汪 沛綜述，曹志中審校

0 引 言

牙周病是一種破壞牙周支持組織，導(dǎo)致牙周附著喪失的慢性炎癥破壞性疾病，是國內(nèi)外公認(rèn)口腔失牙的主要原因［1-2］。由于嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量甚至全身健康，且傳統(tǒng)方法只能抑制疾病進(jìn)展無法恢復(fù)牙周組織功能，所以牙周病治療的新方法一直為口腔學(xué)者研究的熱點(diǎn)。近年來，牙周組織工程治療牙周病的方案被初步證明具有一定效果，這是以根治牙周病并恢復(fù)牙周組織功能為目的的新方法、新思路［2-3］。

牙周組織工程治療牙周病的重點(diǎn)在于恢復(fù)牙周組織的形態(tài)與功能，其中骨再生是關(guān)鍵［2-3］。近年來，牙周組織工程中被譽(yù)為最強(qiáng)成骨生長因子——骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogenetic proteins-9，BMP9)和最佳種子細(xì)胞——牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)相繼被證實(shí)和發(fā)現(xiàn)。進(jìn)一步研究表明其誘導(dǎo)成骨分化途徑主要包含BMP-Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic proteins，Smads)和BMP-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)2 條信號通路，并且在2條信號通路的下游發(fā)現(xiàn)參與干細(xì)胞成骨分化的重要因子——Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Ostereix，Osx)活性顯著增強(qiáng)，同時(shí)表達(dá)大量成骨特異性標(biāo)志物，細(xì)胞逐漸成骨分化［4-8］。這些研究對徹底治療牙周疾病、恢復(fù)牙槽骨的形態(tài)與功能、以及闡明成骨原因、控制成骨分化的時(shí)機(jī)等有著重要的臨床和科研意義。本文就BMP9對PDLSCs在骨分化中的作用和功能的影響以及信號通路方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 牙周組織工程中BMP9 對PDLSCs成骨分化的影響

1.1 PDLSCs是牙周組織工程中最佳種子細(xì)胞PDLSCs是具有低免疫原性和多向分化潛能的異質(zhì)性多能干細(xì)胞，可以向成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞等牙周膜主要細(xì)胞分化，進(jìn)而形成牙周膜和牙槽骨，最后形成新的牙周附著結(jié)構(gòu)修復(fù)牙周缺損［2］。學(xué)者們在建立牙槽骨缺損動(dòng)物模型后，利用PDLSCs作為種子細(xì)胞的牙周組織工程復(fù)合材料修復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的牙槽缺損，證實(shí)添加PDLSCs的復(fù)合材料可顯著增強(qiáng)牙周組織的形成和修復(fù)能力［9-10］。在成骨效率方面，學(xué)者們比較了PDLSCs、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞4種牙周組織工程潛在種子細(xì)胞的骨修復(fù)效果，結(jié)果顯示PDLSCs表現(xiàn)出更強(qiáng)的堿性磷酸酶活性與鈣鹽沉積能力，這表明PDLSCs成骨能力要強(qiáng)于后兩者，并且PDLSCs還具有形成牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的能力，可以更好地進(jìn)行牙周組織修復(fù)，使得PDLSCs成為學(xué)者們在牙周組織工程的首選種子細(xì)胞［11-13］。

1.2 BMP9是牙周組織工程中合適的成骨生長因子 BMPs作為組織工程中多功能生長因子，其家族成員除BMP1以外均屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，該蛋白是可溶活性糖蛋白，一般以二聚體形式行使生物學(xué)功能。體內(nèi)外研究均證實(shí)，BMPs具有骨誘導(dǎo)作用，可參與骨骼生長、發(fā)育和創(chuàng)傷修復(fù)等過程［14-15］。該蛋白其家族雖包含眾多成員，但成骨的效果和能力存在差異，Kang等［14］在系統(tǒng)分析了已知的BMP2-15的14種BMPs成骨能力后，認(rèn)為BMP9相對于其他BMPs具有更強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力，更適合作為組織工程中成骨分化方面的首選生長因子。BMP9又稱為生長分化因子-2，由肝合成分泌并通過血液循環(huán)到達(dá)全身其他部位發(fā)揮生物學(xué)功能［16］。結(jié)構(gòu)上，二聚體BMP9由2個(gè)單體在C末端通過3對二硫鍵連接組成1個(gè)半胱氨酸結(jié)節(jié)的核心支架，每個(gè)單體的N端大臂再從該半胱氨酸核心以β折疊展開，最后形成類似蝴蝶樣構(gòu)型的整體。BMP9與家族其他成員在結(jié)構(gòu)上的差異主要表現(xiàn)為前螺旋大臂上的殘基和結(jié)合界面上的氨基酸不同，此差異是其區(qū)別于家族其他成員在受體結(jié)合種類與效率上區(qū)別的主要原因，也是BMP9高效誘導(dǎo)成骨的重要原因之一［16］。

