張沖，王恒樹，闞秀蓮，李健，郭梅，祁永玲，韓艷麗，楊瑞成

(河北省中醫(yī)院骨三科，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050011)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)以關(guān)節(jié)軟骨變性和軟骨下骨象牙樣硬化為病理特征的退行性疾病。《內(nèi)經(jīng)·素問·痹論》:“風(fēng)寒濕三氣雜至合而為痹也［1］”。臨床多用非甾體類藥物或脛骨高位截骨術(shù)、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，患者難以接受［2］。中藥多取補腎壯骨、活血止痛之效，如熟地、枸杞、杜仲、川牛膝等對KOA 療效確切，延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展、促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)［3］。本研究擬通過檢測IL-1、TNF-α 的表達(dá)闡明補腎固筋方與骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

76 只SPF 級新西蘭兔，雄性，3月齡，體重大于或等于1.5 kg，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司［SCXK(滬)2013-0011］，實驗、取材及標(biāo)本測定在河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心進(jìn)行［SYXK(冀)2013-1-004］。

1.2 主要試劑及儀器

兔IL-1、TNF-αELISA 試劑盒(IL-1 ELISA kit，tumor necrosis factor-α，TNF-α ELISA kit，規(guī)格:96T，Abcam US，型號:AB2202);酶聯(lián)免疫檢測儀(型號:ELX800 BioTek，US．);Retsch 干燥箱(型號:TG10，產(chǎn)地:德國Hahn，Dusseldorf，Germany，Retsch Company);恒溫水箱(DDIL-5 型，上海安亭科學(xué)儀器廠);石蠟切片機(jī)(U-641 型，美國貝克曼公司);熒光顯微鏡系統(tǒng)(Leica AF6000，Germany);全自動圖像分析系統(tǒng)(Tanon1600，中國上海);723 分光光度計(ELX8086 型，美國寶特公司);數(shù)碼X 光機(jī)(GEx86型，美國GE 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

76 只新西蘭隨機(jī)分成4 組(正常組、模型組、西藥組及中藥組)，每組19 只。造模過程2 ～3 周內(nèi)各組均死亡1 只后每組各18 只。嚴(yán)格無菌、微創(chuàng)操作術(shù)后抗炎處理。

除正常組外均采用Hulth 法造模［4］。術(shù)前一晚禁食，配制成3%戊巴比妥鈉按20mg/kg 兔耳緣靜脈麻醉，先注射總量的2/3 隨后根據(jù)情況追加10%直至麻醉成功。常規(guī)消毒趨血。右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長約2.5 ～3 cm，明確關(guān)節(jié)腔無原發(fā)病變后，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶(medial collateral ligament，MCL);完全切斷前十字韌帶(anterior cruciate ligament，ACL );完整切除內(nèi)側(cè)半月板但保留后十字韌帶(posterior cruciate ligament，PCL)三個手術(shù)步驟造成力線內(nèi)移及膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)。脛股關(guān)節(jié)面由正常外翻10°變?yōu)閮?nèi)翻，X 線片后肢力線內(nèi)移、跛行明顯;膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)應(yīng)力集中繼發(fā)骨小梁改變;膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)及長期被迫運動造成軟骨損傷及退變。術(shù)側(cè)肢體不固定，頭孢曲松鈉注射液每次0.5 ×2 g/d，肌注，連續(xù)7 d。術(shù)后第7 天即強(qiáng)迫兔奔跑(0.5 h/d)，活動范圍約每日2h/800m 左右。造模2 周軟骨改變，6 周進(jìn)入平臺期，10 周出現(xiàn)典型的晚期OA 改變，13 周可獲得典型的KOA 模型。兔跛行嚴(yán)重每日行走≤300m、X 線片顯示脛股關(guān)節(jié)內(nèi)翻10°，前抽屜實驗和內(nèi)側(cè)應(yīng)力實驗陽性即表示造模成功。造模成功率為81.3%。

