李翠芳，鄒佩霞，姚 遠(yuǎn)，陳德森，朱克剛

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

參麥注射液對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性心肌缺血預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)研究

李翠芳1，鄒佩霞1，姚 遠(yuǎn)1，陳德森2，朱克剛2

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

目的 觀察參麥注射液對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性心肌缺血預(yù)處理后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)及氧化應(yīng)激的作用，探討其潛在機(jī)制。方法 選取8只健康日本大耳白兔為對(duì)照組，另取24只隨機(jī)分為缺血再灌注組、缺血預(yù)處理1組、缺血預(yù)處理2組，除對(duì)照組外，其余組均采用手術(shù)結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支45 min后再灌注60min，反復(fù)3次以造成實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。缺血預(yù)處理1組、缺血預(yù)處理2組經(jīng)耳緣靜脈給予參麥注射液2 mL/(kg·d)、4 mL/(kg·d)連續(xù)缺血預(yù)處理7 d，對(duì)照組和缺血再灌注組給予等量生理鹽水預(yù)處理7 d。采用雙抗體夾心EUSA法測(cè)定兔缺血預(yù)處理7 d血清VEGF蛋白質(zhì)及VEGF mRNA表達(dá)情況；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兔血清乳酸脫氫酶(LDH)、血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)及心肌丙二醛(MDA)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等指標(biāo)。結(jié)果 預(yù)處理7 d后缺血預(yù)處理1組、缺血預(yù)處理2組VEGF蛋白質(zhì)及VEGF mRNA表達(dá)和T-SOD酶活性均高于缺血再灌注組(P均<0.05)，MDA及LDH、CK-MB含量均低于缺血再灌注組(P均<0.05)。結(jié)論 參麥注射液對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能是促進(jìn)VEGF分泌，抑制心肌缺血時(shí)脂質(zhì)過氧化，促進(jìn)氧自由基清除酶清除氧自由基，加快兔缺血心肌血管內(nèi)皮新生進(jìn)而改善再灌注損傷后受損血管內(nèi)皮功能。

參麥注射液；心肌缺血預(yù)處理；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；總超氧化物歧化酶;乳酸脫氫酶;丙二醛；肌酸激酶同工酶

Key works: Shenmai Injection; myocardial ischemic preconditioning; vascular endothelial growth factor; total superoxide dismutase; malondialdehyde; lactate dehydrogenase; isoenzyme of creatine kinase

近年來的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，我國(guó)急性心肌梗死發(fā)病率呈升高趨勢(shì)[1]。急性心肌梗死及冠脈溶栓術(shù)、冠脈搭橋術(shù)、心肌梗死再通術(shù)等常引起急性心肌缺血再灌注損傷[2]，而在發(fā)生心肌缺血再灌注損傷前及時(shí)進(jìn)行干預(yù)(即缺血預(yù)處理)顯得尤其重要。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有增加微、小靜脈血管的通透性，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖及誘導(dǎo)血管生成等作用[3]。參麥注射液可提高心肌細(xì)胞耐缺氧能力,增強(qiáng)心肌收縮力，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，進(jìn)而改善心臟功能,具有預(yù)防和治療血管再狹窄及保護(hù)缺血心肌等作用[4]。本研究通過制備兔心肌缺血再灌注損傷模型，探討了參麥注射液對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性心肌缺血后VEGF表達(dá)及氧化應(yīng)激的作用，旨在為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 日本大耳白兔32只，兔齡100～120d，體質(zhì)量(1.5±0.2)kg。由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證SYXK(鄂)2011-0031，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(鄂)2011-0008。動(dòng)物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動(dòng)物進(jìn)食情況，稱體質(zhì)量，及時(shí)清理糞便。采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注組、缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組，每組8只。

1.2 儀器及藥品 BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司)，參麥注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z33020021)，VEGF試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)測(cè)試盒(上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：KB13297)。

