田秀榮，郭麗，高兵，劉健

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院1.細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室；2.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng) 110034）

改良溴化乙錠染色法快速檢測(cè)基因組DNA

田秀榮1，郭麗2，高兵1，劉健1

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院1.細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室；2.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng) 110034）

目的探討一種耗時(shí)少、檢出率高的基因組DNA檢測(cè)方法。方法采用改良的溴化乙錠染色法檢測(cè)提取到的樣本基因組DNA。采用分光光度儀進(jìn)行敏感性驗(yàn)證，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)確認(rèn)該方法能否用來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。結(jié)果改良的溴化乙錠染色法顯著減少基因組DNA的上樣量，提高基因組DNA的檢測(cè)敏感性，節(jié)省操作時(shí)間，無(wú)需loading buffer，并可粗略估計(jì)基因組DNA濃度。結(jié)論改良的溴化乙錠染色法只適用于初篩樣本基因組DNA，不能用于評(píng)估DNA片段的長(zhǎng)度。

瓊脂糖凝膠電泳法；基因組DNA；溴化乙錠

基因組DNA提取被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)的許多領(lǐng)域［1］。2003年人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，為人類(lèi)利用基因組DNA遺傳密碼破解疾病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)［2］。成百上千例樣本的病例-對(duì)照研究越來(lái)越多的被用于篩選疾病相關(guān)候選基因及其變異位點(diǎn)和在基因水平闡明疾病的發(fā)病機(jī)制。這些研究中需要先期進(jìn)行大規(guī)模的樣本基因組DNA提取和檢測(cè)工作。

長(zhǎng)期以來(lái)，基因組DNA提取后的檢測(cè)是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳/溴化乙錠染色法進(jìn)行觀(guān)察［3～5］。這種方法在基因組DNA樣本檢測(cè)的時(shí)候，需要樣本DNA的上樣量較大。在微量DNA上樣時(shí)或提取的基因組DNA含量低時(shí)，敏感性差，不易觀(guān)察到陽(yáng)性結(jié)果。此外，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法用于檢測(cè)大批量樣本基因組DNA時(shí)，顯得有些費(fèi)時(shí)、費(fèi)材、費(fèi)力。

考慮到瓊脂糖凝膠電泳/溴化乙錠染色的這些缺點(diǎn)，本研究介紹了一種改良的溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色法（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“改良法”），該方法可以快速初篩樣本基因組DNA。

1 材料與方法

1.1 樣本及基因組DNA提取

本研究經(jīng)沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)委員會(huì)同意，遵守知情同意原則，從沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院門(mén)診采集161例正常人末梢靜脈血液樣本。血液經(jīng)EDTA抗凝后，保存于-20℃冰箱。采用Blood Genome DNA Extraction試劑盒（D9081，TaKaRa公司）提取樣本的全血基因組DNA，所有操作按照試劑盒提供的操作流程進(jìn)行。取100 μL全血，加入GenTLE Solution 1破壞血細(xì)胞，同時(shí)與核酸形成電中性的復(fù)合體，Gen-TLE Solution 2清洗，GenTLE Solution 3分離基因組DNA，用異丙醇回收DNA沉淀。

1.2 改良的溴化乙錠染色檢測(cè)基因組DNA

剪切適當(dāng)大小的PARAFILM?“M”封口膜，按照檢測(cè)樣本數(shù)在封口膜上間隔適當(dāng)間距均勻點(diǎn)樣2 μL 0.5 μg/mL EB，分別吸取2 μL待檢DNA樣本與封口膜上EB充分混合，室溫下靜置2～3 min，將封口膜置于暗箱式雙光紫外儀下觀(guān)察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。DNA與EB混合呈棕黃色斑點(diǎn)，無(wú)DNA的斑點(diǎn)呈無(wú)色透明。

1.3 敏感性驗(yàn)證

提取的樣本基因組DNA用分光光度儀進(jìn)行濃度檢測(cè)，用CDNA表示DNA濃度，DNA純度Ratio值為A260/A280比值。取5 μL樣本基因組DNA依次進(jìn)行2×、4×、8×、16×和32×的倍比稀釋。用改良法和傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測(cè)法依次進(jìn)行檢測(cè)，改良法基因組點(diǎn)樣量為2 μL，凝膠電泳法每孔上樣量為5 μL。瓊脂糖凝膠電泳法實(shí)驗(yàn)步驟概括如下，配制1%瓊脂糖凝膠塊（含0.5 μg/mL EB），將5 μL基因組DNA與1 μL 6×loading buffer充分混合后上樣。100 V電泳30 min，暗箱式雙光紫外儀下觀(guān)察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