1.3 BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化產(chǎn)生成骨標(biāo)志物 在生長因子的調(diào)控下，干細(xì)胞成骨分化并形成礦化成熟的骨基質(zhì)主要包括以下階段［17］:①成骨分化的干細(xì)胞在增殖晚期，下調(diào)細(xì)胞周期與增殖的相關(guān)基因使細(xì)胞增殖減緩，細(xì)胞由增殖期進(jìn)入分化期并開始成骨分化。分化早期細(xì)胞會(huì)分泌堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和鈣鹽結(jié)晶體至細(xì)胞外基質(zhì)中，ALP可以水解有機(jī)磷酸酶，導(dǎo)致PO43-局部升高，從而對鈣化抑制劑產(chǎn)生破壞，啟動(dòng)鈣化過程。②在細(xì)胞外基質(zhì)成熟期，Ⅰ型膠原(TypeⅠcollagen，col-Ⅰ)合成并相互交聯(lián)、成熟并進(jìn)入礦化期。礦化期細(xì)胞內(nèi)的ALP活性減弱，而與細(xì)胞外基質(zhì)中羥磷灰石沉積相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)并翻譯產(chǎn)生包括骨橋蛋白 (osteopontin，OPN)、骨鈣蛋白 (osteoclain，OCN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)等重要成骨蛋白。③OCN等非膠原蛋白分泌至細(xì)胞外基質(zhì)中，沿膠原蛋白的長軸與Ca2+、P3+結(jié)合到膠原分子側(cè)鏈的膠原氨基酸殘基上，形成羥磷灰石結(jié)晶，最后通過骨改建形成具有生理功能的骨組織［17］。Ye等［4］報(bào)道，通過重組BMP9腺病毒載體感染體外培養(yǎng)的 PDLSCs后，細(xì)胞表達(dá)的 ALP、col-Ⅰ、BSP、OPN、OCN等成骨分化標(biāo)志物分別在細(xì)胞成骨分化的早、中、晚期相對空白腺病毒對照組明顯升高，并且在細(xì)胞成骨分化的晚期出現(xiàn)鈣鹽沉積，這表明BMP9對PDLSCs具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨分化能力。

2 BMP-Smads信號通路和BMP-MAPK信號通路

2.1 BMP特異性受體(bone morphogenetic protein receptor，BMPR)BMPR是指在干細(xì)胞膜上具有Ser/Thr蛋白激酶活性的跨膜受體，該受體以二聚體行使功能。BMPR可分為BMP特異性Ⅰ型受體(BMPR-Ⅰ)和BMP特異性Ⅱ型受體 (BMPR-Ⅱ)2 類［15，18］。BMPR-Ⅰ家族包含 ALK1-7 共7 個(gè)成員，但Luo等［19］研究證明僅ALK1與ALK2突變將嚴(yán)重影響B(tài)MP9的成骨功能，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ALK1和ALK2與BMP9的氨基酸片段存在互補(bǔ)，證實(shí)ALK1和ALK2在BMP9誘導(dǎo)成骨分化中發(fā)揮重要作用。另有實(shí)驗(yàn)證明 BMPR-Ⅱ家族 4個(gè)成員(TGFβRⅡ、BMPRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB)中僅 BMPRⅡ和ActRⅡ?qū)τ贐MP9參與成骨分化發(fā)揮重要作用，為 BMP9 的特異性受體［20］。結(jié)構(gòu)上，BMPR-Ⅰ為單次跨膜的糖蛋白受體，在BMPR-Ⅰ激酶上游有一個(gè)富含Gly和Ser的GS結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中含若干磷酸化位點(diǎn)和一段保守的-Ser-Gly-Ser-Gly-，稱為GS序列，為BMPR-Ⅰ特有，并且可被BMPR-Ⅱ磷酸化激活［18］。BMPR-Ⅱ與 BMPR-Ⅰ結(jié)構(gòu)類似，但無GS結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)活性型受體，通過和配體(BMPs)結(jié)合發(fā)生自身磷酸化而被激活［18］。BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ可形成異二聚體并在BMP信號通路中起重要作用［15，18，21］。

