楊文昊，舒慧敏，劉鳳閣

(1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2. 湖北省丹江口市第一醫(yī)院，湖北 丹江口 442700)

白細(xì)胞介素-6-572位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型肺脹相關(guān)性分析

楊文昊1，舒慧敏2，劉鳳閣1

(1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2. 湖北省丹江口市第一醫(yī)院，湖北 丹江口 442700)

[摘要]目的 探討白細(xì)胞介素-6(IL-6)-572位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型肺脹相關(guān)性。方法 選取十堰地區(qū)漢族肺腎氣虛型肺脹患者78例作為肺腎氣虛型組，痰瘀阻肺型肺脹患者64例作為痰瘀阻肺型組，另選擇同地區(qū)漢族健康受試者182例作為對(duì)照組。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)、酶切技術(shù)對(duì)3組IL-6-572位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行研究，應(yīng)用夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清IL-6水平。結(jié)果 3組間CC、CG、GG基因型分布情況比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。肺腎氣虛型組和痰瘀阻肺型組血清IL-6水平均高于對(duì)照組(P均<0.05)，肺腎氣虛型組和痰瘀阻肺型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 IL-6-572位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型肺脹的發(fā)病無明顯相關(guān)性。

慢性阻塞性肺疾?。话准?xì)胞介素-6；單核苷酸多態(tài)性；痰瘀阻肺型；肺腎氣虛型；肺脹

肺脹是多種慢性肺系疾患反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，導(dǎo)致肺氣脹滿、不能斂降的一種病證，其臨床證候特點(diǎn)與西醫(yī)學(xué)中慢性阻塞性肺疾病(COPD)相類似，痰瘀阻肺型與肺腎氣虛型為肺脹患者常見辨證分型。白細(xì)胞介素-6(IL-6)基因啟動(dòng)子單核甘酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms， SNPs)是近年來研究較多的一個(gè)熱點(diǎn)，本研究探討了肺脹患者IL-6-572位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)辨證分型易感性的關(guān)系，旨在為肺脹的診治提供更多依據(jù)。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇2012年3月—2013年10月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院就診的十堰地區(qū)漢族肺脹患者142例，均為在十堰地區(qū)出生并長(zhǎng)期居住者，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2007年修訂版)的診斷標(biāo)準(zhǔn), 并且每名患者均由2名經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)的主治以上職稱的中醫(yī)醫(yī)師，按照中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)2008年制定的《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南—中醫(yī)病證部分》和2010年全國(guó)中醫(yī)內(nèi)科肺系病第十四次學(xué)術(shù)研討會(huì)通過“慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)診療指南”進(jìn)行中醫(yī)診斷和辨證。其中痰瘀阻肺型患者64例作為痰瘀阻肺型組，肺腎氣虛型肺脹患者78例作為肺腎氣虛型組。另選擇同地區(qū)漢族健康體檢者182例作為對(duì)照組。所用受試者相互之間均無血緣關(guān)系，經(jīng)詢問病史、體格檢查、胸部X射線胸片或胸部CT及心電圖、血糖等檢查后，排除肺間質(zhì)纖維化、哮喘等慢性肺部疾病者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過，受試者均對(duì)本研究知情同意并簽字。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 統(tǒng)計(jì)入選者性別、年齡、吸煙史及吸煙指數(shù)(吸煙指數(shù)=平均每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))，采用Master Screen肺功能儀對(duì)患者進(jìn)行肺功能檢查。

1.2.2 基因型及血清IL-6水平檢測(cè) 采集受檢者肘靜脈空腹血5 mL以備測(cè)試。使用E.ZNA Blood DNA Kit(美國(guó)OMEGA公司提供)，將基因組DNA溶于TE溶液中備用。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以基因組DNA為模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中模板DNA 1 μL，2×GC PCR緩沖液25 μL，LA Taq酶0.5 μL，0.5 mmol/L三磷酸脫氧核苷dNTP 8 μL，100 pmol/μL上、下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min后，92 ℃變形30 S，56 ℃退火30 S，72 ℃延伸30 S，32個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。上游引物為5’-GGAGACGCCTTGAAGTAACTGC-3’，下游引物為5’-GAGTTTCCTCTGACTCCATCGCAG-3’。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于1%瓊脂糖凝膠，100 V恒壓電泳40 min。將電泳后的凝膠放在紫外透視儀上觀察電泳條帶，若條帶清晰，無其他雜帶，說明PCR產(chǎn)物擴(kuò)增成功。擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶：取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，緩沖液2 μL， MbiⅠ限制性內(nèi)切酶2 μL，無菌去離子水14 μL，37 ℃水浴箱孵育3 h。酶切產(chǎn)物以聚丙烯酰胺凝膠-溴化乙錠進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果應(yīng)用自動(dòng)凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行成像、分析。用夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清IL-6水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料使用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13組臨床資料比較 3組性別構(gòu)成、年齡、吸煙史、吸煙指數(shù)的分布比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。痰瘀阻肺型組和肺腎氣虛型組肺功能指標(biāo)均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組臨床資料比較

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.2 IL-6-572位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的基因圖譜 根據(jù)限制性酶切片段大小判斷IL-6-572位點(diǎn)的3種基因型。IL-6-572 CC、GG、CG3種基因型分別對(duì)應(yīng)1條(163 bp)、2條(101 bp、62 bp)、3條(163 bp、101 bp、62 bp)。見圖1。