為確認(rèn)改良的EB染色法能否用來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，隨機(jī)選取10例DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。應(yīng)用TaKaRa Taq酶（DR001A，TaKaRa公司），擴(kuò)增β -actin基因片段，正向引物為5′-TCGTGCGTGACATT AAGGAG-3′；反向引物為5′-AGCACTGTGTTGGC GTACAG-3′，產(chǎn)物為369 bp。反應(yīng)條件：96℃，1 min；30個(gè)循環(huán)的94℃30 s，60℃30 s和72℃60 s；72℃2 min。反應(yīng)體系為25 μL。PCR反應(yīng)產(chǎn)物分別與單獨(dú)加入的dNTP組、DNA模板組、引物組進(jìn)行比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包，瓊脂糖凝膠電泳/ EB染色法和改良EB染色法的DNA檢出率的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 改良EB染色法檢測(cè)基因組DNA

經(jīng)分光光度儀檢測(cè)待測(cè)DNA的A260為0.19，CDNA為7.06 ng/μL，Ratio為1.865。在紫外儀下EB與基因組DNA按1∶1混合后與單一DNA組、EB組及滅菌蒸餾水組比較，其熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，肉眼即可清晰分辨，見(jiàn)圖1。

圖1 改良法檢測(cè)基因組DNAFig.1 An improved method to detect genomic DNA

2.2 檢測(cè)敏感性比較

通過(guò)倍比稀釋?zhuān)容^2種基因組檢測(cè)方法的檢測(cè)敏感度。結(jié)果顯示，凝膠電泳法在基因組DNA在經(jīng)8倍稀釋后就幾乎看不到熒光，而改良法在基因組原液稀釋16倍后仍可觀(guān)察到較明顯的熒光，見(jiàn)圖2。

圖2 改良法和電泳法檢測(cè)稀釋的基因組DNA結(jié)果Fig.2 Comparison of the results from the improved method and electrophoresis method for the dilution of genome DNA detection

2.3 改良EB染色法和凝膠電泳法檢測(cè)樣本基因組DNA

進(jìn)一步通過(guò)2種檢測(cè)法檢測(cè)161例新提出樣本的基因組DNA，改良法共檢出106個(gè)樣本，傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳法檢出65個(gè)樣本（表1，圖3）。結(jié)果表明改良法的樣本檢出率明顯高于凝膠電泳法（P＜0.001），說(shuō)明2種方法在檢出敏感性上具有顯著的差異。

用傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)基因組，一般的制膠板制作的膠要少于20孔，1次電泳檢測(cè)的樣本數(shù)要低于20個(gè)，而改良法1次可檢測(cè)50個(gè)樣本。分別用這2種方法檢測(cè)同一基因組DNA。結(jié)果顯示：改良法與傳統(tǒng)凝膠電泳法檢測(cè)DNA，2種方法的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

2.3 操作時(shí)間比較

凝膠電泳法檢測(cè)分為配膠、制膠、上樣、電泳、觀(guān)察幾個(gè)步驟，配膠制膠用時(shí)需1 h，上樣時(shí)間與樣本數(shù)有關(guān)，每個(gè)樣本的平均上樣時(shí)間約1 min，電泳30 min，總用時(shí)約90 min。改良法直接將基因組DNA與EB混合，無(wú)需將基因組DNA與loading buffer混合，僅需要點(diǎn)樣時(shí)間即可。因此要檢測(cè)同樣數(shù)量的樣本，改良法比凝膠電泳法要少用時(shí)90 min。

表1 改良法和電泳法檢測(cè)161例樣本基因組DNA結(jié)果Tab.1 Detection of 161 cases of genomic DNA samples using improved method and electrophoretic method

圖3 改良法和電泳法檢測(cè)基因組DNA檢測(cè)結(jié)果對(duì)照Fig.3 Comparison of genome DNA detection by improved method and electrophoretic method

2.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

10例DNA樣本的β-actin基因片段被擴(kuò)增，用“改良法”進(jìn)行檢測(cè)，與單獨(dú)加入dNTP組、DNA模板組、引物組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，斑點(diǎn)均呈現(xiàn)棕黃色。