2.2 Smads信號通路參與BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化 BMP9主要是通過經(jīng)典的BMPs-BMPRSmads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳遞信號，并發(fā)揮誘導(dǎo)成骨分化等生物學(xué)功能［5，15］。BMP9 通過與 BMPR-Ⅰ、BMPR-Ⅱ相結(jié)合形成異源三聚體使信號進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)并磷酸化激活Smads，使Smads家族相關(guān)成員行使生物學(xué)功能，將信號轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，引起相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄［19-20，22-24］。

2.2.1 Smad蛋白 Smad蛋白是將 TGF-β 超家族信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)過程中起著關(guān)鍵作用的信號通路蛋白［18］。目前為止共發(fā)現(xiàn)9個(gè)亞型，為Smad1-9，按功能不同可分為:受體活化型或通路限制性Smads(R-Smads，BMP9激活的BR-Smads主要為 Smad 1、5)、共同通路型 Smad(Co-Smad，僅有Smad4)和抑制性 Smads(I-Smads，包含 Smad 6、7)［22，24］。結(jié)構(gòu)上，Smads蛋白在 N 末端和 C 末端各有1個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，分別稱為MH1和MH2，兩者之間為富含脯氨酸的連接域［5］。MH1結(jié)構(gòu)域約130個(gè)氨基酸，只在R-Smads和Co-Smad亞家族間存在并且序列高度保守，都是由4個(gè)α螺旋，6個(gè)短β折疊和5個(gè)環(huán)等二級結(jié)構(gòu)組成球狀四級結(jié)構(gòu)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，MH1能與MH2相結(jié)合，抑制MH2的生物學(xué)活性;當(dāng) Smads蛋白激活后，可以通過MH1內(nèi)1個(gè)約11個(gè)氨基酸組成的β發(fā)夾結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合到DNA的Smad結(jié)合元件(Smad-binding element，SBE)上，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)［18，25］。MH2 結(jié)構(gòu)域存在于全部Smads中并且序列高度保守，約200個(gè)氨基酸，形成β-三明治結(jié)構(gòu)。MH2的功能主要包括與BMPR-Ⅰ相互作用，形成Smads多聚復(fù)合物，結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄共激活劑或共抑制劑。此外每個(gè)單體Smads蛋白還可以通過MH2相互作用同向疊加組成同聚體，基礎(chǔ)狀態(tài)下MH2也有抑制MH1與DNA結(jié)合的作用［18，25］。中央連接區(qū)內(nèi)有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，被磷酸化激活后可以抑制Smads蛋白的核轉(zhuǎn)移，是Smads蛋白的負(fù)調(diào)控區(qū)域［25］。

BR-Smads蛋白MH2結(jié)構(gòu)域中C末端還含有Ser-Ser-X-Ser序列(SSXSmotif)的磷酸化位點(diǎn)，可特異性與 BMPR-Ⅰ相互作用并被磷酸化［5，25］。Co-Smad的C端不含該磷酸化位點(diǎn)，不能與BMPR相互作用，但它可以通過MH2上的結(jié)合位點(diǎn)與R-Smads或I-Smads相互作用形成有功能的異源三聚體［18］。I-Smads對信號通路發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，在結(jié)構(gòu)上ISmads僅MH2區(qū)與家族其他成員具有較大的同源性，其C端缺乏磷酸化位點(diǎn)，也沒有保守的MH1功能區(qū)。功能上I-Smads與R-Smads競爭性與BMPRI結(jié)合，干擾R-Smads與BMPR-Ⅰ結(jié)合以及磷酸化，從而抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在BMP9信號通路中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用［25］。

