朱艷含，羅勇 ，胥虹貝，王盼欣

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 重慶市神經(jīng)病學重點實驗室，重慶 400016)

缺血性卒中(ischemic stroke)，約占全部腦卒中的70%，嚴重威脅著人類的生命健康。如何改善急性腦缺血后的血供，增加缺血區(qū)的血管再生從而促進神經(jīng)功能的恢復日益成為現(xiàn)今研究的熱點。內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有較強促血管再生能力的一種干細胞。研究表明，EPCs 主要存在于機體的骨髓中，在某些病理生理環(huán)境下，可以從骨髓動員至外周血循環(huán)［1］。當機體發(fā)生急性腦梗死時，如何更加有效地調(diào)動內(nèi)源性(即骨髓內(nèi))EPCs 參與腦梗死后的血管再生是目前研究的熱點之一。前期研究發(fā)現(xiàn)電針可促進腦梗死大鼠的血流恢復及血管再生，并改善其神經(jīng)功能癥狀［2－4，13］，但具體機制尚不十分明確。研究表明，eNOS 的磷酸化可促進NO 的釋放并激活MMP－9，進而促進內(nèi)源性EPCs 的釋放［5－6］。本研究將電針與eNOS 通路相結(jié)合來研究局灶腦缺血/再灌注后內(nèi)源性EPCs 的動員情況，進一步探討電針治療腦梗死的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級成年雄性SD 大鼠100 只，250 ～300 g，由重慶醫(yī)科大學動物中心【SCXK(渝)2012－0002】提供，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗研究中心【SYXK(渝)2010－0002】提供實驗操作平臺，并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。100 只大鼠隨機分為正常組(N 組)、模型組(I/R 組)、模型+電針組(I/RE 組)、模型+電針+L－NAME 組(I/REL 組)，除N 組外的其余三組根據(jù)局灶腦缺血1.5 h 再灌注后的觀察時間點，分為1、2、7 d 三個亞組，各亞組10 只。

1.2 主要試劑

兔抗大鼠VEGFR2 抗體購自CST 公司，Biotin－KDR 購自Novus Biology 公司，F(xiàn)ITC－鏈球菌抗生物素蛋白購自eBiosciense 公司，小鼠抗大鼠CD34 抗體購自Santa Cruz Biotechnology 公司，L－NAME 購自北京碧云天公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，熒光定量PCR 相關試劑購自Takara 公司。

1.3 動物模型制備及評判標準

線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈局灶腦缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)［7－8］。缺血1.5 h。大鼠清醒后根據(jù)Longa 等［9］5 分制評分標準對大鼠進行評分。以評分為2、3 分為納入標準。因各種原因不能納入實驗的大鼠，相應組別通過隨機抽樣原則補齊。

1.4 電針刺激方法及腹腔給藥

針刺方法:選擇大鼠“百會”穴(GV 20)及左側(cè)“四關”穴(合谷LI 4/太沖LR 3)作為針刺穴位。取華佗牌不銹鋼銀針(直徑為0.38 mm，長度為1 寸)一根斜刺“百會”穴;兩根直刺“合谷”穴，間距約2 mm;兩根直刺“太沖”穴，間距約2 mm。連接電針治療儀，頻率為2/20 Hz，波型為疏密波，針刺20 min，每日一次，強度以大鼠左側(cè)肢體輕微顫動為宜。腹腔注射L－NAME(eNOS 抑制劑):造模成功后，立即給予藥物抑制組大鼠腹腔注射L－NAME，注射濃度為8 mg/kg，配藥濃度為8 mg/mL (每8 mg 的LNAME 溶于1 mL 的生理鹽水)［10］。

1.5 取樣及檢測

1.5.1 取材

每組取5 只大鼠到相應觀察時間點時，采集腹主動脈血約2 mL，流式細胞學檢測備用;預冷的PBS 沖出雙側(cè)后肢骨腔中的骨髓細胞，并調(diào)整細胞數(shù)在1 ×106～1×107左右，流式細胞學檢測備用;流式取材完畢立即斷頭取腦，取大腦中動脈供血范圍的缺血大腦皮質(zhì)，－80℃保存，熒光定量PCR 備用。各組其余5只大鼠到相應觀察時間點時，經(jīng)左心室內(nèi)固定腦組織，取視交叉前后2 mm 腦組織作石蠟切片。

1.5.2 流式細胞術(shù)檢測外周血及骨髓EPCs 數(shù)量(EPCs 占單核細胞數(shù)量的百分比)

取外周血及骨髓細胞懸液各100 μL，分別加1 μL 兔抗大鼠VEGFR2 抗體避光孵育30 min，繼而加2 mL 紅細胞裂解液避光孵育5 min，4℃下1500 r/min 離心5 min，棄上清，2 mL PBS 重懸離心洗滌2次之后，加FITC 標記的二抗避光孵育30 min，2 mL PBS 重懸離心洗滌之后用100 μL PBS 重懸細胞沉淀，流式細胞儀上機檢測EPCs 數(shù)量。