1.3 兔心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽?參照文獻(xiàn)[5]，動(dòng)物經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉(120mg/kg )麻醉，腹部向上固定于兔臺(tái)，用BL-420F生物信號(hào)采集系統(tǒng)觀察Ⅱ?qū)?lián)心電圖。缺血再灌注組、缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組均經(jīng)碘伏消毒兔胸部，第5—6肋開胸暴露心臟，打開心包找到冠狀動(dòng)脈并確定左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支后，用8號(hào)小圓針自肺動(dòng)脈圓錐進(jìn)針，左心房邊緣處出針，結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支。當(dāng)出現(xiàn)明顯的ST段上移、T波高聳、竇性心動(dòng)過緩、期前收縮等心律失常性心電圖即提示模型復(fù)制成功。

1.4 兔缺血預(yù)處理方法 動(dòng)物模型復(fù)制成功后，缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組分別耳緣靜脈注射參麥注射液按2 mL/(kg·d)和4 mL/(kg·d)連續(xù)缺血預(yù)處理7 d，對(duì)照組、缺血再灌注組給予等量生理鹽水預(yù)處理7 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) 4組分別于缺血預(yù)處理7 d后經(jīng)頸靜脈各取1mL靜脈血暫存至-30℃低溫冰箱保存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)以3 000r/min高速離心(離心半徑 70mm)，低溫分離血清后取上清液，嚴(yán)格按SP試劑盒說明操作，采用雙抗體夾心EUSA法測(cè)定血清VEGF、VEGF mRNA表達(dá)情況；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)靜脈血LDH、CK-MB、T-SOD活性及心肌組織中MDA含量。

2 結(jié) 果

2.1各組VEGF、VEGF mRNA表達(dá)情況 缺血再灌注組在缺血預(yù)處理7 d后VEGF、VEGF mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P均<0.05)；缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組VEGF、VEGF mRNA表達(dá)水平明顯高于缺血再灌注組及對(duì)照組(P均<0.05)，但缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組缺血預(yù)處理7 d后VEGF、VEGF mRNA表達(dá)情況

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與缺血再灌注組比較，P<0.05。

2.2 各組MDA及CK-MB含量比較 缺血預(yù)處理7 d后，缺血再灌注組MDA及CK-MB含量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組MDA及CK-MB含量明顯低于缺血再灌注組(P均<0.05)，但缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組缺血預(yù)處理7 d后MDA及CK-MB含量比較

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與缺血再灌注組比較，P<0.05。

2.3 各組T-SOD、LDH含量比較 缺血預(yù)處理7 d后，缺血再灌注組T-SOD含量較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，LDH含量明顯升高(P<0.05)；缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組T-SOD含量較缺血再灌注組明顯升高(P均<0.05),LDH含量則明顯低于缺血再灌注組(P均<0.05)，但缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組缺血預(yù)處理7 d后血清T-SOD、LDH含量比較

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與缺血再灌注組比較，P<0.05。

3 討 論

機(jī)體正常情況下，氧自由基的生成與清除維持著動(dòng)態(tài)平衡，血管內(nèi)皮及功能保持在正常狀態(tài)，當(dāng)心肌缺血時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，心和肝臟等組織由于缺血再灌注產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，此時(shí)自由基清除酶活性降低，造成自由基清除酶對(duì)氧自由基清除能力下降，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損。VEGF是一種高度特異性的促血管生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)多種血管活性物質(zhì)合成、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移及再生，參與冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成的調(diào)節(jié)[6]，故VEGF在臨床上常作為血管內(nèi)皮功能的重要指標(biāo)之一。LDH、MDA及CK-MB存在于心肌細(xì)胞的胞質(zhì)中，當(dāng)心肌細(xì)胞嚴(yán)重受損或者少量壞死時(shí)均會(huì)大量被釋放入血液中，故此類心肌酶譜常作為早期診斷心肌梗死等缺血性疾病的高敏感度及高特異度性指標(biāo)[7]。