2.2.2 BMP-Smads信號通路 目前，BMP9 通過BMP-Smads信號通路誘導(dǎo)成骨分化已得到學(xué)者們普遍認(rèn)可，該信號通路屬于激酶傳導(dǎo)系統(tǒng)，被認(rèn)為是BMPs誘導(dǎo)成骨分化的經(jīng)典信號通路［18］。在牙周組織工程中，學(xué)者們通常利用BMP9重組腺病毒(Ad-BMP9)感染PDLSCs，感染后上調(diào)基因并翻譯合成BMP9蛋白，該蛋白首先被合成為較大的前體，前體包含信號肽區(qū)、前結(jié)構(gòu)區(qū)并且在C-末端含有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基。前體的C端區(qū)域通過蛋白分解過程釋放形成BMP9單體，2個(gè)單體再通過二硫鍵相結(jié)合發(fā)生二聚，最后形成有活性功能的二聚體并被分泌出來［15］。分泌到細(xì)胞外的二聚體BMP-9會(huì)結(jié)合位于靶細(xì)胞膜上同樣以二聚體行使功能的BMPR-Ⅱ，與BMP-9結(jié)合后的BMPR-Ⅱ自身發(fā)生磷酸化而被激活，接著自身活化的BMPR-Ⅱ再磷酸化BMPR-Ⅰ的GS區(qū)，從而激活BMPR-Ⅰ，并形成受體復(fù)合物［22，25］。激活后的受體復(fù)合物作用于 BRSmads的C端的SSXS序列，磷酸化該序列的Ser而激活BR-Smads，2個(gè)磷酸化的BR-Smads與Co-Smad結(jié)合形成功能性異源三聚體復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到核中與SBE或環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)等DNA轉(zhuǎn)錄因子相互作用，表達(dá)產(chǎn)生Runx2和Osx等重要成骨轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化［22，24］。

2.3 MAPK信號通路參與BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化 MAPK屬于Ser/Thr蛋白激酶，分布于細(xì)胞胞漿，是通過保守的三級級聯(lián)反應(yīng)［MAPKKK-MAPKK-MAPK］將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)的重要信號通路因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、增殖、分化、凋亡等一系列基本生命活動(dòng)，MAPK主要包括胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)家族、c-Jun N 端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)家族、P38 蛋白激酶(p38MAPK，p38)家族［4，6，26］。早前的實(shí)驗(yàn)中已有學(xué)者證實(shí)p38和ERK1/2參與BMPs家族信號通路，并能促進(jìn)成骨基因的表達(dá)以及活體內(nèi)骨再生［15，21，26-27］。最近，在牙周組織工程中，Ye 等［13］也已證實(shí)BMP9對PDLSCs誘導(dǎo)成骨分化的信號通路包含p38和ERK1/2途徑。

2.3.1 P38和BMP-p38信號通路 P38是由360個(gè)氨基酸組成的相對分子質(zhì)量約為38000的蛋白質(zhì)，屬應(yīng)激激活蛋白酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、炎癥、凋亡和應(yīng)力刺激應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用［4，6，26，28］。目前為止，p38家族共發(fā)現(xiàn) 4種亞型:p38α，p38β，p38γ(ERK6，SAPK3)和 p38δ (SAPK4)，其中，p38α 和p38β表達(dá)在所有組織器官中，而p38γ和p38δ只表達(dá)于特定組織器官［26］。Greenblatt等［27］利用小鼠活體實(shí)驗(yàn)，敲除 MKK3，MKK6，p38α，p38β 后發(fā)現(xiàn)小鼠成骨缺陷，并且發(fā)現(xiàn)MKKK家族成員TGF-β-激活激酶1(TGF-β-activated kinase1，TAK1)是 p38促進(jìn)成骨分化關(guān)鍵的上游因子，并認(rèn)為 TAK1-MKK3/6-p38-Runx2是維持骨發(fā)生與骨平衡的重要通路。Ye等［4］通過 BMP-9重組腺病毒(Ad-BMP9)感染PDLSCs后發(fā)現(xiàn)p38與MKK3/6總蛋白表達(dá)均無顯著變化，但兩者的磷酸化水平明顯升高，這說明BMP9作用下MKK3/6-p38信號通路被激活。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，Ye等［4］發(fā)現(xiàn)在加入p38抑制劑后的第7-21天，ALP、OPN、OCN等的基因及蛋白表達(dá)水平和鈣鹽沉積量均有不同程度的下降，證明p38MAPK信號通路在BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化過程中起重要作用。

