黃 磊，黃 俠，蔡一亭，陳大偉，費哲為

(1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院，上海 200092；2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150)

HSP90抑制劑IPI-504影響胃癌細胞及其干細胞樣細胞功能的研究

黃 磊1，黃 俠2，蔡一亭2，陳大偉2，費哲為1

(1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院，上海 200092；2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150)

目的探討特異性熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑鹽酸瑞他霉素(IPI-504)對人胃癌細胞SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干細胞樣細胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響。方法應用流式細胞儀檢測及分選SGC-7901、NCI-N87中干細胞樣細胞；應用MTT比色法檢測不同濃度IPI-504對SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干細胞樣細胞的生長抑制率；應用平板克隆形成實驗檢測不同濃度IPI-504對SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干細胞樣細胞的克隆形成能力；應用劃痕實驗及Transwell侵襲實驗檢測IPI-504對SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干細胞樣細胞遷移及侵襲力；應用流式細胞儀檢測IPI-504對SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干細胞樣細胞凋亡率的影響。結果從SGC-7901、NCI-N87分選出8%和6%的CD44+干細胞樣細胞，純度>95%；IPI-504能顯著抑制SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干細胞樣細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力，增加以上細胞的凋亡率，且呈劑量依賴性。結論HSP90抑制劑IPI-504能夠顯著抑制胃癌細胞SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干細胞樣細胞的功能，并促使其凋亡。

鹽酸瑞他霉素；熱休克蛋白90；胃癌；CD44+干細胞樣細胞

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，盡管目前在胃癌臨床治療上采取了手術、放化療以及基因治療在內的各種新策略，但生存率仍不超過40%。腫瘤干細胞(Cancer Stem Cells，CSC)的提出為充分認識胃癌的發(fā)病機制提供了新的思路[1]。該理論認為,腫瘤是由極少數具有自我更新和分化增殖特征的腫瘤細胞形成，能進一步分化產生大量非致瘤性腫瘤細胞，通過對特定的免疫表型分離鑒定腫瘤干細胞是最常用的方法。熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSP)是一種廣泛存在于細胞中的分子伴侶，能夠調控包括腫瘤在內的各種細胞中的多種信號通路[2]。而HSP90抑制劑能夠同時削弱多條原癌基因信號通路，抑制腫瘤細胞生長并誘導其凋亡，已經成為非常有前景的胃癌治療策略。本課題通過免疫標記物特異性分選出胃癌細胞SGC-7901、NCI-N87中干細胞樣細胞，研究HSP90抑制劑鹽酸瑞他霉素(Retaspimycin Hydrochloride，IPI-504)對胃癌細胞及其干細胞樣細胞的增殖、轉移以及凋亡的影響，旨在為今后的臨床應用提供理論依據。

1 實驗資料

1.1材料 胃癌低分化細胞株SGC-7901及胃癌高分化轉移細胞株NCI-N87購買于中國科學研究院細胞庫。IPI-504及5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)購自Med Chem express公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶(PI)購自Sigma公司。PE-CD24抗體、FITC-CD44抗體、PE-CD133抗體、細胞侵襲小室及Annexin V-FITC試劑盒購自BD公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 常規(guī)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內，于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)SGC-7901及NCI-N87。

1.2.2流式細胞分選 對數生長期細胞用胰酶消化，PBS重懸并計數，分別加入PE-CD24抗體、FITC-CD44抗體、PE-CD133抗體混合(終濃度5 μg/mL)，置于37 ℃避光環(huán)境孵育30 min，PBS洗滌后上機分選，分選出的細胞置于完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3MTT法檢測細胞活性 對數生長期的細胞接種于96孔板中(1×104/100 μL)并待其貼壁，分別加入不同濃度梯度的IPI-504或5-Fu處理，48 h后加入MTT工作液，4 h后再加入DMSO并檢測OD值。細胞存活率=(試驗組OD平均值-背景組OD平均值)/(空白對照組OD平均值-背景組OD平均值)×100 %。

1.2.4平板克隆形成試驗 對數生長期細胞消化、計數，稀釋成150個/孔種于24孔板中，24 h后分別換成含有6 μg/mL或9 μg/mL IPI-504的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，冰凍甲醇固定，0.1%的結晶紫染色，拍照計數20個細胞數以上的細胞集落個數。

