鄒金海，王艷生

(河北省滄州市中心醫(yī)院,河北 滄州 061001)

腹水CD64及外周血mCD14檢測(cè)在肝硬化合并自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎中的價(jià)值研究

鄒金海，王艷生

(河北省滄州市中心醫(yī)院,河北 滄州 061001)

目的探討肝硬化合并自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(SBP)患者腹水CD64及外周血mCD14的變化及其意義。方法選取肝硬化合并腹水患者87例，根據(jù)是否合并SBP將患者分為2組：合并SBP 44例為研究組，未合并SBP 43例為對(duì)照組，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2組患者腹水中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度、CD64指數(shù)，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、mCD14陽性表達(dá)率、mCD14平均熒光強(qiáng)度和mCD14指數(shù)。研究組抗感染治療1周后再按治療有效與無效、生存與死亡分組評(píng)價(jià)腹水中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度、CD64指數(shù)，外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度和mCD14指數(shù)。結(jié)果研究組腹水中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度、CD64指數(shù)和外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度、mCD14陽性表達(dá)率、mCD14平均熒光強(qiáng)度和mCD14指數(shù)均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。治療有效組和生存組中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度和CD64指數(shù)均明顯低于治療無效組和死亡組(P均<0.05)，淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度、mCD14平均熒光強(qiáng)度和mCD14指數(shù)均明顯高于治療無效組和死亡組(P均<0.05)。腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測(cè)對(duì)治療效果和預(yù)后判斷的ROC曲線下面積、臨界值、靈敏度和特異度均明顯高于CD64、mCD14單項(xiàng)檢測(cè)(P均<0.05)。結(jié)論肝硬化合并SBP患者腹水中性粒細(xì)胞CD64顯著增高，腹水淋巴細(xì)胞CD64與外周血mCD14顯著降低，腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測(cè)預(yù)示肝硬化合并SBP治療效果和預(yù)后的價(jià)值顯著。

腹水；CD64；mCD14；肝硬化；自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎

肝硬化患者機(jī)體免疫力低下，門靜脈高壓形成，胃腸道充血、水腫，導(dǎo)致細(xì)菌容易通過損傷腸道黏膜屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，造成自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(Spontaneous bacterial peritonitis,SBP)，但早期SBP癥狀和體征缺乏特異性，早期診治存在困難[1]。中性粒細(xì)胞CD64分子在細(xì)菌感染性疾病中顯著增高，但在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、病毒感染性疾病等疾病中變化不明顯[2]。mCD14是細(xì)菌細(xì)胞壁碎片識(shí)別受體之一，對(duì)細(xì)菌微生物免疫反應(yīng)具有重要的作用。相關(guān)研究顯示，mCD14在重癥感染性疾病中顯著減少，且與疾病病情程度顯著相關(guān)[3]。目前關(guān)于腹水CD64、外周血mCD14在肝硬化并SBP中的變化及其臨床意義報(bào)道少見，故筆者進(jìn)行了相關(guān)研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取2013年4月—2014年4月在我院治療肝硬化合并腹水患者87例，均符合《肝臟疾病預(yù)防與治療指南》中關(guān)于肝硬化、腹水的診斷標(biāo)準(zhǔn)，血清清蛋白梯度(Serum albumin gradient，SAG)和腹水清蛋白梯度(Ascites albumin gradient，AAG)均≥11g/L。排除有腹腔外感染癥狀者，繼發(fā)性腹腔感染、其他系統(tǒng)感染和有抗感染藥物應(yīng)用史者。根據(jù)臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果明確是否合并SBP，SBP診斷標(biāo)準(zhǔn)：有腹痛腹瀉、嘔吐、腹部壓痛和腸梗阻等局部腹膜炎癥狀，發(fā)熱畏寒，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增高，呼吸急促，肝功能惡化，胃腸道出血，急性腎功能損傷，休克，肝性腦病，腹水中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥250×108L-1，腹水細(xì)菌培養(yǎng)陽性， SAG/AAG≥11g/L，其中符合SAG/AAG≥11g/L，其他項(xiàng)符合至少2項(xiàng)者確診。根據(jù)是否合并SBP將患者分為2組：合并SBP 44例為研究組，男34例，女10例；年齡34～68(51.34±7.05)歲；疾病類型：乙肝病毒性肝硬化12例，丙肝病毒性肝硬化7例，酒精性肝硬化5例，乙肝病毒合并酒精性肝硬化8例，丙肝病毒合并酒精性肝硬化4例，肝硬化合并肝細(xì)胞癌3例，膽汁性肝硬化3例，隱源性肝硬化2例；肝功能Child-Pugh評(píng)分(10.28±2.01)分。未合并SBP 43例為對(duì)照組，男35例，女9例，年齡34～69(50.75±7.14)歲；疾病類型：乙肝病毒性肝硬化12例，丙肝病毒性肝硬化6例，酒精性肝硬化6例，乙肝病毒合并酒精性肝硬化7例，丙肝病毒合并酒精性肝硬化5例，肝硬化合并肝細(xì)胞癌2例，膽汁性肝硬化3例，隱源性肝硬化2例；肝功能Child-Pugh評(píng)分(10.04±1.49)分。2組患者性別、年齡、疾病類型和肝功能Child-Pugh評(píng)分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 檢測(cè)所有入選者腹水CD64和外周血mCD14水平。對(duì)于確診為SBP患者均給予抗感染藥物治療1周，1周后再按治療有效與無效、生存與死亡分組檢測(cè)上述指標(biāo)。療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[4]：局部腹膜炎癥狀和全身炎癥性癥狀逐漸緩解，腹水中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)<250×108L-1，腹水細(xì)菌培養(yǎng)陰性者評(píng)估為有效；局部腹膜炎癥狀和全身炎癥性癥狀無改善甚至惡化，腹水中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥250×108L-1，腹水細(xì)菌培養(yǎng)陽性者評(píng)估為無效。