目前BMP-9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化的p38信號通路尚不完全清楚，根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果學(xué)者們普遍認(rèn)可如下觀點(diǎn):BMP-9激活BMPR并與之相互作用形成受體復(fù)合物，激活后的BMPR通過TAK1銜接蛋白1與TAK1間接結(jié)合，磷酸化激活 TAK1，TAK1再激活并磷酸化MKK3/6，MKK3/6可以激活并磷酸化p38α/β，p38被激活后進(jìn)入細(xì)胞核磷酸化激活Runx2，并與之協(xié)同共激活CREB結(jié)合蛋白上調(diào)相關(guān)成骨基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化［5-7，26］。

2.3.2 ERK1/2和 BMP-ERK1/2信號通路 人類ERK1/2包括含379個(gè)氨基酸相對分子質(zhì)量為44000的ERK1和含360個(gè)氨基酸相對分子質(zhì)量為42000的ERK2的2種異構(gòu)體，其同源性超過80%，兩者功能相似，在所有組織都有不同程度表達(dá)［6］。ERK1/2可在胞質(zhì)內(nèi)調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)，也可以進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)某些基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)［4，6，21，23］。由 ERK1/2 參與傳遞信號的通路為經(jīng)典MAPK信號通路，可被生長因子、細(xì)胞因子、病毒、癌基因等多種刺激激活［33］。在牙周組織工程領(lǐng)域，包括應(yīng)力刺激、電磁場、生長因子等誘導(dǎo)種子細(xì)胞成骨分化的研究中均發(fā)現(xiàn)有ERK1/2通路參與其中并發(fā)揮重要作用［4，6，21，29-30］。Ye 等［4］在BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化的研究中阻斷ERK1/2通路后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的成骨能力明顯下降，證明ERK1/2信號通路在BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化方面發(fā)揮重要作用。

ERK1/2通路發(fā)現(xiàn)較早，目前研究比較透徹，該通路通過膜結(jié)合型的GTP/GDP蛋白——Ras蛋白(又稱:大鼠肉瘤蛋白，rat sarcoma，Ras)、MAPKKK家族的Raf蛋白激酶和MAPKK家族的MAPK-ERK激酶 1/2(MAP kinase-ERK kinase1/2，MEK1/2)以及ERK1/2傳遞信號。當(dāng)BMP-9作用于細(xì)胞膜后會(huì)激活BMPR并形成激活的受體復(fù)合物，將信號由胞外傳遞至胞內(nèi)的同時(shí)使小分子鳥苷酸結(jié)合蛋白R(shí)as的 GDP 解離而結(jié)合 GTP，激活 Ras［6］。激活的Ras發(fā)生膜轉(zhuǎn)位并與絲/蘇氨酸蛋白激酶Raf的氨基端結(jié)合，激活Raf。Raf蛋白是蛋白質(zhì)酪氨酸激酶受體信號傳導(dǎo)的中心，具有Ser/Thr蛋白激酶活性，可磷酸化 MEK1/2的 Ser/Thr，從而激活 MEK1/2［6，23］。MEK1/2 為雙特異性激酶，可以使 Ser/Thr和Typ發(fā)生磷酸化，激活ERK1/2，激活后的ERK1/2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)而磷酸化激活如Runx2和Osx等成骨轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化［4，6，21，23］。