3 討論

研究疾病的發(fā)生與致病基因及其相關(guān)變異并在此基礎(chǔ)上闡明疾病的機(jī)制一直是研究人員努力的方向。目前，包括癌癥、心血管疾病、精神疾病、高血壓和糖尿病在內(nèi)的各種復(fù)雜疾病的基因組學(xué)研究都全面展開(kāi)［6～8］。在這些研究中均需要進(jìn)行大樣本基因組DNA的基礎(chǔ)提取和檢測(cè)工作。本研究首次介紹了一種高敏感度的快速檢測(cè)基因組DNA的方法。該方法在DNA的上樣量、敏感性、檢測(cè)時(shí)間和使用材料上都具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。

基因組DNA的提取受樣本條件、提取方法和操作技術(shù)的影響，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)提取失敗或只提取了少量DNA的情況，因此需要對(duì)提取后的DNA進(jìn)行檢測(cè)，以確保下一步實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。目前廣泛使用的是傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度儀法。瓊脂糖凝膠電泳法在檢測(cè)大批量樣本時(shí)，因需要制膠、上樣及電泳過(guò)程而耗費(fèi)一定的人力和時(shí)間。DNA上樣量較大，存在DNA浪費(fèi)情況，不適用于稀少樣本的DNA檢測(cè)。為避免電泳過(guò)程中DNA損失，DNA樣品上樣時(shí)需與loading buffer進(jìn)行混合。此外，電泳后DNA條帶的敏感性差，微量DNA上樣時(shí)更不易觀(guān)察結(jié)果。分光光度儀法是檢測(cè)DNA濃度的常用方法，但有時(shí)受到儀器性能的限制，待檢測(cè)DNA樣本的原始用量較大、操作繁瑣、易出現(xiàn)誤差。DNA量不足時(shí)，吸光度檢測(cè)結(jié)果不可信。因此，盡管以上方法被廣泛應(yīng)用于研究領(lǐng)域，但還存在一定的弊端。

本研究提出的“改良EB染色法”在一定程度上解決了前述方法的一些弊端。首先，顯著提高了DNA檢測(cè)敏感度，較低濃度的DNA也可被檢出，同時(shí)本方法也可根據(jù)斑點(diǎn)亮度來(lái)初步估計(jì)DNA量的多少。其次，因本方法敏感度高，可減少DNA樣本的上樣量，節(jié)省了樣本，尤其在稀有DNA樣本的處理中更具有意義。本研究中，改良法的基因組用量?jī)H2 μL即可觀(guān)察到斑點(diǎn)顏色改變。第三，操作簡(jiǎn)便省時(shí)，節(jié)省實(shí)驗(yàn)用品。20個(gè)樣本瓊脂糖凝膠電泳約需要2 h；而本方法僅需要2～3 min即可，節(jié)省操作時(shí)間。另外，在實(shí)驗(yàn)的用材方面改良法只需少量的封口膜和0.5 μg/mL EB一種溶液，從而大幅度簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序，降低了實(shí)驗(yàn)成本。

本方法在使用中也具有一定的局限性。因其不能評(píng)估DNA片段長(zhǎng)度，因此更適用于基因組DNA提取后的初步篩檢和對(duì)基因組DNA濃度的粗略估測(cè)，不適合用于驗(yàn)證PCR結(jié)果。本方法可與瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度儀法協(xié)同使用，在精確檢測(cè)的基礎(chǔ)上，將更加快速、簡(jiǎn)便。

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［3］朱英，陶剛，劉作易，等.瓊脂糖凝膠電泳操作中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，32（6）：27-28.

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（編輯 于 溪）

An Improved Ethidium Bromide Staining Method for Rapid Detection ofGenomic DNA

TIAN Xiu-rong1，GUOLi2，GAOBing1，LIUJian1

（1.Cell Biology and Genetics Department of Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Science Experiment Center of Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China）

Objective To explore a genome DNA detection method with less time-consuming and high detection rate.MethodsGenomic DNA samples were extracted and detected with improved ethidium bromide staining method.The sensitivity was verified with spectrophotometer meter. Polymerase chain reaction was used to confirm whether the method was available for detecting the PCR product.ResultsThe improved ethidium bromide staining method significantly reduced the quantity of genomic DNA sample applied to gel，improved the detection sensitivity of genomic DNA and saved operating time with no need for loading buffer.In addition，it can roughly estimate the concentration of genomic DNA.ConclusionThe improved ethidium bromide staining method can be applied to screening genomic DNA sample，but it cannot assess the length of DNA fragments.

agarose gel electrophoresis；genomic DNA；ethidium bromide

O657

B

0258-4646（2015）11-0999-03

田秀榮（1963-），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，大專(zhuān). E-mail：tianxiurong2008@163.com

2015-01-26

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