1.3.2 干預(yù)方法

補腎固筋方(熟地18 g、杜仲20 g、桑寄生20 g、巴戟天15 g、川牛膝16 g、雞血藤15 g、丹參12 g、木瓜12 g)加減，根據(jù)飲食情況，精神狀態(tài)，活動自如，喜暖惡寒，被毛光滑有光澤，四肢各關(guān)節(jié)無紅腫，活動自如等情況中醫(yī)辨證加減，風(fēng)寒濕痹加防風(fēng)、黃芪、羌活;風(fēng)濕熱痹加秦艽、羌活;瘀血閉阻證加桃仁、紅花;肝腎虧虛偏陰虛者加枸杞子、山茱萸;偏陽虛者加菟絲子、肉桂;每劑取汁400 mL。濃縮后加蒸餾水配制成6 ～8g/10 mL;美洛昔康每粒7.5 mg，四川寶光藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字:H20010209批次號:120502770265;戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium，美國Sigma，貨號:P3809 )。

造模3 周后開始干預(yù)，按照人及動物之間藥物劑量換算:Meeh-Rubner 氏公式A = K × (W2/3 ÷10 000)，美洛昔康每日8 mg/kg，每日補腎固筋方53 g/kg，正常組、模型組生理鹽水15mL 灌胃，2 次/日;連續(xù)干預(yù)8 周一療程。

1.3.3 觀察指標(biāo)

(1)步態(tài)觀察:Coderre T．步態(tài)分級［5］評價。0級:正常行走，行走時間＞5 min;I 級:輕微跛行，行走時間3 ～5 min;II 級:中度跛行，行走時間＜3 min。

(2)X 線檢查:處死動物前拍攝兔膝關(guān)節(jié)正位DR 片，觀察膝關(guān)節(jié)X 線表現(xiàn)。X 線損傷情況按改良的David T［6］法分級，0 度:關(guān)節(jié)面光滑無骨贅;I度:關(guān)節(jié)外側(cè)間隙輕度狹窄;II 度:關(guān)節(jié)面粗糙明顯變形伴可疑骨贅;III 度:關(guān)節(jié)間隙明顯狹窄，骨贅清晰可見。

(3)形態(tài)學(xué)觀察:1 mL 生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔，取脛骨內(nèi)側(cè)軟骨面，肉眼觀察兔膝關(guān)節(jié)軟骨面情況，切取膝關(guān)節(jié)前方、內(nèi)側(cè)滑膜組織和股骨內(nèi)髁及內(nèi)髁前方兩側(cè)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨，剪成約0.6 cm × 0.6 cm × 0.6 cm 大小均勻組織小塊，病理切片、組織染色處理，觀察關(guān)節(jié)軟骨的層次組成、軟骨細(xì)胞變化移行及軟骨下骨的情況。

(4)IL-1、TNF-α 檢測:實驗結(jié)束造模后藥物干預(yù)8 周空腹處死動物后，立即心臟取血5 mL，3000 r/min 離心10 min 分離出血清及關(guān)節(jié)滑液－60℃冰凍保存;5000 r/min 分離出關(guān)節(jié)軟骨及滑液后，－80℃超低溫冰箱保存24h 后再放入液氮(－196℃)保存。ELISA 法(enzyme-linked immunosorbent assay)檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肉眼及鏡下觀察

正常組膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙光滑平整，軟骨色澤藍(lán)白色透明，關(guān)節(jié)液量適中;模型組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙變窄，滑膜腫脹，軟骨面不光滑與滑膜纖維性粘連凹凸不平，軟骨剝脫;鏡下見軟骨細(xì)胞大小不均深層排列，軟化灶形成;兩個給藥組關(guān)節(jié)軟骨大體觀察呈淡藍(lán)半透明白色，表面平整光滑，滑膜乳白色淡黃黏稠的關(guān)節(jié)液含量較正常組稍多，鏡下西藥組軟骨細(xì)胞排列欠完整，簇狀增生;中藥組關(guān)節(jié)面光滑平整軟骨細(xì)胞排列完整(圖1)。