1.3檢測(cè)方法 ①試劑與儀器：CANTO-Ⅱ流式細(xì)胞儀、Eppendorf 5810R高速冰凍離心機(jī)、CD64抗體試劑盒、紅細(xì)胞裂解液、異硫氰酸熒光素標(biāo)記性MCD14單克隆抗體、溶血素、同型免疫球蛋白由美國BD公司提供，System XT-2000i血常規(guī)儀，HITACHI7600型全自動(dòng)生化分析儀，Stago-Compact 血凝功能分析儀，Cobase411電化學(xué)發(fā)光儀。②標(biāo)本采集方法：入院治療前采集外周血，送檢血液常規(guī)、凝血功能、肝功能和腎功能等，腹腔穿刺術(shù)采集腹水，送檢10～15 mL至常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，5 mL腹水測(cè)定清蛋白水平，100 mL腹水用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，100 mL腹水行流式細(xì)胞儀測(cè)定，5 h內(nèi)完成腹水CD64測(cè)定，確診SBP患者治療1周后采集上述檢測(cè)標(biāo)本送檢。③腹水CD64檢測(cè)方法：將100 mL腹水250 g離心8 min，棄上清液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目至(1～2)×109L-1，取1 mL細(xì)胞懸浮液，采用50 μm尼龍篩網(wǎng)過濾至流式細(xì)胞專用試管中250 g離心8 min，棄上清液，100 μL細(xì)胞懸浮液加入CD64抗體20 μL，混合搖勻后室溫環(huán)境下避光染色1 h，紅細(xì)胞裂解液溶血洗滌后采用流式細(xì)胞儀測(cè)定中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度，計(jì)算CD64指數(shù)(中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度與淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度比值)。④mCD14檢測(cè)方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞膜表面mCD14，采集50 μL外周全血與10 μL mCD14抗體孵育，室溫環(huán)境下避光15 min，滴加1 mL溶血素，室溫環(huán)境下避光10 min，1 000 r/min離心操作5 min，棄上清液，滴加PBS緩沖液離心5 min，棄上清液，滴加PBS緩沖液待測(cè)，采用同型免疫球蛋白對(duì)照，流式細(xì)胞儀采集樣本，觀察mCD14陽性表達(dá)率及mCD14平均熒光強(qiáng)度,計(jì)數(shù)mCD14指數(shù)。mCD14指數(shù)=mCD14陽性表達(dá)率×mCD14平均熒光強(qiáng)度×外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)/10 000。