1.2.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力 細胞以8×105/孔接種到24孔板，24 h后使用無菌加樣器槍頭將細胞培養(yǎng)層劃出數道劃痕，洗去漂浮細胞，用IPI-504以0 μg/mL、6 μg/mL、9 μg/mL 3個濃度培養(yǎng)，在即刻、24 h、48 h分別拍照，計數3個不同區(qū)域距離。細胞遷移率=(處理組細胞遷移距離/對照組細胞遷移距離)×100%。

1.2.6Transwell侵襲小室檢測細胞侵襲能力 細胞消化計數，用無血清的培養(yǎng)基調整為5×105/孔種于Transwell侵襲小室，37 ℃下培養(yǎng)48 h后取出。冰凍甲醇固定，0.1%的結晶紫染色后擦除上室細胞，置于倒置顯微鏡下并取5個視野拍照計數。

1.2.7流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 按照Annexin V-FITC試劑盒說明書方法，將IPI-504處理后的細胞消化，加入400 μL Annexin V-FITC結合液完全懸浮，加入5 μL Annexin V-FITC，4 ℃下避光孵育10 min，后加入10 μL PI 4 ℃下避光孵育5 min，上機檢測細胞凋亡情況。

2 結 果

2.1SGC-7901、NCI-N87細胞中CD44+細胞的分離 用CD24和CD133標記這兩株細胞的陽性率幾乎為0，而對CD44標記，SGC-7901陽性率為8%，NCI-N87陽性率為6%。因此采用CD44來標記胃癌細胞株，并用流式細胞儀分選出CD44+的細胞，其中分選出的細胞純度> 95%。

2.2IPI-504對SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞活率的影響 以PBS為陰性對照，以5-Fu為陽性對照，結果顯示IPI-504相對于SGC-7901、SGC-7901CD44+、NCI-N87、NCI-N87CD44+的IC50值分別為24.4μmol/L、33.7μmol/L、2.67μmol/L、41.18μmol/L。而5-Fu相對于SGC-7901、SGC-7901CD44+、NCI-N87、NCI-N87CD44+的IC50值分別為35.3μmol/L、72.7μmol/L、121μmol/L、154μmol/L。

2.3IPI-504對SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞克隆形成能力的影響 用0μg/mL(control)、6μg/mL與9μg/mL濃度IPI-504處理SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞，結果顯示與未用藥的control組相比，IPI-504處理后各組克隆形成能力顯著降低，且與劑量呈顯著相關性，9μg/mL處理組只見少量克隆生長。見圖1。

圖1 平板克隆形成實驗驗證IPI-504對胃癌細胞克隆形成的影響

2.4IPI-504對SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞遷移能力的影響 用0μg/mL(control)、6μg/mL與9μg/mL濃度IPI-504處理SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞24h和48h。結果顯示，與control組相比，IPI-504 6μg/mL與9μg/mL濃度能顯著抑制SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞的遷移能力(P均<0.05)；隨IPI-504濃度增加，細胞遷移能力減弱(P均<0.05)。見圖2～5。

2.5IPI-504對SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞侵襲能力的影響 用6μg/mL濃度IPI-504處理SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞，結果顯示與control組相比，IPI-504能顯著抑制SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞的侵襲能力(P均<0.05)。見圖6及圖7。

圖2 不同濃度IPI-504對SGC-7901細胞遷移能力的影響

圖3 不同濃度IPI-504對SGC-7901 CD44+細胞遷移能力的影響

圖4 不同濃度IPI-504對NCI-N87細胞遷移能力的影響

圖5 不同濃度IPI-504對NCI-N87 CD44+細胞遷移能力的影響

2.6IPI-504對SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞凋亡的影響 用0μg/mL(control組)、6μg/mL、9μg/mL、18μg/mL4個濃度IPI-504分別處理SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞48h后，結果顯示與control組相比，IPI-504能顯著促進SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞的凋亡；隨著IPI-504濃度的增加，細胞凋亡率增加。見圖8。