3 BMP9 信號通路下游的成骨轉(zhuǎn)錄因子

3.1 Runx2是信號通路下游的重要成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx是一類由α和β亞單位構(gòu)成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子蛋白的統(tǒng)稱，其分子結(jié)構(gòu)特征是包含一段被稱為Runt結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合區(qū)，該段結(jié)合域與果蠅分節(jié)基因Runt同源，由128個(gè)保守的氨基酸序列組成［31］。Runxs家族成員 Runx2，是一種能夠上調(diào)多種成骨基因的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞成骨分化、骨發(fā)育方面起重要作用［32］。在結(jié)構(gòu)上Runx2主要包含1個(gè)Runt結(jié)構(gòu)域、3個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(AD)、1個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)(RD)、1個(gè)短的Myc相關(guān)核定位信號區(qū)(NLS)［31］。Runt結(jié)構(gòu)域可以特異性識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)的成骨細(xì)胞特異性順式作用元件2，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。3個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)中，AD1和AD2位于N端，為Runx2所獨(dú)有，并在核心定位中發(fā)揮作用［31-32］。AD3為 Runx2主要激活區(qū)，它位于Runx2分子的C端富含Pro、Ser、Thr結(jié)構(gòu)域(PST)的N末端部分，可以與Smads或MAPKs等發(fā)生相互作用，RD位于PST結(jié)構(gòu)域C端，起轉(zhuǎn)錄抑制作用［31］。在Runt結(jié)構(gòu)域與PST結(jié)構(gòu)域N端連接重合處的9個(gè)氨基酸序列，是核定位信號序列(nuclear localization signal，NLS)，作用是幫助親核蛋白進(jìn)入細(xì)胞核［31，33］。在PST的C端存在一個(gè)核基質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號結(jié)合位點(diǎn)，該區(qū)域可被BMP9-Smads復(fù)合物或BMP9-MAPK復(fù)合物等特異性識(shí)別并可將Runx2定位在核內(nèi)特定區(qū)域，調(diào)控成骨特異性基因轉(zhuǎn)錄，若該區(qū)域發(fā)生突變，則影響細(xì)胞成骨分化以及骨發(fā)育缺陷［33］。多項(xiàng)研究表明BMP9作為Runx2的上游調(diào)控因子，可以通過Smad信號通路和MAPK信號通路使 Runx2基因表達(dá)上調(diào)，或直接磷酸化激活Runx2蛋白，調(diào)控相關(guān)成骨基因表達(dá)，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié) PDLSCs 成骨分化［4，7，15，21］。

3.2 OSX是信號通路下游的重要成骨轉(zhuǎn)錄因子Osx是一種含有鋅指基序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于Sp(special protein)家族，對細(xì)胞成骨分化和骨形成過程起關(guān)鍵作用。Osx的 C末端存在3個(gè)連續(xù)的Cys2-His2鋅指基序結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可與真核細(xì)胞雙鏈DNA的 G/C豐富區(qū)特異性結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄［34］。目前研究證實(shí)Osx只在骨組織細(xì)胞中表達(dá)，在干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中起決定性作用，沒有Osx就沒有骨形成和骨再生［35］。作為成骨途徑下游的轉(zhuǎn)錄因子，Liu等［8］研究證實(shí)BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化過程中會(huì)產(chǎn)生Osx，Mandal等［36］研究證實(shí)BMP家族成員可以通過Smads信號通路對Osx進(jìn)行調(diào)控，趙艷紅等［37］研究表明BMP家族成員誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞成骨分化過程中通過p38信號通路可激活調(diào)控 Osx，Choi等［38］則證實(shí) ERK1/2信號通路參與對Osx的調(diào)控。目前暫無具體研究證明BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化信號通路的下游產(chǎn)生Osx，但早前的研究證實(shí)Osx作為Runx2的下游因子，接受Runx2的調(diào)控激活，結(jié)合Ye等［4］的研究結(jié)論(BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化并在信號通路下游產(chǎn)生Runx2)可推理:BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化信號通路的下游產(chǎn)生Runx2和Osx。Osx的表達(dá)也可以加強(qiáng)Runx2的活性，兩者協(xié)同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 OCN、OPN、BSP等成骨標(biāo)志物并在骨成熟過程中發(fā)揮重要作用［39］。

4 結(jié) 語

在牙周組織工程中，PDLSCs因具有顯著增強(qiáng)牙周組織的形成和修復(fù)的能力，被認(rèn)為是牙周組織工程最佳種子細(xì)胞。BMP9作為BMPs家族最強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的生長因子，通過與PDLSCs相互作用并誘導(dǎo)其成骨分化，可在牙周組織修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用并具有良好的臨床應(yīng)用前景。本文分析了BMP9誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的2條重要途徑——BMPSmads信號通路和BMP-MAPK信號通路，但是其他信號通路的作用以及各信號通路之間的聯(lián)系仍然不甚明了，有待更進(jìn)一步的研究證明。此外，相對于臨床上已經(jīng)應(yīng)用的BMP2和BMP7，BMP9的臨床安全性有待更深一步研究。

［1］ 曹采方.對牙周病和齲齒患病率的思考--如何解讀第三次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查的資料［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2013，48(5):257-259.