1，3，4，5為CC基因型；2為GG基因型；6為CG基因型圖1 IL-6-572位點(diǎn)的基因圖譜

2.3 3組IL-6-572位點(diǎn)基因型構(gòu)成比較 在IL-6-572位點(diǎn)上，3組間 CC、CG、GG基因型頻率分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

2.4 3組血清IL-6水平比較 痰瘀阻肺型組、肺腎氣虛型組、對(duì)照組血清IL-6水平分別為(6.04±0.19)pg/mL、(5.95±0.22)pg/mL、(3.86±0.72)pg/mL，痰瘀阻肺型組與肺腎氣虛型組均高于對(duì)照組(P均<0.05)。

表2 3組IL-6-572位點(diǎn)基因型構(gòu)成情況 頻數(shù)

3 討 論

吸煙是慢性阻塞性肺疾病的主要危險(xiǎn)因素,與氣道阻塞有明確的關(guān)系，但僅有15%的慢性重度吸煙者發(fā)展成為有癥狀的慢性阻塞性肺疾病患者，表明遺傳因素在慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病中起著重要的作用。近年來通過研究發(fā)現(xiàn)某些證候與某些基因有一定關(guān)聯(lián)性，某些基因型可能是某些證候的易感因素。目前慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)發(fā)病研究多采用辨病與辨證相結(jié)合的模式，但若在肺脹病證結(jié)合基礎(chǔ)上探討中醫(yī)證型與基因多態(tài)性的相關(guān)性，將更有利于中醫(yī)辨證分型客觀化，有利于進(jìn)一步提高中醫(yī)辨證論治水平和臨床療效。痰瘀阻肺及肺腎氣虛是肺脹患者臨床常見證型，不同分型患者有不同臨床表現(xiàn)及治療側(cè)重點(diǎn)。

研究表明，IL-6具有促炎性細(xì)胞分化、趨化，并上調(diào)黏附分子和其他細(xì)胞因子的表達(dá)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)效應(yīng)[1]。 IL-6過度表達(dá)與慢性阻塞性肺疾病患者的呼吸困難[2]、骨骼肌乏力[3]、胰島素抵抗[4]、肺動(dòng)脈高壓[5]、病情惡化[6]相關(guān)；在鼠類模型中發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)IL-6可誘發(fā)肺氣腫和氣道炎癥[7]；即使在COPD穩(wěn)定期，患者血CRP、纖維蛋白原、血小板和白細(xì)胞也比健康對(duì)照者偏高[8]，而IL-6能夠上調(diào)他們的表達(dá)。IL-6在患者血清、呼出冷凝物、痰液中的高表達(dá)能預(yù)測(cè)FEV1快速下降，并同患者體質(zhì)量下降及肌肉廢用密切相關(guān)[9-10]；可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)吸入糖皮質(zhì)激素有效治療后IL-6濃度下降[11]。這些提示IL-6與慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。Cordoba-Lanus等[12]研究認(rèn)為IL-6-597G/A和IL-6-174G/C位點(diǎn)多態(tài)性與西班牙人慢性阻塞性肺疾病發(fā)病無關(guān)，IL-6-572C/G位點(diǎn)的C等位基因可以降低西班牙人發(fā)展為慢性阻塞性肺疾病的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，各組間 IL-6-572C/G 多態(tài)性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IL-6-572位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可能與肺脹患者痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型發(fā)病無明顯相關(guān)性。痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型血清IL-6水平高于對(duì)照組，考慮可能慢性阻塞性肺疾病為全身炎癥反應(yīng)性疾病，IL-6生成可能與其他炎癥因子參與調(diào)控有關(guān)。但是還需要更大樣本量的同類研究來提供進(jìn)一步的證據(jù)。

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Analysis of correlation of IL-6 -572 single nueleotide polymorphism with lung distension of lung retention of phlegn and blood stasis type and lung-kidney Qi deficiency type

YANG Wenhao1, SHU Huimin2, LIU Fengge1

(1. The People’s Hospital of Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China; 2. The First Hospital of Danjiangkou 442700, Hubei, China)

Objective It is to investigate the correlation of IL-6 -572 single nueleotide polymorphism (SNP) with lung distension of lung retention of phlegn and blood stasis type and lung-kidney Qi deficiency type． Methods 78 Han patients with lung distension of lung-kidney Qi deficiency type in Shiyan area were selected as lung-kidney Qi deficiency type group, 64 ones of lung retention of phlegn and blood stasis type as lung retention of phlegn and blood stasis type group, 182 healthy ones as control group. The SNP-572 in the IL-6 promoter gene were analyzed by using PCR-RFLP method，the concentrations of serum IL-6 were measured by using ELISA kit. Results There was no statistically differences in the distribution of genotype CC, CG, GG among the three groups (P>0.05). The levels of serum IL-6 in lung-kidney Qi deficiency type group and lung retention of phlegn and blood stasis type group were both higher than that in control group (P<0.05), but there was no significant difference in the level between lung-kidney Qi deficiency type group and lung retention of phlegn and blood stasis type group. Conclusion IL-6 572 SNP was not correlated with the pathogens of COPD patients of lung-kidney Qi deficiency type and lung retention of phlegn and blood stasis type.

chronic obstructive pulmonary disease; IL-6; single nueleotide polymorphism; lung-kidney Qi deficiency type; lung retention of phlegn and blood stasis type; lung distension

楊文昊，男，碩士研究生，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治呼吸系統(tǒng)疾病研究。

劉鳳閣，E-mail:syliufg@sina.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.25.007

R743.3

A

1008-8849(2015)25-2756-03

2015-03-10