2.2 IL-1、TNF-α 含量比較

模型組含量升高(P ＜0.01)。兩個給藥組與模型組比較含量降低(P ＜0.01)，兩給藥組之間比較差異無顯著性(P ＞0.05)(表1)。

圖1 各組軟骨細(xì)胞鏡下觀察(HE ×40，20μm/cm)Fig．1 Histological appearance of the cartilage of rabbits in different groups．HE staining．×40

表1 各組血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α 含量比較(±s，n =18 )Tab．1 Comparison of interleukin-1，tumor necrosis factor-α in the rabbit serum and synovial fluid

表1 各組血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α 含量比較(±s，n =18 )Tab．1 Comparison of interleukin-1，tumor necrosis factor-α in the rabbit serum and synovial fluid

注:與模型組比較，* P ＜0.01。Note．Compared with the model group，* P ＜0.01．

分 組Groups血清Serum 關(guān)節(jié)液Synovial fluid IL-1 ng/L TNF-α pg/L IL-1 ng/L TNF-α pg/L正常組Normal 512.8±38.61* 192±18.23* 49±0.64＊＊ 33.2±0.84*模型組Model 866±44.23* 436±24.17* 92.8±0.64* 91.4±0.66*中藥組Chinese medicine 644.2±36.24* 43.9±21.01* 61.4±0.85* 54.2±0.87*西藥組Meloxicam 650.1±35.3* 203±16.85* 57.2±0.69* 45.4±0.58*

3 討論

Perlman［7］報道在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)中有IL-1 的存在。IL-1 通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的分泌，促進(jìn)血液中白細(xì)胞與粘附分子結(jié)合聚集在關(guān)節(jié)腔［8，9］，刺激骨小梁重塑及成骨細(xì)胞聚集增生，軟骨下骨萎縮。骨質(zhì)異常增生或囊性變形成骨贅，生物力學(xué)的作用使之再蘇醒最終形成關(guān)節(jié)變形功能缺失［10，11］。炎性介質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞浸潤增加炎癥反應(yīng)及組織損傷，特別是IL-1 正向促使PGE2及TNF-α 在細(xì)胞質(zhì)中的釋放，這種表達(dá)強(qiáng)度及嚴(yán)重程度呈現(xiàn)遞增改變［12］;研究證實TNF-α 通過促使關(guān)節(jié)軟骨面滑膜中的成纖維細(xì)胞增殖纖維素樣變性及多形核細(xì)胞分泌破壞骨關(guān)節(jié)面軟骨和軟骨下骨，同時IL-1、TNF-α 協(xié)同作用裂解蛋白多糖、降解膠原片段活性，加快軟骨基質(zhì)剝脫骨質(zhì)暴露［13，14］。

治則溫經(jīng)活血、補益肝腎。君藥熟地、杜仲、桑寄生，熟地微溫味甘，滋陰養(yǎng)血、益腎填精;杜仲甘溫，用于腎虛腰痛，筋骨無力;桑寄生苦甘平治風(fēng)濕痹痛，腰膝酸軟，筋骨無力，《本草再新》:寄生補氣溫中，治陰虛、壯陽道、利骨節(jié)。君藥配伍促進(jìn)血液循環(huán)改善關(guān)節(jié)腔內(nèi)微循環(huán)，降低骨內(nèi)壓減輕疼痛;《綱目拾遺》:丹參性涼，味甘，通經(jīng)絡(luò)，和血脈［15］。臣藥巴戟天、川牛膝和丹參配和君藥使用可減緩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的壞死、增強(qiáng)超氧化物歧化酶的活性反應(yīng)，加速軟骨細(xì)胞合成及滑液吸收［16］，阻斷了骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中氧自由基的釋放及惡性循環(huán)減緩軟骨退變的目的［17］;佐使藥雞血藤行氣活血，通絡(luò)、善治手足麻木、肢體癱瘓，風(fēng)濕痹痛及促進(jìn)靜脈系統(tǒng)血液返流加速代謝的作用［18］。補腎固筋方通過抑制IL-1、TNF-α 的分泌來改善滑膜液性反應(yīng)，可以有效修復(fù)軟骨皸裂控制軟骨退變、緩解軟骨細(xì)胞降解及增強(qiáng)滑膜滲透作用，促進(jìn)軟骨修復(fù)。