圖6 IPI-504對SGC-7901及其CD44+細胞侵襲能力的影響

圖7 IPI-504對NCI-N87及其CD44+細胞遷移能力的影響

圖8 不同濃度IPI-504對SGC-7901、NCI-N87及其CD44+細胞凋亡影響

3 討 論

目前胃癌的治療主要是根治性手術切除及輔助放化療，但效果不甚理想，仍有約50%的患者會因腫瘤的復發(fā)、轉移及耐藥而導致死亡。近年發(fā)展起來的腫瘤干細胞學說認為CSC是腫瘤中一小部分具有自我更新及多項分化潛能的細胞，與腫瘤的多種重要的生物學行為如耐藥、免疫抑制及上皮-間質轉化等相關，這些性質促使CSC能夠抵抗放化療的攻擊，導致腫瘤復發(fā)及遠處轉移[3]。多種類型的CSC已經驗證存在與成體干細胞相同或相似的表面標志物，如CD44、CD24、CD133[5]等。因此，本研究應用上述標志物分別對2種有代表性的胃癌細胞即低分化細胞株SGC-7901及胃癌高分化轉移細胞株NCI-N87進行篩選，結果發(fā)現僅有CD44在2種細胞中均有陽性表達，這與Takaishi等[4]研究結果相符，即CD44可用于識別及篩選出胃癌干細胞。此外，Yoon等[5]研究發(fā)現胃癌干細胞高表達CD44，且與腫瘤的浸潤轉移能力以及耐5-Fu和卡鉑相關。因此本實驗通過進一步分選CD44+細胞，用以證實胃癌干細胞樣細胞。

HSP是一類結構上高度保守的蛋白質，按照其分子量的大小主要分為HSP90、HSP70、HSP60以及小分子HSP等，其廣泛存在于各類生物細胞中，具有穩(wěn)定蛋白、提高細胞生存等功能[6]。近年來的研究發(fā)現HSP90在胃癌組織中較正常組織表達高2～10倍[7]。目前已經有超過100種蛋白如突變型P53、BCR-ABL、AKT、HER2被確定為HSP90的客戶蛋白，能夠促進癌細胞增殖、轉移、耐藥以及抑凋亡的作用[7-9]。因此使用HSP90抑制劑阻斷多種腫瘤信號通路，從而消除腫瘤成為一種重要的抗癌治療策略。格爾德霉素屬于苯醌安莎霉素類抗生素，是一種天然存在的HSP90功能抑制劑，其安莎環(huán)可通過與HSP90-N端ATP/ADP結構域特異性地抑制HSP90與多種腫瘤相關蛋白的相互作用[10]。然而其水溶性差，體內分布特異性差及肝毒性強，其衍生物如17-AAG、17-DMAG等水溶性提高，親和力提高100倍。

17-AAG的鹽酸衍生物IPI-504由InfinityPharmaceuticals公司研發(fā)[11]。Floris等[12]的研究發(fā)現，IPI-504能夠通過HSP90阻礙KIT的功能，抑制胃腸腫瘤的增長。本實驗發(fā)現，IPI-504能夠顯著抑制SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干細胞樣細胞的增殖、遷移以及侵襲能力，顯著促進胃癌細胞的凋亡，并且存在劑量依賴性。

綜上所述，HSP90抑制劑IPI-504能夠顯著抑制胃癌細胞及其干細胞樣細胞增殖、遷移、侵襲能力，促進胃癌細胞及其干細胞樣細胞的凋亡。但其通過抑制HSP90作用于細胞信號通路的機制有待進一步探索。

[1]QiaoXT,GumucioDL.Currentmolecularmarkersforgastricprogenitorcellsandgastriccancerstemcells[J].JGastroenterol,2011,46(7):855-865

[2]RappaF,FarinaF,ZummoG,etal.HSP-molecularchaperonesincancerbiogenesisandtumortherapy:anoverview[J].AnticancerRes,2012,32(12):5139-5150

[3]ShatsI,GatzaML,ChangJT,etal.Usingastemcell-basedsignaturetoguidetherapeuticselectionincancer[J].CancerRes,2011,71(5):1772-1780

[4]TakaishiS,OkumuraT,WangTC.Gastriccancerstemcells[J].JClinOncol,2008,26(17):2876-2882