1.5.3 熒光定量PCR 技術(shù)檢測缺血大腦皮質(zhì)VEGFR2 mRNA 的表達

將保存于－80℃的缺血大腦皮質(zhì)取出，按Takara 說明書提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成20 μL 體系的cDNA。據(jù)GenBank 提供的序列，擴增大鼠VEGFR2 mRNA的上游引物為5′－GGAAAGGGTGTT GGTGACTG－3′，下游引物為5′－GGTGTCCCGATAGAAGCACT－3′，產(chǎn)物長度112 bp。擴增條件為預變性95℃30 s，PCR 反應95℃5 s、60℃30 s，40 個循環(huán)。

1.5.4 免疫組化法檢測腦缺血區(qū)VEGFR2 陽性細胞表達及CD34 微血管計數(shù)

根據(jù)免疫組化試劑盒步驟對腦組織石蠟切片進行處理。結(jié)果的判定:VEGFR2 陽性細胞:采用Image－Pro Plus 16.0 圖像測量分析軟件計算VEGFR2陽性細胞數(shù)(個/HP)。微血管密度:所有切片均編號，取非連續(xù)的3 張切片，每張切片讀取2 個非連續(xù)視野數(shù)值。缺血區(qū)微血管計數(shù)(microvessel count，MVC)結(jié)果的判定:在200 倍視野下觀察，染成棕褐色或棕黃色的細胞或細胞簇，直徑＜20 μm，與相鄰的血管分界清楚，均認為是1 條微血管。由第一作者和另2 名經(jīng)過專業(yè)訓練的專業(yè)技術(shù)人員觀察計數(shù)，微血管數(shù)(個/HP)為每個視野下的血管數(shù)。

1.5.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠外周血VEGFR2+EPCs 數(shù)量變化情況

大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后I/R 組外周血VEGFR2+EPCs 數(shù)量明顯高于N 組(P ＜0.05，P ＜0.01);I/RE 組在各時間點與I/R 組相比均具有統(tǒng)計學差異(P ＜0.01，P ＜0.05);而I/REL 組的VEGFR2+EPCs 數(shù)量相比I/RE 組則顯著降低(P ＜0.01)。見圖1。

圖1 各組大鼠外周血VEGFR2 +EPCs 數(shù)量的比較Fig．1 Comparison of VEGFR2 +EPCs percentage in the rat peripheral blood of each group

2.2 大鼠骨髓VEGFR2+EPCs 數(shù)量變化情況

大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1、2d I/R組骨髓VEGFR2+EPCs 數(shù)量明顯高于N 組(P ＜0. 01)，7d 時與N 組相比無差異(P ＞0. 05);I/RE 組在各時間點與I/R 組相比有顯著差異(P＜0. 01，P ＜0. 05);而I/REL 組 的VEGFR2+EPCs 數(shù)量相比 I/RE 組則顯著降低(P ＜0. 01)。見圖2。

2.3 大鼠局灶大腦缺血皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 mRNA及VEGFR2 陽性細胞表達情況

與N 組比較，I/R 組各時間點VEGFR2 陽性細胞表達均增高(P ＜0.01);I/RE 組各時間點VEGFR2 mRNA 的表達量及VEGFR2 陽性細胞表達較I/R 組均明顯增高(P ＜0.01);當eNOS 被抑制后，電針促VEGFR2 mRNA 及VEGFR2 陽性細胞表達作用則明顯降低(P ＜0.01)。見圖3、表1。

圖2 各組大鼠骨髓VEGFR2 +EPCs 數(shù)量的比較Fig．2 Comparison of VEGFR2 +EPCs percentage in the rat bone marrow of each group

圖3 各組大鼠缺血腦皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 陽性細胞表達情況(×200)Fig．3 VEGFR2－positive cells in the ischemic cerebral cortex of rats in each group(×200)

表1 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 mRNA 及VEGFR2陽性細胞的表達Tab．1 The expression of VEGFR2 mRNA and VEGFR2 +cells in ischemic cerebral cortex of the rats in each group

2.4 大鼠局灶大腦缺血皮質(zhì)區(qū)CD34 微血管計數(shù)

與I/R 組比較，I/RE 組各時間點CD34 微血管計數(shù)均顯著增多(P ＜0.01)，在eNOS 被抑制后電針促微血管生成的作用顯著降低(P ＜0.01)。見圖4。

3 討論

在我國針刺用于治療腦梗死已有數(shù)千年的歷史。研究表明，電針可通過促骨髓干/祖細胞如EPCs 等的動員來參與缺血區(qū)血管的再生［11］。EPCs是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，在成人主要存在于骨髓。在缺血缺氧等病理因素的刺激下，EPCs 可從骨髓動員出去，并歸巢至缺血靶區(qū)參與血管再生［12－13］?，F(xiàn)階段關于可以準確代表EPCs 的表面標記物的研究尚未明確，一致認為VEGFR2、CD34、CD31、CD133 等為主要標記物，其中VEGFR2+EPCs具有較強的血管修復能力［14］。