［2］ Chamila Prageeth Pandula PK，Samaranayake LP，Jin LJ，et al.Periodontal ligament stem cells:an update and perspectives［J］.J Investig Clin Dent，2014，5(2):81-90.

［3］ 蘇 寒，張森林，董 震.組織工程化引導(dǎo)骨再生膜的構(gòu)建及其修復(fù)牙槽骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(9):932-936.

［4］ Ye G，Li CH，Xiang XR，et al.Bone Morphogenetic Protein-9 Induces PDLSCs Osteogenic Differentiation through the ERK and p38 Signal Pathways［J］.Int J Med Sci，2014，11(10):1065-1072.

［5］ Derynck R，Zhang YE.Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signaling［J］.Nature，2003，425(6958):577-584.

［6］ 陳臨溪，李蘭芳，王 毅.細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)藥理與臨床［M］.第一版.北京:人民軍醫(yī)出版社，2014:17-37.

［7］ Chen GQ，Deng CX，Li YP.TGF-β and BMP Signaling in Osteoblast Differentiation and Bone Formation［J］.Int J Biol Sci，2012，8(2):272-288.

［8］ Liu C，Weng YG，Yuan TX，et al.CXCL12/CXCR4 signal axis plays an important role in mediating bone morphogenetic protein 9-induced osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells［J］.Int J Med Sci，2013，10(9):1181-1192.

［9］ Iwasaki K，Komaki M，Yokoyama N，et al.Periodontal Regeneration Using PeriodontalLigament Stem Cell-Transferred Amnion［J］.Tissue Eng Part A，2014，20(3-4):693-704.

［10］ Su F，Liu SS，Ma JL，et al.Enhancement of periodontal tissue regeneration by transplantation of osteoprotegerin-engineered periodontal ligament stem cells［J］.Stem Cell Res Ther，2015，6(1):22-36.

［11］ Yu BH，Zhou Q，Wang ZL.Periodontal ligament versus bone marrow mesenchymal stem cells in combination with Bio-Oss scaffolds for ectopic and in situ bone formation:A comparative study in the rat［J］.J Biomater Appl，2014，29(2):243-253.

［12］ Liu L，Ling JQ，Wei X，et al.Stem cell regulatory gene expression in human adult dental pulp and periodontal ligament cells undergoing odontogenic/osteogenicdifferentiation［J］.J Endod，2009，35(10):1368-1376.

［13］ 陳 嵩，呂蘭欣，黃寧平，等.人牙齦成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(9):925-927.

［14］ Kang Q，Sun MH，Cheng H，et al.Characterization of the distinct orthotopic bone-forming activity of 14 BMPs using recombinant adenovirus-mediated gene delivery［J］.Gene Ther，2004，11(17):1312-1320.

［15］ Lamplot JD，Qin JQ，Nan GX，et al.BMP9 signaling in stem cell differentiation andosteogenesis［J］.Am J Stem Cell，2013，2(1):1-21.

［16］ Mi LZ，Brown CT，Gao YJ，et al.Structure of bone morphogenetic protein 9 procomplex［J］.Proc Natl AcadSci USA，2015，112(12):3710-3715.

［17］ Alford AI，Kozloff KM，Hankenson KD.Extracellular matrix networks in bone remodeling［J］.Int J Biochem Cell Biol，2015，5(2015):46201-46212.

［18］ Shi YG，Massagué J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus［J］.Cell，2003，113(6):685-700.

［19］ Luo JY，Tang M，Huang JY，et al.TGFbeta/BMP type Ireceptors ALK1 and ALK2 are essential forBMP9-induced osteogenic signaling in mesenchymal stem cells［J］.J BiolChem，2010，285(38):29588-29598.