2 結(jié) 果

2.12組腹水中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度及CD64指數(shù)比較 研究組中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度和CD64指數(shù)均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.22組外周血mCD14陽性表達(dá)率、mCD14平均熒光強(qiáng)度、mCD14指數(shù)及白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 研究組mCD14陽性表達(dá)率、mCD14平均熒光強(qiáng)度和mCD14指數(shù)均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

2.3治療有效組和治療無效組腹水CD64、外周血mCD14比較 治療有效組中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度和CD64指數(shù)均明顯低于治療無效組，淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度、mCD14平均熒光強(qiáng)度和mCD14指數(shù)均明顯高于治療無效組(P均<0.05)。見表3。

表1 2組腹水中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度及CD64指數(shù)比較

組別nmCD14陽性表達(dá)率/%mCD14平均熒光強(qiáng)度外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)/109L-1mCD14指數(shù)研究組442.71±0.0745.62±14.074.41±1.05115.24±24.15對(duì)照組434.61±1.02127.36±15.023.71±0.09350.26±50.14t3.255.044.015.12P<0.05<0.05<0.05<0.05

2.4生存組和死亡組腹水CD64、外周血mCD14比較 生存組中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度和CD64指數(shù)均明顯低于死亡組(P均<0.05)，淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度、mCD14平均熒光強(qiáng)度和mCD14指數(shù)均明顯高于死亡組(P均<0.05)。見表4。

2.5腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測(cè)對(duì)治療效果和預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 根據(jù)ROC曲線(見圖1和圖2)，腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測(cè)對(duì)治療效果和預(yù)后的預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積(AUC)、臨界值、靈敏度和特異度均明顯高于CD64、mCD14單項(xiàng)檢測(cè)(P均<0.05)。見表5。

3 討 論

晚期肝硬化免疫力顯著降低，容易形成SBP，其中肝硬化合并脾臟功能異常者容易導(dǎo)致白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，合并細(xì)菌感染性疾病時(shí)，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)同樣減少[5],白細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)于肝硬化合并SBP診斷靈敏度和特異度均較低。此外，臨床用于細(xì)菌感染性疾病的評(píng)估指標(biāo)有外周血中性粒細(xì)胞比例、血清CRP、降鈣素原和紅細(xì)胞沉降率等，但這些指標(biāo)在急性創(chuàng)傷、外科術(shù)后、腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤等情況下均顯著增加[6]。腹水細(xì)菌培養(yǎng)是細(xì)菌感染的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但所需時(shí)間較長。CD64是免疫球蛋白IgG的Fc受體之一，是免疫球蛋白超家族成員，主要分布于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表面，呈低表達(dá)水平。機(jī)體在細(xì)菌感染等應(yīng)激性作用下，中性粒細(xì)胞CD64因子迅速升高，因此，CD64可作為細(xì)菌感染性疾病的早期診斷和評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[7]。單核細(xì)胞在重癥感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的意義。相關(guān)研究顯示，重癥胰腺炎外周血mCD14陽性表達(dá)率、mCD14平均熒光強(qiáng)度和mCD14指數(shù)表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著降低，其中存活患者上述指標(biāo)逐漸升高，而死亡患者無顯著升高傾向，說明mCD14低水平表達(dá)提示預(yù)后欠佳[8]。有研究顯示，重癥感染患者住院24h內(nèi)采集外周全血測(cè)定mCD14表達(dá)較正常人群高，由于短期內(nèi)免疫亢進(jìn)現(xiàn)象導(dǎo)致；炎癥發(fā)生24h后炎癥免疫亢進(jìn)現(xiàn)象消失，mCD14平均熒光強(qiáng)度較健康人群顯著降低[9]。