圖4 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)CD34 微血管計數(shù)的比較(×200)Fig．4 Comparison of the number of CD34 +blood vessels in ischemic cerebral cortex in the rats of each group(×200)

張彤等［15］發(fā)現(xiàn)電針預處理可上調(diào)局灶腦缺血/再灌注后大鼠骨髓及外周血中VEGFR2+EPCs 數(shù)量，推測電針對腦梗死的修復作用與對EPCs 的動員有關;孫宏毅等［12］研究表明電針治療后局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血中VEGFR2+EPCs 數(shù)量明顯增高，推測電針動員EPCs 可促腦缺血區(qū)血管再生。此外，電針還可以上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血中VEGFR2+PECAM－1+EPCs、VEGFR2+CD31+EPCs、CD34+EPCs 等的數(shù)量，從而促進血管再生［16－18］。組織發(fā)生缺血后，是通過何種途徑將骨髓龕內(nèi)處于靜止狀態(tài)的EPCs 激活并動員至外周血，進而參與缺血組織的血管再生，是目前研究的熱點。

研究表明，eNOS 在干/祖細胞的動員及缺血組織的保護中起關鍵作用。Kim 等［19］發(fā)現(xiàn)電針提高小鼠局灶腦缺血后的腦血流量及改善神經(jīng)功能缺損癥狀的作用，在敲除eNOS 基因的小鼠體內(nèi)明顯受到抑制。Cui 等［6］發(fā)現(xiàn)eNOS 可以促進腦梗死后的血管再生，敲除eNOS 基因的小鼠腦梗死后較野生型小鼠死亡率增高，神經(jīng)功能缺損癥狀更為明顯，在使用NO 供體DETA－NONOate 后明顯改善。Aichner等［20］發(fā)現(xiàn)缺乏eNOS 的小鼠，VEGF 誘導的EPCs 的動員能力顯著降低。同時，研究表明SDF－1α 對EPCs 的動員作用，亦可在eNOS 被阻斷后受到抑制［21］。提示eNOS 在EPCs 的動員及缺血后腦保護中處于關鍵地位。故本研究旨在探討電針對EPCs的動員作用及對腦梗死的保護作用是否是通過對eNOS 的調(diào)控來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電針可以促進局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血中VEGFR2+EPCs 的數(shù)量，其中骨髓內(nèi)VEGFR2+EPCs 數(shù)量隨大鼠缺血時間的延長逐漸減少，而外周血中VEGFR2+EPCs 數(shù)量則是先有一個增多的趨勢繼而再減少，可能與VEGFR2+EPCs 在機體內(nèi)先由骨髓內(nèi)動員至外周血，之后又歸巢到缺血腦區(qū)有關;同時，本研究發(fā)現(xiàn)電針上調(diào)大鼠缺血大腦皮質(zhì)中VEGFR2 mRNA 及VEGFR2 陽性細胞數(shù)的表達，這種作用在eNOS 被阻斷后受到抑制，有可能提示eNOS 被阻斷后，電針促局灶腦缺血后VEGFR2 陽性細胞的歸巢能力減弱;且電針治療后大鼠缺血大腦皮質(zhì)區(qū)微血管的數(shù)量生成增多，而電針的這種對腦梗死大鼠的保護作用在使用eNOS 抑制劑后明顯減弱。研究表明，電針可上調(diào)eNOS 的表達［22］。故我們推斷電針或可通過介導eNOS 的激活來促局灶腦缺血后骨髓EPCs 動員至外周血，上調(diào)骨髓及外周血中EPCs 數(shù)量，同時歸巢到缺血腦區(qū)的EPCs 數(shù)量增加，進而促進缺血大腦皮質(zhì)區(qū)的血管再生。

本研究對電針動員EPCs 的機制做了較為深入研究，既往研究發(fā)現(xiàn)電針一方面可以上調(diào)外周血及骨髓EPCs 的數(shù)量，另一方面可以上調(diào)VEGF、SDF－1α、eNOS 等一系列與EPCs 動員、歸巢密切相關的因子，但大多未將電針動員EPCs 的機制與介導相關通路結(jié)合起來，僅是推測電針動員EPCs 是通過激活EPCs 動員相關因子來實現(xiàn)的，故本研究在既往的研究基礎上，更加深入的探討了電針動員內(nèi)源性EPCs，進而歸巢到缺血腦區(qū)參與血管再生的機制，發(fā)現(xiàn)使用eNOS 抑制劑L－NAME 后電針對局灶腦缺血大鼠EPCs 的動員作用及對腦血管的保護作用明顯受到抑制?？梢婋娽樋赏ㄟ^介導eNOS 動員內(nèi)源性EPCs 促局灶腦缺血大鼠腦內(nèi)血管再生，進一步證明了電針治療腦梗死的作用機理，為電針在臨床上治療腦梗死中提供堅實的理論依據(jù)。

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