參麥注射液是由紅參、麥冬經(jīng)提取、純化、精制而成的中藥注射劑，主要含有人參皂苷、人參多糖、麥冬皂苷、有機(jī)酸等成分，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津之功效。參麥注射液可擴(kuò)張冠脈，增加冠脈血流量及心肌能量?jī)?chǔ)備,改善心肌收縮力[8]，提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)心腦組織耐缺氧力，抑制脂質(zhì)過氧化, 增加心排血量等[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)處理7 d后，缺血再灌注組VEGF及VEGF mRNA表達(dá)降低， T-SOD酶的活性下降，LDH、MDA 及CK-MB含量明顯增高，說明兔實(shí)驗(yàn)性心肌缺血、缺氧造成心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮嚴(yán)重?fù)p傷。在應(yīng)用參麥注射液預(yù)處理7 d后，VEGF及VEGF mRNA表達(dá)較缺血再灌注組明顯增強(qiáng)， T-SOD酶的活性明顯升高，LDH、MDA 及CK-MB含量明顯降低，說明參麥注射液具有促進(jìn)VEGF分泌、誘導(dǎo)缺血心肌血管再生、促進(jìn)受損血管內(nèi)皮修復(fù)的功能。分析認(rèn)為，可能是參麥注射液不僅能促進(jìn)Ca2+-ATP酶活性恢復(fù),增強(qiáng)Na+，K+-ATP酶活力,減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載,還通過Na+，K+-ATP酶調(diào)節(jié)鈉氫交換來抑制鈉鈣交換,阻止Ca2+內(nèi)流,改善心肌組織能量代謝[10]，改善微循環(huán)，增加冠脈灌注和心肌供氧[11]，進(jìn)而改善心肌缺血而起到保護(hù)作用。

綜上所述，參麥注射液具有促進(jìn)VEGF分泌，抑制心肌缺血時(shí)脂質(zhì)過氧化，促進(jìn)氧自由基清除酶清除氧自由基，減輕血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)及損傷程度，加快兔缺血心肌血管內(nèi)皮新生進(jìn)而改善再灌注損傷后受損血管內(nèi)皮功能的作用。

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Experimental study on Shenmai Injection in rabbits with experimental myocardial ischemic preconditioning

LI Cuifang1,ZOU Peixia1,YAO Yuan1, CHEN Desen2,ZHU Kegang2

(1.Taihe Hospital ( The Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine), Shiyan 442000, Hubei, China; 2.Hubei University of Medicine, Shiyan 442000,Hubei, China)

Objective It is to observe the effect of Shenmai Injection on the expression of vascular endothelial growth factor and oxidative stress in rabbits with experimental myocardial ischemic preconditioning, and to explore its potential mechanism.Methods Eight Japanese white rabbits were selected as control group (MG), another 24 ones were selected and randomly divided into ischemia/reperfusion group (IR group), ischemic preconditioning group I(group I), ischemic preconditioning group II(group II),except MG group, the rabbits in the other three groups were operated by ligation of the left anterior descending branch of coronary artery for 45min and reperfusion for 60min, repeated 3 times to establish the animal models of experimental myocardial ischemia reperfusion injury.Group I and group II were given Shenmai Injection at the dose of 2 mL/(kg·d) and 4 mL/(kg·d) through ear vein for ischemic preconditioning for 7 days.MG group and IR group were given the same volume of normal saline.Serum VEGF protein and VEGF mRNA expression were determined by double antibody sandwich EUSA method before and after preconditioning; serum LDH, T-SOD and MDA, CK-MB in heart tissue were determined by enzyme linked immunosorbent assay test (ELISA).Results After 7 days’ preconditioning, the levels of VEGF and VEGF mRNA, the activity of T-SOD were higher, while the contents of MDA, LDH and CK-MB in group I and group II than those in IR group (allP<0.05).Conclusion Shenmai Injection has a protective effect on the rats with experimental myocardial ischemia reperfusion.The mechanism may be that it can promote the secretion of VEGF, inhibit lipid peroxidation induced by myocardial ischemia, promote oxygen free radical scavenging enzymes to clear oxygen free radicals, speed up vascular endothelial growth, thus to improve the impaired vascular endothelial functions after ischemia reperfusion injury.

李翠芳，女，主管技師，研究方向?yàn)楦我浦?、影像學(xué)及臨床藥理學(xué)。

朱克剛，E-mail:cdscds1226@126.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.10.007

R-332

A

1008-8849(2015)10-1049-03

2014-11-04