表3 治療有效組和治療無效組腹水CD64、外周血mCD14比較

表4 生存組和死亡組腹水CD64、外周血mCD14比較

表5 腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測(cè)對(duì)治療效果和預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

注：①與CD64聯(lián)合mCD14檢測(cè)比較，P<0.05。

圖1 CD64、mCD14指數(shù)對(duì)治療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖2 CD64、mCD14指數(shù)對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

本研究結(jié)果顯示，合并SBP患者中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度、CD64指數(shù)和外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高，而淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度明顯降低，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道結(jié)果具有一致性。同時(shí)，mCD14陽性表達(dá)率、mCD14平均熒光強(qiáng)度和mCD14指數(shù)明顯降低，提示肝硬化合并SBP患者處于免疫抑制狀態(tài)。本研究結(jié)果還顯示治療有效患者和生存患者腹水CD64指數(shù)顯著降低，外周血mCD14指數(shù)顯著增高，CD64、mCD14指數(shù)兩者聯(lián)合對(duì)治療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值明顯優(yōu)于單項(xiàng)檢測(cè)，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道相符 。

綜上所述，肝硬化合并SBP患者腹水中性粒細(xì)胞CD64顯著增高，腹水淋巴細(xì)胞CD64與外周血mCD14顯著降低，腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測(cè)預(yù)示肝硬化合并SBP治療效果和預(yù)后的價(jià)值顯著。

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Study on the value of combined detection of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 for hepatocirrhosis patients with spontaneous bacterial peritonitis

ZOU Jinhai, WANG Yansheng

(The Center Hospital of Cangzhou, Cangzhou 061001, Hebei, China)

Objective It is to investigate the change and significance of ascites CD64 and peripheral mCD14 for hepatocirrhosis patients with spontaneous bacterial peritonitis (SBP). Methods 87 hepatocirrhosis patients with ascites were selected and divided into two groups according to whether combined SBP, 44 cases combined SBP in research group, and 43 cases none SBP in control group. Flow cytometry was used to detect the average fluorescent intensity and index of CD64 in ascites neutrophils and lymphocytes, and the peripheral blood white blood cell count, mCD14 positive expression rate, mCD14 average fluorescence intensity and mCD14 index of the two groups. The fluorescent intensity and index of CD64 in ascites neutrophils and lymphoctesand the peripheral blood mCD14 in research group were compared according to effective and invalid, survival and death respectively. Results The neutrophils CD64 average fluorescence intensity and CD64 index of and peripheral blood leukocyte count of the research group were significantly higher than those of the control group (allP<0.05), the lymphocyte CD64 average fluorescence intensity, mCD14 positive expression rate, monocytes mCD14 average fluorescence intensity and mCD14 index were significantly lower than those of the control group (allP<0.05). The neutrophils CD64 average fluorescence intensity and CD64 index of effective treatment/survival group were significantly lower than those of ineffective/death group (allP<0.05), and lymphocyte CD64 average fluorescence intensity, monocytes mCD14 average fluorescence intensity and mCD14 index were significantly higher than those of ineffective/death group (allP<0.05). The area under the ROC curve (AUC), the critical value, sensitivity and speciality rate of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 combined detection for therapeutic effect and prognosis prediction were significantly higher than those of CD64 or mCD14 single detection (allP<0.05). Conclusion Ascites neutrophils CD64 level is significantly higher, ascites lymphocytes CD64 and peripheral blood mononuclear cells mCD14 levels is decreased significantly, the combined detection of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 has significant value in the predicts therapeutic effect and prognosis for hepatocirrhosis with SBP.

ascites; CD64; mCD14; hepatocirrhosis; spontaneous bacterial peritonitis

鄒金海，男，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事專業(yè)核醫(yī)學(xué)技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)在臨床中的應(yīng)用研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.30.006

R657.31

A

1008-8849(2015)30-3324-04

2015-03-30