膽固醇利用與穩(wěn)態(tài)的影響。

基于Srb1 與Apoa1 協(xié)同作用是小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞攝取血漿膽固醇的主要方式，而Ldlr 對(duì)膽固醇的內(nèi)吞作用也很重要，結(jié)果表明腫瘤越大，肝癌小鼠腎上腺Srb1、Apoa1、Ldlr 基因表達(dá)升高越顯著(P＜0.05)，相應(yīng)的蛋白表達(dá)檢測(cè)顯示腫瘤大組腎上腺SRB1 蛋白表達(dá)顯著升高(P ＜0.05)、而ApoA1蛋白表達(dá)在腫瘤大組明顯高于腫瘤小組(P ＜0.05)，提示腫瘤越大，肝癌小鼠為適應(yīng)腫瘤慢性反復(fù)的應(yīng)激，需要攝取更多的膽固醇用于合成皮質(zhì)激素以抵御應(yīng)激。Lipe 主要將脂滴中酯化膽固醇分解為游離膽固醇，而Acat1 則是將攝入的膽固醇通過酯化形式儲(chǔ)存于脂滴中，結(jié)果顯示腫瘤大組肝癌小鼠腎上腺Lipe 和Acat1 基因表達(dá)顯著低于腫瘤小組(P ＜0.05)，提示腫瘤大的肝癌小鼠為適應(yīng)腫瘤慢性反復(fù)的應(yīng)激，隨時(shí)啟動(dòng)fight or flight response、相比脂滴中膽固醇的儲(chǔ)備量減少。然而，Abca1 和Abcg1主要負(fù)責(zé)將胞內(nèi)過量的膽固醇逆向轉(zhuǎn)出胞外，結(jié)果顯示腫瘤大組肝癌小鼠腎上腺Abca1 和Abcg1 基因表達(dá)顯著低于腫瘤小組(P ＜0.05)，提示腫瘤大的肝癌小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流程減少，主要用于線粒體內(nèi)合成皮質(zhì)激素。然而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身合成膽固醇的關(guān)鍵酶Hmgcr 在各組間無(wú)顯著性變化。

細(xì)胞主要通過調(diào)節(jié)膽固醇的胞內(nèi)合成、胞外攝取、酯化及外流等途徑之間的平衡以維持正常的胞內(nèi)膽固醇濃度，其中，Lxr 和Srebps 對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡發(fā)揮重要作用。結(jié)果顯示腫瘤大組肝癌小鼠腎上腺Srebp-1c、Lxrα 與Rxrα 基因表達(dá)無(wú)明顯變化，而腫瘤小組Srebp-1c、Lxrβ 與Rxrα 基因表達(dá)顯著升高(P ＜0.05)，提示腫瘤越大，因膽固醇更多用于運(yùn)輸至線粒體內(nèi)合成皮質(zhì)激素、流出胞外減少，相應(yīng)地調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的能力減弱。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌狀態(tài)下，小鼠血漿HDL-C 含量下降，提示肝臟膽固醇代謝能力減弱，為適應(yīng)腫瘤慢性反復(fù)的應(yīng)激，瘤體越大者，維持胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)能力越弱，即儲(chǔ)存于脂滴和流出胞外的膽固醇減少，相反，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞通過攝取血膽固醇并即刻轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)合成糖皮質(zhì)激素，而以適應(yīng)機(jī)體的各種應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)合課題組張園園等研究結(jié)果［11］，化療藥物局部介入治療聯(lián)合索拉非尼灌胃治療對(duì)H22 肝癌小鼠抑瘤作用好，且對(duì)中醫(yī)氣血陰陽(yáng)證候有影響，本研究結(jié)果將有助于從內(nèi)分泌角度拓展認(rèn)識(shí)腫瘤對(duì)機(jī)體的影響。

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