［20］ Wu NN，Zhao YZ，Yin YB，et al.Identification and analysis of type II TGF-β receptors in BMP-9-induced osteogenic differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells［J］.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2010，42(10):699-708.

［21］ Zhao YZ，Song T，Wang WJ，et al.P38 and ERK1/2 MAPKs act in opposition to regulate BMP9-induced osteogenic differentiation of mesenchymal progenitor cells［J］.PLoS One，2012，7(8):e43383-e43395.

［22］ Miyazono K，Kamiya Y，Morikawa M.Bone morphogenetic protein receptors and signal transduction［J］.J Biochem，2010，147(1):35-51.

［23］ Xu DJ，Zhao YZ，Wang J，et al.Smads，p38 and ERK1/2 are involved in BMP9-induced osteogenic differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells［J］.BMB Rep，2012，45(4):247-252.

［24］ Lopez-Coviella I，Mellott TM，Kovacheva VP，et al.Developmental pattern of expression of BMP receptors and Smads and activation of Smad1 and Smad5 by BMP9 in mouse basal forebrain［J］.Brain Res，2006，1088(1):49-56.

［25］ Macias MJ，Martin-Malpartida P，Massagué J.Structural determinants of Smad function in TGF-β signaling［J］.Trends Biochem Sci，2015，40(6):296-308.

［26］ Zarubin T，Han JH.Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway［J］.Cell Res，2005，15(1):11-18.

［27］ Greenblatt MB，Shim JH，Zou WG，et al.The p38 MAPK pathway is essential for skeletogenesis and bone homeostasis in mice［J］.J Clin Invest，2010，120(7):2457-2473.

［28］ Cook BD，Evans T.BMP signaling balances murine myeloid potential through SMAD-independent p38MAPK and NOTCH pathways［J］.Blood，2014，124(3):393-402.

［29］ Ren DP，Wei FL，Hu LH，et al.Phosphorylation of Runx2，induced by cyclic mechanical tension via ERK1/2 pathway，contributes to osteodifferentiation of human periodontal ligament fibroblasts［J］.J Cell Physiol，2015，230(10):2426-2436.

［30］ Song MY，Zhao DM，Wei S，et al.The effect of electromagnetic fields on the proliferation and the osteogenic or adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells modulated by dexamethasone［J］.Bioelectromagnetics，2014，35(7):479-490.

［31］ Yoshiaki I.Oncogenic potential of the RUNX gene family:'overview'［J］.Oncogene，2004，23(24):4198-4208.

［32］ Carbonare LD，Innamorati G，Valenti MT.Transcription factor Runx2 and its application to bone tissue engineering［J］.Stem Cell Rev，2012，8(3):891-897.

［33］ Zaidi SK，Sullivan AJ，Van Wijnen AJ，et al.Integration of Runx and Smad regulatory signals at transcriptionally active subnuclearsites［J］.Proc Natl AcadSci USA，2002，99(12):8048-8053.

［34］ Peng YY，Shi KK，Wang LT，et al.Characterization of Osterix protein stability and physiological role in osteoblast differentiation［J］.PLoS One，2013，8(2):e56451-e56458.

［35］ Zhang C.Transcriptional regulation of bone formation by the osteoblast-specific transcription factor Osx［J］.J Orthop Surg Res，2010，1(5):37-43.

［36］ Mandal CC，Drissi H，Choudhury GG，et al.Integration of phosphatidylinositol 3-kinase，Akt kinase，and Smad signaling pathway in BMP-2-induced osterix expression［J］.Calcif Tissue Int，2010，87(6):533-540.

［37］ 趙艷紅，李洪發(fā)，楊 強(qiáng)，等.人重組骨形成蛋白2作用下人牙周膜細(xì)胞Osterix的表達(dá)變化［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2013，93(14):1104-1108.

［38］ Choi YH，Gu YM，Oh JW，et al.Osterix is regulated by Erk1/2 during osteoblast differentiation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，415(3):472-478.

［39］ Artigas N，Ure?a C，Rodríguez-Carballo E，et al.Mitogen-activated protein kinase(MAPK)-regulated interactions between Osterix and Runx2 are critical for the transcriptional osteogenic program［J］.J Biol Chem.2014，289(39):27105-27117.