[5]YoonC,ParkDJ,SchmidtB,etal.Hedgehogsignalingmaintainsgastriccancerstemcellsandpromoteschemotherapyresistance:resultsfromlaboratoryandclinicalstudies[J].CancerRes,2014,74(19Suppl):3873

[6]HongDS,BanerjiU,TavanaB,etal.Targetingthemolecularchaperoneheatshockprotein90 (HSP90):lessonslearnedandfuturedirections[J].CancerTreatRev,2013,39(4):375-387

[7]WangJ,CuiS,ZhangX,etal.Highexpressionofheatshockprotein90isassociatedwithtumoraggressivenessandpoorprognosisinpatientswithadvancedgastriccancer[J].PLoSOne,2013,8(4):e62876

[8]RedlakMJ,MillerTA.TargetingPI3K/Akt/HSP90signalingsensitizesgastriccancercellstodeoxycholate-inducedapoptosis[J].DigDisSci,2011,56(2):323-329

[9]GomezF,ChenL,WierdaW,etal.InvitroeffectofAZD1208(PimKinaseInhibitor)and17-AAG(HSP90Inhibitor)combinationinCLL[J].CancerRes,2013,73(8Suppl):2057

[10]KimT,KeumG,PaeAN.Discoveryanddevelopmentofheatshockprotein90inhibitorsasanticanceragents:areviewofpatentedpotentgeldanamycinderivatives[J].ExpertOpinTherPat,2013,23(8):919-943

[11]HansonBE,VesoleDH.Retaspimycinhydrochloride(IPI-504):anovelheatshockproteininhibitorasananticanceragent[J].ExpertOpinInvestigDrugs,2009,18(9):1375-1383

[12]FlorisG,Debiec-RychterM,WozniakA,etal.Theheatshockprotein90inhibitorIPI-504inducesKITdegradation,tumorshrinkage,andcellproliferationarrestinxenograftmodelsofgastrointestinalstromaltumors[J].MolCancerTher,2011,10(10):1897-1908

Study on the effect of HSP90 inhibitor IPI-504 on gastric cancer cells and its stem cell like cells

HUANG Lei1, HUANG Xia2, CAI Yiting2, CHEN Dawei2, FEI Zhewei1

Objective It is to investigate the influence of the heat shock protein 90 (HSP90) inhibitor Retaspimycin Hydrochloride (IPI-504) on the ability of proliferation, migration, invasion and apoptosis in gastric cancer cells of SGC-7901, NCI-N87 and their CD44+stem cell like gastric cancer cells. Methods Flow cytometry was used to detect and sort the stem cell like cells in SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer cells. MTT colorimetric assay was utilized to compare the effort of IPI-504 on the inhibition ratio in SGC-7901, NCI-N87 and their CD44+stem cell like gastric cancer cells. Colony formation assay was executed to test the effort of IPI-504 on colony formation ability in SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer and their CD44+stem cell like cells. Scratch test and Transwell invasion assay was applied to detect the effort of IPI-504 on migration and invasion ability in SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer and their CD44+stem cell like cells. Flow cytometry was also used to detect the effect of IPI-504 on the apoptosis in SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer and their CD44+stem cell like cells. Results 8% and 6% CD44+stem cell like cells was sorted from SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer cells with purity >95%. IPI-504 could dramatically inhibit the abilities of proliferation, migration, invasion and colony formation in SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer and their CD44+stem cell like cells and significantly raise the apoptosis in these cells as dose dependent. Conclusion HSP90 inhibitor IPI-504 can suppress the cells function of SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer and their CD44+stem cell like cells, and promote their apoptosis.

Retaspimycin Hydrochloride; heat shock protein 90; gastric cancer; CD44+stem cell like cells

黃磊，主治醫(yī)師，研究方向為胃腸疾病的外科診療。

費哲為，E-mail：zheweifei@xinhuamed.com.cn

上海市衛(wèi)生局課題(ZK2012B15)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.30.004

R735.2

A

1008-8849(2015)30-3317-04

2014-10-10

(1. Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China; 2. Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Chongming Branch, Shanghai 202150, China)