［1］國家中醫(yī)藥管理局．中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)．中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)［M］．南京，南京大學(xué)出版社，1999．

［2］Fitzgerald GK，White DK，Piva SR．Associations for change in physical and psychological factors and treatment response following exercise in knee osteoarthritis:an exploratory study［J］．Arthritis Care Res，2012，64(11):1673 －1680．

［3］崔向?qū)?，李玉波，李妍，等．活血、利水中藥對腦出血大鼠腦組織腫瘤壞死因子-α、核轉(zhuǎn)錄因子KB 及水通道蛋-4 表達(dá)的影響［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，2(17):513 －515．

［4］Rogart JN，Barrach HJ，Chichester CO．Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis［J］．Osteoarthritis Cartilage，1999，7(6):539 －547．

［5］Coderre TJ，Wall PD，Ankle joint urate arthritis in rats provides a useful tool for the evaluation of analgesic and anti-arthritic agents［J］．Pharmacol Biochem Behav．1988，29(3):461 －466．

［6］Felson DT，Naimark A，Anderson J，et al．The prevalence of knee osteoarthritis in the eldly［J］．Arthritis Rheum．1987，30(8):914－918．

［7］Perlman H，Geroganas C，Pagliari LJ，et al．Bcl-2 expression in synovial fibroblast is essential for maintaining mitochondrial homeostasis and cell viability［J］．J Immunol 2000，164(10):5227－5235．

［8］Parmelee PA，Harralson TL，McPherron JA，et al．The structure of affective symptomatology in older adults with osteoarthritis．Int J Geriatr Psychiatry，2013，28(4):393 －401．

［9］Venkataramanan V，Gignac MA，Dunbar M，et al．The importance of perceived helplessness and emotional health in understanding the relationship among pain，function，and satisfaction following revision knee replacement surgery［J］．J Osteoarthritis Cartilage，2013，21(7):911 －917．

［10］梁秀軍，翟澤玲，董文娟，等．膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠炎性細(xì)胞因子的動態(tài)觀察［J］．中國實驗動物學(xué)報，2013，21(3):57 －60．

［11］王曉冬，王庚啟．雙醋瑞因?qū)顷P(guān)節(jié)炎患者血清白細(xì)胞介素1、腫瘤壞死因子α 的影響和臨床療效［J］．中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10(21):102 －103．

［12］張立國，馬東升，程佳佳，等．中藥揮發(fā)油、水提物的抗炎、免疫及骨細(xì)胞修復(fù)活性的比較［J］．中藥新藥與臨床藥理，2015，1:34 －39．

［13］唐晶晶，梁德，江曉兵，等．改良半椎板切除法建立大鼠腰神經(jīng)根壓迫模型［J］．中國實驗動物學(xué)報，2014，22(2):48 －51．

［14］Olajide OA，Bhatia HS，de Oliveira，et al．Inhibition of neuroinflmmation in LPS-activated microglia by cryptolepine［J］．Evidence-Based Compl Alt Med，2013，459723．

［15］鄭進(jìn)昌，徐東明，許凱洲．獨活寄生湯治療膝關(guān)節(jié)退行性關(guān)節(jié)炎的臨床研究［J］．中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10(3):102 －103．

［16］裴凌鵬，白巖，惠伯棣．蝦青素對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞氧化損傷及炎性的影響［J］．中國老年學(xué)雜志．2012，32(23):5182 －5184．

［17］謝平，董少梅，陳付強(qiáng)，等．低濃度臭氧聯(lián)合玻璃酸鈉治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床觀察［J］．中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2012，18(7):404 －405．

［18］周光皎，孫宜坤，王超群．雞血藤中總黃藤的聚酰胺樹脂純化工藝優(yōu)選［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20(12):34 －37．